Sertoli细胞饲养层对小鼠精原干细胞增殖的影响

摘要 目的 以小鼠睾丸支持细胞(Sertoli)为饲养层,小鼠胚胎成纤维细胞(STO) 饲养层做对照,研究它对小鼠精原干细胞增殖的影响。方法 用无血清StemPro-34 SFM培养基培养2～5日龄小鼠精原干细胞,分别用相差显微镜观察,免疫组化法研究Sertoli饲养层对精原干细胞生物学行为的影响。结果 发现精原干细胞在Sertoli及STO两种饲养层上的一周内的生物学行为非常相似,但培养1周后,Sertoli细胞作饲养层的培养体系中保留的精原干细胞要比对照组明显增多,约有30%的精原干细胞能存活下来并能维持存活到60d以上。结论 Sertoli细胞作饲养层明显促进精原干细胞的更新增殖。     

山羊精原干细胞的鉴定及培养体系优化的研究

该研究优化了山羊精原干细胞(goat spermatogonial stem cells,g SSCs)培养体系,使山羊精原干细胞能在体外长期培养,维持自我更新的能力并保持未分化状态。取3~5月龄山羊睾丸,采用两步酶消法结合差速贴壁方法得到山羊精原干细胞悬液,分别通过形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色、特异基因表达及蛋白质水平的分析对培养的细胞进行鉴定;并以山羊睾丸支持细胞(goat sertoli cells,g SCs)、小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)和层黏连蛋白(laminin,L)为饲养层,观察饲养层对山羊精原干细胞体外增殖的影响。结果表明,山羊精原干细胞体外增殖形成克隆簇,AKP染色呈阳性。经RT-PCR检测,Oct-4、C-myc、Cyclin D1、Ngn3和TERT等干细胞特异基因均有表达。细胞免疫组化结果显示,Oct-4、SSEA-1、α6-integrin、Vasa和Thy-1蛋白质呈阳性。克隆簇统计显示,在山羊睾丸支持细胞上形成的山羊精原干细胞(goat spermatogonial stem cells,g SSCs)克隆数与其他两组比较差异显著(P0.05)。山羊睾丸支持细胞饲养层上的精原干细胞可在体外传3~4代,培养时间为2个月。结果证明,通过两步酶消法和差速贴壁法可以分离获得山羊精原干细胞,且山羊睾丸支持细胞能够促进g SSCs的增殖。     

水牛精原干细胞研究进展

精原干细胞(SSCs)是一类能够不断地进行自我更新和分化,并能保证遗传物质在亲子代之间有效传递的成体干细胞。伴随着各种移植技术、细胞体外培养及冻存等技术的发展,精原干细胞的应用成为可能,其在生产转基因动物及保护珍稀物种等方面有着广阔的应用前景。本文对水牛SSCs的生成、分离、纯化、培养、鉴定以及冻存的研究进行了系统的阐述。     

人骨髓基质细胞对精原干细胞体外增殖的影响研究

精原干细胞是精子形成的原始细胞,在睾丸组织中的含量极低,而体外有效扩增方法的选择对其移植治疗和抗生育研究十分重要。本实验选用人骨髓基质细胞代替传统饲养层培养人精原干细胞,探讨精原干细胞能否在该饲养层上增殖的可能机制,为人精原干细胞培养提供实验方法和技术指导。骨髓基质饲养层的制备：无菌分离流产5～8月胎儿股骨,     

浅谈精原干细胞研究进展

精原干细胞是雄性动物体内精子发生过程中起重要作用的精原细胞类型,不但具有干细胞特性,还能定向分化为雄性配子将自身基因传递给后代。除此之外,体外培养和鉴定精原干细胞为移植和转基因提供了基础。我们对精原干细胞的生物学特性、分离培养、鉴定、移植及精原干细胞介导的转基因进行简要概述。     

低温冻存对骨髓基质细胞生物学特性的影响

目的：探讨低温冻存对骨髓细胞和贴壁基质细胞生物学特性的影响。方法：取新鲜骨髓和经Dexter法培养14d的骨髓贴壁基质细胞(称“基质细胞”),经-196℃液氮冻存(前者称“冻存骨髓”,后者称“冻存基质细胞”)2周,复温,再用Dexter法培养这些细胞,检测细胞增殖、细胞形态、细胞化学染色、细胞表面抗原及基质细胞支持另一骨髓造血细胞形成的鹅卵石造血区(CAFC),长期培养起始细胞(LTCIC)的变化,比较冻存对骨髓细胞和基质细胞生物学特性的影响。结果：生长特性：冻存骨髓比新鲜骨髓、冻存基质细胞比新鲜基质细胞培养后融合成片的时间延迟,细胞增殖数比也有减低。细胞成分：冻存骨髓比新鲜骨髓形成的成纤维细胞、内皮细胞比率下降,而巨噬细胞和脂肪细胞比率升高,冻存基质细胞上述现象更明显：冻存后含凋亡小体的细胞在骨髓细胞和基质细胞内均有增加。细胞表面抗原：冻存骨髓、冻存基质细胞CD14、HLA-DR抗原表达百分率比新鲜骨髓、新鲜基质细胞高,CD45、CD33反之。支持造血：冻存前后骨髓和基质细胞支持形成的CAFC和LTC-IC,生长良好,无显著差异。结论：骨髓细胞和经培养生成的贴壁基质细胞,经冻存和复温,生物学特性有一定变化,但仍可以保留良好的支持造血重建功能。     

大鼠主动脉内皮细胞的分离培养和鉴定

目的:探索大鼠主动脉原代内皮细胞体外培养方法,为体外研究提供细胞模型。方法:分离大鼠主动脉,直接贴壁于培养皿中,荧光倒置显微镜观察细胞形态,免疫组化Ⅷ因子相关抗原染色鉴定细胞。结果:约24小时组织块边缘有游离的新生细胞长出,7天即融合成片。消化传代后细胞呈短梭形或三角形,单层生长,铺路石状,Ⅷ因子表达阳性,呈指数增殖。冻存后复苏细胞活性均超过90%。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。     

兔脂肪组织来源干细胞的分离培养及冻存复苏初步研究

目的:体外分离培养兔脂肪组织来源干细胞,初步探索其冻存复苏条件,为声带损伤修复重建的实验研究奠定基础.方法:分离兔腹股沟脂肪组织,胶原酶消化,低糖DMEM培养,倒置显微镜下观察其形态,MTT法检测其生长规律,定向诱导方法检测细胞的多向分化潜能,并进行冻存复苏.结果:分离培养的细胞具有很强的增殖能力和多向分化能力,在特定条件下可分化为脂肪细胞和成骨细胞,冻存复苏后的细胞仍能保持冻存前的生物特性.结论:成功分离培养出兔脂肪组织来源干细胞,其在液氮中能长期冻存且能复苏存活,可用于修复损伤的兔声带的实验研究.     

不同年龄小鼠精原干细胞系的建立

精原干细胞（spennatogonial stem cells,SSCs）是雄性动物体内能进行终生自我更新并能将亲代基因遗传给予子代的一类细胞。不同年龄段的小鼠有不同的建系方法。6-7d幼鼠,可以用差异贴壁或直接贴壁法;5-6周成年鼠,一般采用差异贴壁法;31周老年鼠,最好种于饲养层细胞上。通过对精原干细胞系的甲基化和特异基因分析以及睾丸体内移植验证分析,成功建立了具有功能的不同年龄段的小鼠精原干细胞系。     

一种简便的小鼠精原干细胞分离培养方法

采用一步酶消化法分离小鼠精原干细胞,比较α-MEM、DMEM培养基对体外培养的精原干细胞生长状态的影响,对精原干细胞集落进行形态观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色和免疫组化鉴定,并诱导精原干细胞向精子细胞分化。结果显示,以小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,用α-MEM培养的精原干细胞集落较大且呈葡萄串状或念珠状,细胞状态较好;小鼠精原干细胞集落的AKP染色阳性呈紫红色;在红色荧光下精原干细胞集落的Oct-4核蛋白表达为阳性、膜蛋白c-Kit、β_1-integrin和Gfrα-1表达为阳性;精原干细胞经维甲酸(all-trans-retinoic-acid,RA)诱导可初步分化成精子样细胞。因此,采用一步酶消化法能够分离小鼠精原干细胞,α-MEM更适合小鼠精原干细胞体外培养。