抗胃癌单克隆抗体3H11对应抗原的纯化及鉴定

抗胃癌单克隆抗体3H11的对应抗原主要表达于靶细胞的膜上,不耐热,经蛋白酶消化,抗原失活。过碘酸氧化不影响活性,Schiff′s试剂糖柒色为阴性。SDS-PAGE显示单一区带,分子量为210kD。靶细胞经衣霉素抑制糖基化作用后,对其分子量无明显影响。等电聚焦电泳表明其等电点为8.5,故3H11抗原为一大分子碱性蛋白。     

抗腺苷酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定

克隆了6株稳定分泌抗腺苷酸激酶(Adenylate kinase,AK)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并鉴定或测定了其中3株细胞所分泌抗体的亚型和分子量.通过测定抗体和固相及均相抗原的结合能力,发现McAb3D3与固定化及溶液中腺苷酸激酶的亲和常数分别为8.4×10⁸和7.0×10~4(mol·L^-1)^-1,而McAb4D8与固定化及溶液中腺苷酸激酶的亲和常数分别为9.6×10⁸和3.9×10⁶(mol·L.¹)^-1McAb3D3和McAb4D8与不同存在形式抗原之间亲和常数如此大的差别,说明这2个抗体更适合与固定化腺苷酸激酶的结合.由于蛋白质分子常因吸附在酶标板上而发生部分变性,所以用间接ELISA方法筛选出的单克隆抗体McAb3D3和McAb4D8可能是针对部分变性腺苷酸激酶分子的.这2种抗腺苷酸激酶单克隆抗体的制备及鉴定为我们进一步将其用于蛋白质折叠机制的研究奠定了基础.     

抗鸡白细胞介素4单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备鸡白细胞介素4(chIL-4)单克隆抗体,将成熟的chIL-4基因亚克隆至原核表达载体pET-28a和pGEX-6P-1上,然后在大肠杆菌中分别诱导重组蛋白His-chIL-4和GST-chIL-4的表达,并纯化。将纯化后的His-chIL-4作为免疫原免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)融合。将纯化后的GST-chIL-4作为筛选抗原,利用间接ELISA筛选阳性克隆。阳性细胞株经3次亚克隆后,获得3株稳定分泌抗chIL-4蛋白的杂交瘤细胞株,分别命名为1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H。经ELISA检测,3株单克隆抗体的亚型均为IgG1,亲和力解离常数(Kd)分别为1.79×10~(–9)、1.61×10~(–9)和2.36×10~(–9)。经Western blotting及间接免疫荧光试验鉴定,3株单克隆抗体均能特异性识别原核和真核表达的chIL-4蛋白。Western blotting试验证明1G11-3B、2E5-3D和1G11-5H识别的抗原表位区域分别为chIL-4蛋白N端的第1–40、80–112和40–80位氨基酸。该单克隆抗体的制备为chIL-4的检测和生物学功能研究奠定了基础。     

抗呼吸道合胞病毒(RSV)单克隆抗体的制备及其对RSV病毒株抗原性的分析

用呼吸道合胞病毒R6(武汉地方株)活毒滴鼻加用戍二醛固定的病毒感染的Hela细胞免疫BALB/C鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤SP_2/0细胞融合,培育出分泌抗呼吸道合胞病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞13株,这些细胞的染色体数为94至104条,其分泌的抗体分别属于鼠IgC_1、IgG_(2a)、IgG_(2b)亚类。腹水荧光抗体滴度为1:10000～1:100000。其中五株单抗有中和病毒作用,尤其是两株中和放价达1:128。应用免疫转印法证实了这些单抗分别能识别RSV6种主要结构蛋白,用7株识别不同病毒结构蛋白的单抗对12株合胞病毒进行抗原性分析,可将这些病毒区分为二个血清型,即A亚型和B亚型。     

人红细胞非凝集型单抗(自身全血凝集试验试剂)的研制及鉴定

应用杂交瘤技术 ,混合人O型红细胞免疫纯系BALB/C小鼠 ,包被的红细胞作为固相抗原 ,ELISA法筛选出识别红细胞表面共同抗原的抗体 ,然后利用Coombs原理 ,加入抗球蛋白试剂。用玻片法筛选出非凝集型抗体 ,得到 2株稳定分泌上述抗体的杂交瘤并进行初步鉴定 ,单抗上清血凝效价可达 1∶5 0～ 1∶10 0 ,腹水血凝效价为 1∶8× 10 4 ～ 1∶16× 10 4 。另外 ,本文特别讨论了凝集型单抗的Fab段作为非凝集型抗体应用的可能性。     

两步串联层析法纯化鼠抗人CD80单克隆抗体4E5

采用阴离子交换与凝胶过滤两步串联层析法,纯化了小鼠腹水来源的CD80阻断型单克隆抗体4E5。腹水样品经离心、过滤预处理后,在Tris-HCl缓冲溶液(pH8.0, 50mmol/L)条件下上阴离子交换柱对目的单抗进行捕集,采用0-0.5 mol/L NaCl浓度分步洗脱;含目的单抗的洗脱馏分再上凝胶过滤柱纯化,用PB缓冲溶液（pH7.2, 20mmol/L）洗脱,获得目的单抗4E5,其生物学活性高、纯度大于95%,抗体总回收率达61%。     

抗丙肝病毒NS5蛋白单克隆抗体的研制及鉴定

用基因重组的丙肝病毒 ＮＳ５蛋白免疫Ｂａｌ ｂ／ｃ ／小鼠,制备免疫脾Ｂ淋巴细胞,与小鼠骨髓瘤Ｓｐ２／０细胞系融合,筛选获得了１株能分泌抗 ＮＳ５蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,该株单克隆抗体为 ＩｇＧ１。ＥＬＩＳＡ及 Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ证实该株单抗对 ＮＳ５蛋白有较好的特异性。     

抗H9亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备和鉴定

目的:获得分泌抗H9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。方法:以H9N2亚型AIV为免疫原,免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0-Ag-14,在PEG4000的作用下进行细胞融合,通过血凝抑制(HI)试验筛选分泌抗H9亚型AIV血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞。结果:经过连续3～4次克隆化,获得能稳定分泌抗H9亚型AIV血凝素的单克隆抗体细胞系6株,分别命名为1B2、1C10、1G2、2B7、2E3和5E11。6株细胞培养上清HI效价为24～28,腹水HI效价为210～213。除1G2为IgM外,其余5株均为IgG1。Western blotting结果显示,1B2、1C10、2B7和2E3能与AIVH9蛋白在Mr为75000处反应,表明其是针对AIVH9亚型血凝素蛋白的单抗。特异性试验表明该6株单抗均只与H9亚型AIV发生特异性HI反应,而不与其他14个HA亚型的AIV及新城疫病毒、传染性支气管炎病毒发生交叉反应,显示出良好的特异性。结论:制备了针对H9亚型禽流感病毒血凝素的单克隆抗体,为禽流感的快速诊断和病毒的抗原性分析等奠定了基础。     

抗登革病毒2型E蛋白单克隆抗体的制备和生物学特性的鉴定

为了制备可用于胶体金快速检测试纸条的抗登革病毒2型（DEN2）E蛋白单克隆抗体（mAb）,通过基因克隆获得E基因与质粒pET32a（＋）的重组质粒,将重组质粒转化入大肠杆菌BL21,IPGT诱导表达重组蛋白。以DEN2重组E蛋白免疫BALB／c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗DEN2E蛋白的mAb,以间接ELISA法和Western blot进行mAb特异性鉴定;同时采用间接ELISA法鉴定mAb的Ig亚类。结果表明获得1株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞（7C7）,其抗体亚类为IgG1。Western blot显示该株mAb能特异识别重组pET32a-DEN2E蛋白。因此,成功制备出抗DEN2E的1株mAb,为建立快速特异橙测登革病毒感染的实验方法提供了有力的工具。     

抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体对小鼠的被动免疫保护作用

目的研究抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单克隆抗体(单抗)被动免疫BALB/c小鼠后的抗鼠疫保护效果,确认鼠疫抗体治疗依据,探索鼠疫免疫学治疗的评价手段。方法将BALB/c小鼠随机分组,用不同剂量的抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗4C6和2D2分别进行免疫,再分别用不同剂量的鼠疫强毒菌攻击,通过小鼠的存活率和存活时间,判定F1单抗免疫小鼠被动保护其抵抗鼠疫强毒菌攻击的有效性和剂量相关性。结果在14 d的观察期内,在100.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组和25.0μg组小鼠的存活率分别为100%、83%、50%、50%和0%,平均存活时间分别为15.00 d、14.67 d、13.00 d、13.50 d和9.67 d;2D2单抗400.0μg组、200.0μg组、100.0μg组、50.0μg组、25.0μg组小鼠的存活率分别为83%、50%、50%、33%和0%,平均存活时间分别为14.83 d、13.33 d、12.67 d、12.33 d和8.00 d。在10.0 MLD鼠疫强毒菌攻击下,4C6单抗50.0μg组、25.0μg组和12.5μg组小鼠的存活率分别为83%、83%和17%,平均存活时间分别为14.17 d、14.50 d、9.83 d;2D2单抗50.0μg组、25.0μg组、12.5μg组小鼠的存活率分别为100%、33%和33%,平均存活时间分别为15.00 d、12.33d和11.67 d。2.0 MLD和1.0 MLD攻击的未免疫对照组小鼠全部死亡,平均存活时间分别为6.1 d和6.7 d。F1抗原单抗的免疫剂量与小鼠的平均存活时间和存活率有比较明显的相关性(P<0.05)。结论用抗鼠疫耶尔森菌F1抗原单抗被动免疫小鼠,在受到鼠疫强毒菌攻击时,对小鼠具有免疫保护作用。     

人结肠癌(CCA)单克隆抗体及其识别抗原的分析(简报)

正常细胞转化成癌细胞后,其表型发生了一系列不同于正常细胞的变化,成为肿瘤细胞的标志。Gold和Freeman(1965)用人结肠癌组织的抽提物免疫兔,发现有些用人正常结肠组织吸收后的抗血清能够与肿瘤组织和胚胎肠道抽提物起反应,但不与正常组织抽提物起反应,由于这种抗原最初被发现在胚胎组织,故名为癌胚抗原(embryonic carcinoma antigen,简称CEA)。用敏感的放射免疫或免疫酶标方     

利用基因工程表达核心抗原转化的E抗原制备抗HBeAg单克隆抗体

采用两种变性剂将大肠杆菌基因工程高效表达的乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)转化成为E抗原(HBeAg),其ELISA滴度达1:1000以上,而核心抗原滴度为零。用此抗原免疫小鼠,一次融合即获十四株抗乙型肝炎病毒E抗原的单克隆抗体。细胞培养上清抗体滴度为1:10-1:1000以上,腹水滴度为1:1000-1:100,000以上。十三株IgG、一株IgM。其中十株为抗HBeAg(b)决定簇,四株抗(a)决定簇。它们的敏感性及特异性与日本用血清E抗原制备的单克隆抗体效果完全一致。这是国内外首次应用基因工程表达核心抗原转化E抗原成功 地建立分泌抗HBeAg单克隆抗体杂交瘤细胞株。     

抗幼畜腹泻病原菌E. coli表面抗原(K99)单克隆抗体细胞株的建立与抗体特性分析

本文概述了抗幼畜腹泻病原菌细胞表面抗原K 99蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立与抗体特性的鉴定。经过近半年的体外培养,大多细胞株仍能持续分泌较高滴度的单克隆抗体。腹水中抗体的ELIS．~反应滴度可达2 x 10’。通过EL[SA、免疫荧光、斑点试验、免疫扩散和玻板凝集等多种免疫学方法证明了该抗体是抗K 99蛋白的单克隆抗体。该抗体的特异性与稳定性分析,为使单克隆抗K 99抗体成为幼畜细菌性腹泻病的大规模诊断与防冶的标准免疫学试剂提供了基础。     

治疗用武汉抗CD3单克隆抗体(WuT_3)的致突变性研究

观察了武汉抗ＣＤ３单克隆抗体（简称ＷｕＴ３）对组氨酸缺陷型鼠伤寒沙门氏菌ＴＡ９７、ＴＡ９８、ＴＡ１００及ＴＡ１０２菌株的回复突变作用。结果显示在５～５０００μｇ／皿的剂量范围内,ＷｕＴ３所致的诱发回复突变菌落数与自发回复突变菌落数之比ＭＲ（Ｒｔ／Ｒｃ）,无论加大鼠肝匀浆,辅酶Ⅱ及葡萄糖６－磷酸（Ｓ－９混合液）或不加Ｓ－９混合液,均不超过２。同时观察了ＷｕＴ３对小鼠骨髓细胞微核率及对人外周血淋巴细胞染色体畸变率的影响,结果显示小白鼠ｉｖＷｕＴ３,每日一次,连续２日,在２５～１００ｍｇ·ｋｇ－１范围内,ＷｕＴ３各剂量组的微核细胞率与溶剂对照组相比均无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。而环磷酰胺（ＣＰ）阳性组与溶剂对照组相比有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。ＷｕＴ３在２５～２５０μｇ／瓶的剂量范围内,各剂量组的染色体畸变细胞率与溶剂对照组相比无显著性差异（Ｐ＞０．０５）,而ＣＰ组与溶剂对照组相比有极显著性差异（Ｐ＜０．０１）。三项试验结果均未发现ＷｕＴ３有致突变性作用     

分泌抗加压素单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立(之一)

基于深入研究加压素在体内的作用的需要,特制备其单克隆抗体。以赖氨酸加压素为抗原免疫小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,筛选出两株特异性高的杂交瘤细胞,产生的抗体对赖氨酸加压素有强的结合反应,对精氨酸压素有一定的交叉反应,对催产素基本无反应。鉴定证明,此抗体属IgG1亚类,为纯的、均一性的单克隆抗体。     

抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定

为了明确抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性,并鉴定其识别表位,首先在E.coli中表达了人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和OC43(HCoV-OC4)N蛋白,用Western blotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体(1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5)与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况,而后应用12种重组截短型SARS-CoV N蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位.结果显示(1)在4株抗N蛋白单克隆抗体中,1-1C2、1-1D6和2-2E5不与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应,为SARS-CoV N蛋白特异性抗体;(2)2-8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS-CoV N蛋白的aa 30-60,1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoV N蛋白的aa 170-184.这一研究为阐明SARS-CoVN蛋白的免疫学特征,建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料.     

抗SARS-CoV N蛋白单克隆抗体的特异性及其识别抗原表位的初步鉴定

为了明确抗SARS-CoVN蛋白单克隆抗体的特异性,并鉴定其识别表位,首先在E.coli中表达了人类冠状病毒229E(HCoV-229E)和OC43(HCoV-OC4)N蛋白,用Westernblotting和间接免疫荧光方法分别检测了4株抗SARS-CoVN蛋白单克隆抗体(1-1C2、1-1D6、2-8F11和2-2E5)与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白的交叉反应情况,而后应用12种重组截短型SARS-CoVN蛋白对上述4种单克隆抗体的识别表位进行了初步定位。结果显示:(1)在4株抗N蛋白单克隆抗体中,1-1C2、1-1D6和2-2E5不与HCoV-OC43和HCoV-229E及其N蛋白发生交叉反应,为SARS-CoVN蛋白特异性抗体;(2)2-8F11、1-1D6和2-2E5针对的抗原表位位于SARS-CoVN蛋白的aa30-60,1-1C2针对的抗原表位则位于SARS-CoVN蛋白的aa170-184。这一研究为阐明SARS-CoVN蛋白的免疫学特征,建立特异性免疫诊断技术和研究其致病机制提供了必要的依据和材料。     

抗人细胞角蛋白7(CK7)单克隆抗体的制备及鉴定

用KLH偶联合成细胞角蛋白7(CK7)优势表位多肽片段（C14）免疫小鼠,经细胞融合技术制备CK7单克隆抗体（mAb）,并收集临床组织进行免疫组化鉴定。C14多肽作为抗原具有良好的免疫反应性。本研究共获得了3株能稳定分泌抗CK7抗体的单克隆细胞株,选择亲和力较好的7A8单克隆抗体进行免疫组化鉴定,结果表明,本研究筛选的7A8单克隆抗体的质量浓度为0.49μg/mL时,与收集的临床标本均有良好的特异性反应,低于医院常用CK7检测试剂盒中抗体质量浓度2～5μg/mL,表现出较高的灵敏度。本研究筛选的7A8单克隆抗体为研发CK7快速诊断试剂提供了关键的原材料。     

一株抗猪流行性腹泻病毒N蛋白单克隆抗体抗原表位的鉴定

PEDV N蛋白为高度保守性蛋白,具有极强的免疫原性,因此在临床诊断中具有重要作用。本文对实验室前期制备的针对N蛋白的单克隆抗体9G11的抗原表位进行精确定位。通过与N蛋白进行免疫印迹反应证明9G11所识别的表位是N蛋白的线性表位。利用NEB十二随机肽库进一步定位9G11核心表位氨基酸,结果显示位于N蛋白75~78位的氨基酸FYYL为9G11所识别的关键氨基酸。对20株PEDV不同亚群代表毒株的对应区域进行同源性分析表明此表位高度保守。确定该抗体识别的抗原表位有助于了解N蛋白的结构与功能,同时也为以表位为基础的快速、准确并具临床应用价值的PEDV诊断方法的建立打下良好基础。     

33株抗心肌肌钙蛋白T (cTnT) 的单克隆抗体制备、鉴定及应用

旨在制备抗心肌肌钙蛋白T(cTnT)的单克隆抗体(m Ab),对单抗进行初步评价鉴定,并建立(cTnT)的化学发光定量检测试剂。首先利用外购的cTnT抗原免疫BALB/c小鼠,利用常规m Ab制备技术和间接ELISA法筛选m Ab,以表达和合成的cTnT片段对筛选到的m Ab进行表位鉴定。使用双抗体夹心ELISA方法筛选检测cTnT抗原的配对m Ab,并建立cTnT全自动化学发光定量检测试剂。使用220例临床标本评价该试剂与罗氏试剂的检测一致性,另外使用238例临床样本和784例体检人群样本评价该试剂的临床应用。我们成功筛选到33株稳定分泌抗cTnT抗体的杂交瘤细胞株,并对单抗的表位进行初步鉴定。我们筛选到能检测10 pg/m L cTnT抗原的配对m Ab E16H8和C8G11,并使用该配对研制出全自动化学发光定量试剂。该试剂与罗氏试剂相关系数r达到0.959 9,检测一致率95%,利用该试剂盒检测临床样本灵敏度为97.5%,特异性为99.15%,99%体检人群的cTnT浓度分布小于0.080 6 ng/m L,符合WHO对急性心肌梗死的定义标准。综上,初步建立了cTnT诊断优势表位单抗,并利用这些优势表位的单抗建立全自动管式化学发光定量检测试剂,与罗氏试剂检测结果符合率高。