植物次生物质对斜纹夜蛾解毒酶活性的影响

为研究植食性昆虫进食植物次生物质后的解毒机制,本研究用不同浓度的单宁、芦丁及没食子酸3种植物次生物质分别喂食斜纹夜蛾五龄幼虫,检测喂食后幼虫中肠以及脂肪体相关解毒酶活性以及基因表达的变化。结果发现,取食0.5%单宁以及1%没食子酸后,斜纹夜蛾中肠和脂肪体中羧酸酯酶(Car E)、乙酰胆碱酯酶(Ach E)以及谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性呈不同程度的增加;喂食0.2%芦丁后Car E活性和GST活性上升,Ach E活性没有显著增加。实时荧光定量PCR的结果显示,斜纹夜蛾喂食0.5%单宁以及1%没食子酸后,解毒酶相关基因Sl GSTe1、Sl Car E和Sl Ace1表达上调,喂食0.2%芦丁后Sl GSTe1和Sl Car E显著表达。上述结果表明,GST等解毒酶活性和相关基因的表达与不同类型的次生物质相关,共同参与了斜纹夜蛾对外源次生物质的解毒代谢。     

Sli-miR-34-5p响应植物次生物质正调控斜纹夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因SlGSTe1的表达

【目的】昆虫解毒酶系统是昆虫适应植物次生物质的主要机制,研究调控解毒酶基因表达的mi RNA将发现可用于害虫防治的靶标分子。本研究旨在探究Sli-miR-34-5p对斜纹夜蛾Spodopteralitura中应对植物次生物质的解毒酶谷胱甘肽S-转移酶(GST)基因的调控作用。【方法】通过实时荧光定量PCR检测Sli-miR-34-5p在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫进食芥菜Brassica juncea后中肠中的表达;在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫体内及细胞株中超表达Sli-miR-34-5p模拟体类似物(mimics)或抑制剂(inhibitors),采用实时荧光定量PCR和Western blot分析Sli-miR-34-5p已知或推测的靶基因的表达变化;利用双荧光素酶报告系统验证Sli-miR-34-5p对靶标基因的表达调控作用;采用生物信息学方法预测Sli-miR-34-5p可能的靶基因,以了解其可能的作用机理。【结果】结果表明,Sli-mi R-34-5p在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫进食芥菜24和48 h时的中肠中表达显著上调。在斜纹夜蛾5龄第1天幼虫血淋巴中超表达Sli-miR-34-5p mimic,进食芥菜的斜纹夜蛾中SlGSTe1转录上调;反之,超表达Sli-miR-34-5p inhibitor,SlGSTE1蛋白水平显著下调。在斜纹夜蛾Spli-221细胞株中添加芥菜次生物质吲哚-3-甲醇(I3C),Sli-miR-34-5p和SlGSTe1的表达量均呈现上调的趋势;此外,在细胞中转染Sli-miR-34-5p mimic,SlGSTe1的表达水平明显上调。然而,生物信息学预测和双荧光素酶报告系统检测结果显示,Sli-miR-34-5p并不直接作用于靶基因Sl GSTe1。【结论】研究结果提示Sli-miR-34-5p通过促进斜纹夜蛾谷胱甘肽S-转移酶基因Sl GSTe1的表达而参与斜纹夜蛾应对植物次生物质的胁迫。     

甜菜夜蛾肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA的克隆及功能鉴定

【目的】本研究旨在阐明甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫体内肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition protein, PGRP)在响应苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)感染过程中的功能。【方法】利用PCR方法扩增甜菜夜蛾幼虫肽聚糖识别蛋白基因SePGRP-SA全长cDNA;采用qRT-PCR分析SePGRP-SA在甜菜夜蛾不同发育阶段(卵、1-5龄幼虫、预蛹和蛹)及4龄幼虫不同组织(中肠、马氏管、围食膜、脂肪体、血淋巴和表皮)中的表达。通过RNAi技术沉默SePGRP-SA基因72 h后,qRT-PCR检测SePGRP-SA沉默效率及甜菜夜蛾4龄幼虫中肠抗菌肽相关基因(Ceropin, Attacin和Defensin)和细菌载量的变化。RNAi沉默SePGRP-SA 24 h后,以苏云金芽胞杆菌菌株Bt-GS57饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫0, 24, 48, 72, 96和120 h,计算幼虫校正死亡率;饲喂甜菜夜蛾4龄幼虫Bt-GS57后0, 24, 48和72 h,利用qRT-PCR检测中肠SePGRP-SA, Ceropin, Attacin和Defensin的相对表达量。【结果】克隆获得甜菜夜蛾SePGRP-SA全长DNA(GenBank登录号：MW265930),开放阅读框长576 bp,编码191个氨基酸,其编码蛋白的预测分子量为21.59 kD。序列分析结果表明,SePGRP-SA具有典型的PGRP和Ami2保守结构域,信号肽为19个氨基酸,为分泌型蛋白;系统进化分析发现,SePGRP-SA与斜纹夜蛾Spodoptera litura的SlPGRP亲缘关系最近,氨基酸序列一致性达91.1%。发育表达谱结果表明SePGRP-SA在甜菜夜蛾4和5龄幼虫、预蛹和蛹中高表达;组织表达谱结果表明,SePGRP-SA在4龄幼虫各组织中均表达,其中以血淋巴中表达量最高。与注射dsEGFP(对照)相比,注射dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫在72 h时中肠SePGRP-SA基因表达量下调了95.26%,Cecropin, Attacin和Defensin表达量显著下调,中肠细菌载量显著升高。注射dsEGFP和dsSePGRP-SA的甜菜夜蛾4龄幼虫饲喂Bt-GS57,72 h时幼虫校正死亡率分别为50.00%和73.33%,表明幼虫对Bt-GS57的敏感性明显增加。甜菜夜蛾4龄幼虫取食Bt-GS57后,中肠SePGRP-SA, Cecropin, Attacin和Defensin表达量在48 h均显著增加,72 h时降低。【结论】Bt侵染能够引起甜菜夜蛾SePGRP SA基因激活抗菌肽相关基因Cecropin, Attacin和Defensin的表达。     

核受体因子FTZ-F1在斜纹夜蛾响应虫螨腈及辛硫磷胁迫中的作用机制

【目的】本研究旨在揭示昆虫蜕皮激素信号通路上的关键核受体因子FTZ-F1在斜纹夜蛾Spodoptera litura响应虫螨腈和辛硫磷胁迫中的作用机制。【方法】使用生物信息学方法鉴定斜纹夜蛾FTZ-F1基因,并进行序列比对及系统发育树构建;将LC₃₀浓度辛硫磷和虫螨腈浸叶处理的桑叶分别喂食斜纹夜蛾3龄幼虫,并分别收集取食药叶后1, 12, 24, 36和48 h时存活的幼虫,使用qRT-PCR技术检测幼虫体内SlFTZ-F1的表达水平;使用RNAi技术沉默SlFTZ-F1基因,并使用qRT-PCR技术检测注射dsRNA后SlFTZ-F1的表达水平;将LC₃₀浓度虫螨腈和辛硫磷浸叶处理的桑叶分别喂食沉默了SlFTZ-F1的斜纹夜蛾3龄幼虫,喂食后24和48 h统计斜纹夜蛾幼虫死亡率;选取8个斜纹夜蛾谷胱甘肽S-转移酶(SlGST)基因,使用qRT-PCR技术检测沉默了SlFTZ-F1基因的斜纹夜蛾幼虫这些SlGST基因的表达水平。【结果】斜纹夜蛾SlFTZ-F1开放阅读框长1 665 bp,编码555个氨基酸,等电点为6.39,理论分子量61.77 kD,SlFTZ-F1具有DNA结合域、FTZ-F1 box及配体结合域;系统发育分析表明,SlFTZ-F1与草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda的SfFTZ-F1聚为一个亚分支。与ddH₂O处理的对照相比,LC₃₀浓度虫螨腈处理后1, 24和36 h以及LC₃₀浓度辛硫磷处理后24和36 h,斜纹夜蛾3龄幼虫SlFTZ-F1的表达量均显著上调。与注射dsGFP的对照组相比,斜纹夜蛾幼虫在注射dsSlFTZ-F1后48 h SlFTZ-F1基因的表达量显著下降;分别将LC₃₀浓度虫螨腈和辛硫磷处理的桑叶喂食沉默了SlFTZ-F1的斜纹夜蛾3龄幼虫,48 h时与对照组相比斜纹夜蛾幼虫死亡率分别显著升高22%和28%;沉默SlFTZ-F1的斜纹夜蛾幼虫8个SlGST基因的表达量均显著下降。【结论】虫螨腈及辛硫磷显著诱导斜纹夜蛾幼虫SlFTZ-F1基因表达,沉默SlFTZ-F1后斜纹夜蛾幼虫对虫螨腈和辛硫磷的敏感性显著升高,解毒酶SlGST基因的表达受到显著抑制,说明发育相关的转录因子FTZ-F1在斜纹夜蛾响应常用杀虫剂胁迫中发挥了重要作用。     

细胞视黄酸结合蛋白与肿瘤相关研究

细胞视黄酸结合蛋白(CRABP)在细胞质介导视黄酸与细胞核上视黄酸核受体之间互相作用,同时促进视黄酸代谢酶类的活性,增强视黄酸的转化速率。在脊椎动物细胞中,CRABP包含两种高度同源蛋白质:CRABP1和CRABP2。CRABP属于低分子量的蛋白质,种属间高度保守。现有研究表明在许多肿瘤中存在CRABP基因异常甲基化,基因表达水平较正常组织有差别;CRABP基因异常甲基化与部分肿瘤患者低生存率存在相关性,CRABP基因可以成为常见的肿瘤诊断以及判断预后的分子靶标。     

苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)表达及其生长发育的影响

【目的】几丁质酶和几丁质合成酶对昆虫的变态发育极其重要。本研究旨在阐明苦瓜素Ⅰ对斜纹夜蛾Spodoptera litura几丁质酶和几丁质合成酶基因表达及其生长发育的影响。【方法】利用RT-qPCR检测斜纹夜蛾几丁质酶基因(SlCht)和几丁质合成酶基因(SlCHS-A)在斜纹夜蛾不同发育阶段(卵、幼虫、预蛹、蛹和成虫)和4-6龄幼虫不同组织(体壁、中肠、脂肪体、血细胞、头部和马氏管)中的表达水平以及注射苦瓜素Ⅰ溶液(4 μg/头) 24, 48和72 h时斜纹夜蛾SlCht和SlCHS-A在6龄幼虫各组织中的表达水平。分析在斜纹夜蛾4龄幼虫中注射不同浓度(31.25, 62.5, 125, 250和500 ng/头)的苦瓜素Ⅰ溶液对幼虫和蛹历期、幼虫增重、蛹重、蛹长度、化蛹率、羽化率和存活率的影响,并利用体视显微镜观察斜纹夜蛾幼虫的表型变化。【结果】SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾中的表达具有发育阶段特异性。SlCht和SlCHS-A在卵期表达量最高,幼虫期和预蛹期的表达量较低;在各幼虫期又表现为6龄幼虫期表达量最高,在其他龄期的表达量低。SlCht和SlCHS-A在斜纹夜蛾6龄幼虫中也显示出组织特异性表达,在血细胞和体壁中高表达,在头部、中肠和脂肪体中低表达。在斜纹夜蛾6龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ能诱导SlCht和SlCHS-A在其各组织中表达量降低;在4龄幼虫中注射苦瓜素Ⅰ后,斜纹夜蛾的生长发育受到抑制,幼虫增重延缓,发育历期延长,化蛹率下降甚至化蛹失败,幼虫及蛹出现较高的畸形率。【结论】苦瓜素Ⅰ可通过诱导SlCht和SlCHS-A表达量的降低来实现对斜纹夜蛾生长发育的抑制作用。本研究为进一步阐明苦瓜素对斜纹夜蛾生长发育的抑制机制提供了新的理论基础,并为进一步应用苦瓜素Ⅰ进行防控奠定了基础。     

novel-m0287-3p调控斜纹夜蛾中肠蜕皮激素受体的表达

microRNA (miRNA)是一类长度约为23个核苷酸的非编码内源性小分子RNA,参与真核生物基因表达的调控,从而在生物发育和应对环境中起着重要的作用。为了探讨novel miRNA在害虫发育中的作用,本研究对斜纹夜蛾Spodoptera litura miRNA数据库中表达量较高的novel-m0287-3p进行了研究。通过生物信息学分析,确定了novel-m0287-3p是一个新的miRNA,并预测其可能靶向蜕皮激素受体EcRb1,表明novel-m0287-3p可能参与斜纹夜蛾发育的调控。双荧光素酶实验表明,novel-m0287-3p分别结合于EcRb1 3′非编码区的2个位点上。实时荧光PCR结果显示novel-m0287-3p和EcRb1均在斜纹夜蛾的中肠中表达。为了进一步揭示novel-m0287-3p对EcRb1表达的调控以及对幼虫发育的影响,本研究进行了体内实验。将novel-m0287-3p的模拟体类似物注射入斜纹夜蛾幼虫,结果显示斜纹夜蛾体内EcRb1的mRNA水平发生了下调,证明novel-m0287-3p能够抑制幼虫EcRb1的表达。向4龄第1天的斜纹夜蛾幼虫注射novel-m0287-3p后,幼虫的生长受到抑制;而注射斜纹夜蛾6龄幼虫则导致其化蛹滞后。研究结果表明,novel-m0287-3p可通过调控蜕皮激素受体EcRb1的表达,从而影响斜纹夜蛾的生长发育。     

DNA甲基转移酶参与调控斜纹夜蛾和家蚕幼虫的生长

DNA甲基化是真核生物生长发育过程中基因表达的一种重要调控机制。本研究以鳞翅目农业害虫斜纹夜蛾Spodoptera litura和模式昆虫家蚕Bombyx mori为材料,研究了甲基化对幼虫生长的影响。研究结果表明,注射甲基化抑制剂5-Aza-d C后,不正常斜纹夜蛾比对照增加了36%,家蚕的增加了58.8%,不正常虫的生长发育缓慢、体型变小。斜纹夜蛾DNA甲基转移酶Sldnmt1 RNAi获得了相似的结果,不正常幼虫率比对照增加了35%。检测家蚕Bmdnmt1的m RNA水平,发现Bmdnmt1在5龄期的翅原基、脂肪体、表皮和中肠均有表达,其表达量在翅原基中的为最高;在翅原基和脂肪体中,Bmdnmt1的含量在5龄初期比在预蛹期的要高。初步分析了甲基化抑制剂处理后的家蚕脂肪代谢相关基因的表达,发现脂肪酶和乙酰辅酶A结合蛋白的m RNA水平在注射5-Aza-d C后48 h显著下调。研究结果初步表明了DNA甲基化参与调控了鳞翅目幼虫的生长发育,脂肪代谢可能是DNA甲基化调控的其中一个通路。     

斜纹夜蛾信息素结合蛋白SlitPBP4的分子克隆、组织表达谱及结合特性分析

【目的】鉴定斜纹夜蛾Spodoptera litura新的信息素结合蛋白(pheromone binding protein,PBP)基因,明确其在斜纹夜蛾不同组织中的表达水平并探讨其功能。【方法】基于已报道的烟草天蛾Manduca sexta、家蚕Bombyx mori、君主斑蝶Danaus plexippus和庆网蛱蝶Melitaea cinxia 4种非夜蛾科昆虫PBP4同源基因的序列特点及与其他PBP基因在染色体上的相邻关系,通过分析实验室先前克隆到的斜纹夜蛾PBP/GOBP基因序列,克隆斜纹夜蛾PBP4同源基因;通过RT-PCR和q PCR技术测定该基因在斜纹夜蛾雌雄成虫不同组织中的表达水平;利用体外表达和荧光竞争性结合实验测定斜纹夜蛾PBP4蛋白对性信息素组分和植物气味物质的结合能力。【结果】在夜蛾科昆虫斜纹夜蛾中鉴定到首个PBP4基因,命名为Slit PBP4(Gen Bank登录号:MG356847),c DNA编码210个氨基酸,具有N末端信号肽、疏水性气味分子结合域及6个保守半胱氨酸等PBP的典型序列特征,其基因组DNA在保守位置也含有2个内含子;但和已报道的斜纹夜蛾3个PBP相比,PBP4的C末端明显较长。Slit PBP4在雄成虫腹部(生殖系统)极高表达,在雌雄成虫触角及其他组织中仅微弱表达或不表达。荧光竞争性结合实验结果表明,Slit PBP4蛋白与被测定的信息素组分及植物气味物质均没有明显结合能力。【结论】报道了夜蛾科昆虫的首个PBP4基因,该基因可能主要参与雄虫生殖相关的生理过程而非嗅觉功能。     

斜纹夜蛾GNBP1基因的克隆及诱导表达模式的研究

革兰氏阴性结合蛋白(Gram-negative bacteria binding proteins,GNBPs)是昆虫天然免疫系统中的一类重要模式识别受体,在识别病原微生物表面的相关分子模式中发挥着重要作用。为了解模式识别蛋白GNBP如何免疫应答病原微生物应激,本研究利用RT-PCR结合RACE技术克隆获得斜纹夜蛾革兰氏阴性结合蛋白GNBP1基因(SlGNBP1)。斜纹夜蛾SlGNBP1基因(GenBank登录号:JF313110)全长cDNA序列为1 448 bp,开放阅读框(ORF)序列长1 302 bp,编码433个氨基酸残基。生物信息学分析序列表明SlGNBP1蛋白序列含有βGRP(β-1,3-glucan recognition protein)家族特有的保守性结构域,即糖苷水解酶活性结构域(Glyco_hydro_16),有3个N-糖基化位点,19个O-糖基化位点,42个磷酸化位点。系统进化树和同源性分析表明斜纹夜蛾SlGNBP1基因与其它鳞翅目昆虫的βGRP1基因的同源性很高,其中,斜纹夜蛾SlGNBP1基因与棉铃虫和柑橘凤蝶的βGRP序列相似度最高,相似度分别为79%和66%,SlGNBP1蛋白序列中有4个保守的半胱氨酸位点,富含12个色氨酸,由于两个葡聚糖酶活性位点突变而失去葡聚糖酶活性。利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)检测斜纹夜蛾SlGNBP1基因的时空表达模式,结果表明SlGNBP1基因在斜纹夜蛾整个发育历期都表达,其中4龄幼虫表达量最高;组织分布表明SlGNBP1基因在斜纹夜蛾的表皮、脂肪体、中肠、卵巢和血细胞中均有表达,其中脂肪体为主要表达部位。将绿僵菌、玫烟色棒束孢、金黄色葡萄球菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌和粘质沙雷氏菌6种病原微生物分别注射4龄斜纹夜蛾幼虫后,对SlGNBP1基因进行mRNA水平检测。RT-qPCR检测表明SlGNBP1在不同诱导时间点与对照相比,均呈现明显上调表达,但诱导程度不同,诱导18-24 h后达到峰值,且SlGNBP1基因对粘质沙雷氏菌最为敏感,与对照相比提高了约100倍。以上结果表明SlGNBP1基因可能在斜纹夜蛾先天免疫应答反应中通过识别病原微生物表面的相关分子模式而发挥作用,可能成为斜纹夜蛾生物防治的新靶标。