日本沼虾两种抗脂多糖因子的特性研究（英文）

为了研究抗脂多糖因子ALFs在日本沼虾先天性免疫中的功能作用,研究从日本沼虾中克隆了2种抗脂多糖因子Mn ALF1、Mn ALF2。Mn ALF1 c DNA全长1008 bp,编码121个氨基酸;Mn ALF2 c DNA全长836 bp,编码124个氨基酸。这2种氨基酸均包含有一个信号肽序列和一个LPS结合位点,并且在结合位点的两端(N-端和C-端)都有2个保守的半胱氨酸残基。这2种Mn ALFs与之前发现的甲壳动物的ALFs是非常相似的。q RT-PCR结果显示Mn ALFs在所有被检测的组织中均有表达。其中Mn ALF1主要在心脏和小肠内表达,而Mn ALF2则主要在血细胞和肝胰脏中表达。在用嗜水气单胞菌刺激之后发现2种Mn ALFs在心脏、小肠、血细胞、肝胰脏中都呈现出明显的时间依赖表达模式(Mn ALF1在刺激之后呈现出先减少后增加的趋势,之后分别在不同组织的不同时间点达到最大值;然而,对于Mn ALF2,在心脏和小肠中先减少后增加,在血细胞和肝胰脏中呈现出先增加后减少,最后都在24h达到最大值)。结果提示这2种Mn ALF具有不同的组织特异性,并且在细菌侵染的免疫防御中起着重要的保护作用。     

长毛明对虾酚氧化酶原基因cDNA克隆及组织表达分析

酚氧化酶(phenoloxidase,PO)属于对虾免疫系统的核心酶,在机体抵抗微生物感染过程中起到重要的作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆长毛明对虾(Fenneropenaeus penicillatus)酚氧化酶原(prophenoloxidase,proPO)基因(F-proPO)。cDNA全长3 003 bp,包含63 bp的5′-UTR、879 bp的3′-UTR和编码686个氨基酸的2 061 bp的开放阅读框(ORF),预测分子量为78.05 kD,理论等电点(pI)为5.79;含有3个串联式血蓝蛋白结构功能域、2个保守的Cu~(2+)结合位点和6个组氨酸残基;多重比对结果表明,F-proPO与中国明对虾proPO相似度最高(98%),与其他甲壳类动物proPO相似度为51%～93%。实时荧光定量PCR检测结果表明,该基因的表达具有组织特异性,在血淋巴中表达量最高。人工感染溶藻弧菌后,该基因在鳃、血淋巴、肠和性腺中表达水平显著上调;人工感染白斑综合征病毒后,该基因在脑、鳃、心、血淋巴和肠中表达水平显著上调。可见,长毛明对虾PO是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

凡纳滨对虾ANT2 基因的克隆及低温表达谱分析

为研究凡纳滨对虾适应低温的分子机理, 实验对从低温处理凡纳滨对虾抑制性消减文库中筛选出的一个360 bp EST 序列进行了研究。首先, 同源比对显示该EST 片段与其他物种的ANT2 基因高度同源, 命名为凡纳滨对虾ANT2 基因(LVANT2); 其次, 通过构建凡纳滨对虾肝胰腺全长cDNA 文库, PCR 扩增获得LVANT2 基因的全长cDNA1540 bp, 其中包括1011 bp 的完整开放阅读框, 编码336 个氨基酸残基。然后, 对基因进行了不同组织和低温处理的表达谱分析: (1)组织表达谱的结果显示, 该基因在凡纳滨对虾肌肉组织中表达量最高; (2)在不同低温处理下的表达结果显示, 该基因在15℃处理下基因表达量发生显著变化, 13℃开始呈下调表达, 11℃时表达量又升高; 13℃低温处理不同时间发现该基因在12h 内表达量发生显著变化,48h 后表达量最高。LVANT2 基因的低温诱导表达模式说明其可能在凡纳滨对虾低温适应中发挥作用       

中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子, 参与机体多种免疫反应, 在溶菌过程中形成一个水解体系, 破坏和消除侵入体内的病原, 从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因), 该基因全长709 bp, 其完整的阅读框为477 bp, 编码158个氨基酸, 前18个氨基酸(-1~-18)为信号肽, 成熟肽由140个氨基酸组成(1-140aa), 其分子量为16.2 kD。经SMART分析,该基因具有1个溶菌酶1(LYZ1)结构域(19-130aa)。半定量RT-PCR分析结果表明溶菌酶虽在多种组织中有较低水平的组成性表达, 但在细菌诱导的血细胞、心脏、肝胰腺和鳃等多种组织中表达上调。将中国明对虾溶菌酶基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-30a (+)中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 再进行诱导表达和亲和纯化, 得到了纯化的重组溶菌酶, 并进行了抑菌活性检测。结果表明, 重组对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强, 最小抑菌浓度达到3.43 mmol/L, 但对革兰氏阴性菌抑制作用较小。上述结果表明, 该溶菌酶作为一种重要的免疫效应分子, 参与了对虾的免疫防御反应。     

中国明对虾溶菌酶基因克隆、重组表达与性质分析

溶菌酶是机体先天免疫系统中一个重要的效应分子, 参与机体多种免疫反应, 在溶菌过程中形成一个水解体系, 破坏和消除侵入体内的病原, 从而实现机体的免疫防御。从中国明对虾中克隆得到了溶菌酶基因(称为FcLyz基因), 该基因全长709 bp, 其完整的阅读框为477 bp, 编码158个氨基酸, 前18个氨基酸(-1~-18)为信号肽, 成熟肽由140个氨基酸组成(1-140aa), 其分子量为16.2 kD。经SMART分析,该基因具有1个溶菌酶1(LYZ1)结构域(19-130aa)。半定量RT-PCR分析结果表明溶菌酶虽在多种组织中有较低水平的组成性表达, 但在细菌诱导的血细胞、心脏、肝胰腺和鳃等多种组织中表达上调。将中国明对虾溶菌酶基因的成熟肽亚克隆进原核表达载体pET-30a (+)中, 转化大肠杆菌BL21(DE3), 再进行诱导表达和亲和纯化, 得到了纯化的重组溶菌酶, 并进行了抑菌活性检测。结果表明, 重组对虾溶菌酶对革兰氏阳性菌的抑菌能力较强, 最小抑菌浓度达到3.43 mmol/L, 但对革兰氏阴性菌抑制作用较小。上述结果表明, 该溶菌酶作为一种重要的免疫效应分子, 参与了对虾的免疫防御反应。     

野生茄子(Solanum torvum)抗黄萎病相关基因StoVe1的克隆与分析

采用RT-PCR和RACE技术从野生茄子中扩增克隆到一个抗黄萎病相关基因,命名为StoVe1,其cDNA全长3 400bp,含有3 153 bp的完整开放阅读框,编码1 051个氨基酸,该基因编码的蛋白序列与刚果野茄、类番茄和番茄Ve1编码的氨基酸序列同源性分别为82%、81%和80%,且有很高的功能区段保守性.将该cDNA全长序列提交GenBank,登陆号为DQ020574.半定量PCR表明该基因为组成型表达,在根中表达最多,叶中最少.     

中国对虾Gs基因克隆及其在急性低盐胁迫下功能分析

采用RACE技术对中国对虾cAMP信号通路内鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α亚基(Guanine nucleotide-binding protein G(s) subunit alpha)基因进行克隆并对其功能进行分析。将基因命名为FcGs, 该基因cDNA全长为1692 bp, 编码379个氨基酸。对同源性进行分析显示与凡纳滨对虾同源性为99%, 与日本囊对虾同源性为97%。FcGs基因组织表达分析显示, 鳃和肝胰腺表达量较高。急性低盐胁迫使FcGs基因整体呈现上调表达。对中国对虾cAMP信号通路内Gs含量及Gs基因上游多巴胺(DA)含量, 下游环腺苷酸(cAMP)和蛋白激酶A(PKA)含量及腺苷环化酶(AC)和钠钾ATP酶(Na+-K+-ATPase)活力进行测定, 发现急性低盐胁迫后整体均呈上升且变化趋势基本一致。对FcGs基因进行干扰后中国对虾死亡率上升。研究表明, FcGs基因及其所在的cAMP信号通路可以通过调控Na+-K+-ATPase的活力在中国对虾渗透压调节过程中发挥重要作用。     

凡纳滨对虾β-actin基因的克隆与表达

目的:克隆凡纳滨对虾肌动蛋白基因并在原核表达系统中表达.方法:根据GenBank上凡纳滨对虾β-actin基因序列设计引物,采用RT-PCR方法,从凡纳滨对虾肌肉组织中克隆出β-肌动蛋白基因cDNA部分序列,克隆序列连接到pBAD/gⅢA质粒,转化人大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,进行温度诱导表达重组蛋白.结果:克隆序列长度为1300bp,测序结果与Gene-Bank序列同源性达99.91%;获得重组体诱导表达产物经SDS-PAGE分析,在约48kD处有表达的蛋白带,表达产物经Western Blotting鉴定为阳性.结论:获得β-actin基因在大肠杆菌中稳定表达产物.     

心脏特异新基因Lrrc10的分子克隆与特性分析

采用表达序列标签(EST)介导的基因克隆和表达谱分析,从小鼠心脏克隆了一个心脏特异新基因Lrrc10（GenBank Acc No. AF527781）.该基因cDNA全长为1 410 bp,定位于小鼠染色体10D2,在基因组中无内含子.Lrrc10的最大开放阅读框编码的假想蛋白由274个氨基酸组成,含有7个亮氨酸重复基序.同源性检索未发现有整体同源性的已知基因.EST数据库中支持该基因cDNA序列的全部18条EST均来自小鼠心脏组织.对小鼠的不同组织cDNA的RT-PCR检测证实该基因主要在心脏中强表达,在肺低表达,而在其他组织中不表达或表达很弱.因此该基因是心脏特异的富亮氨酸重复超家族新成员.