蛋白质体外表达与进化技术

蛋白质体外表达与进化技术包括核糖体展示技术和mRNA展示技术。与蛋白质体内表达系统相比,体外表达技术可产生较大容量的蛋白质文库（约10^12～10^13左右）,同时在回收编码蛋白质的信息时对文库进行了进化,增加了蛋白质文库的多样性,促进了抗体或配体类蛋白质的亲和成熟能力。该文介绍了蛋白质体外表达技术在新蛋白质（如抗体或配体等）表达筛选中的应用。     

用于蛋白质体外分子进化研究的DNA随机突变技术

蛋白质体外分子进化是模拟自然的进化过程,利用基因随机突变和定向筛选（选择）技术,以获得具有预期新功能的突变体分子。虽然体外进化近几年才产生,但已成为医药和工业领域中筛选具有特殊催化性质的酶的最重要的方法之一。ＤＮＡ随机突变技术是蛋白质体外分子进化研究的基础,本文将对几种最重要的突变方法：倾向错误的ＰＣＲ、ＤＮＡ重排、模板交错延伸反应和随机延伸突变的原理和应用等加以介绍。     

体外进化方法的原理与应用

体外进化方法的原理与应用王琛金由辛（中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室,上海２０００３１）关键词体外进化方法在核酸研究早期,ＤＮＡ和ＲＮＡ的信息贮存和传递功能备受关注,而对它们的高级结构所发挥的生物功能却鲜有问津。Ｒｉ－ｂｏｚｙｍｅ...     

脊椎动物血浆蛋白质的进化

分子生物学的迅猛发展,使我们有可能从分子水平来探讨生物进化这一经典命题。分子进化遂成为进化生物学中的一个新的研究领域。脊椎动物血浆中有数百种蛋白质,依据其一级结构的类似性可划分为仅仅几个家族。蛋白质的进化主要涉及到基因复制(包括加倍)和外显子改组。对不同种属同一种蛋白质的氨基酸排列顺序的比较,可以给出一些有关蛋白质进化的知识。这方面业已取得的成就极大地推进了进化生物学的发展。     

DNA重排及体外分子进化

ＤＮＡ重排是目前为止最简便、最有效的体外定向进化技术,可以对单一基因、质粒、代谢途径、部分甚至整个基因组进行改造。本综述了ＤＮＡ重排的基本原理、特点、与其它体外进化技术的不同,着重介绍了其在体外分子进化上的广泛应用,并对应用前景进行了展望。     

蛋白质相互作用网络进化分析研究进展

近年来,随着高通量实验技术的发展和广泛应用,越来越多可利用的蛋白质相互作用网络数据开始出现．这些数据为进化研究提供了新的视角．从蛋白质、蛋白质相互作用、模体、模块直到整个网络五个层次,综述了近年来蛋白质相互作用网络进化研究领域的主要进展,侧重于探讨蛋白质相互作用、模体、模块直到整个网络对蛋白质进化的约束作用,以及蛋白质相互作用网络不同于随机网络特性的起源和进化等问题．总结了前人工作给学术界的启示,探讨了该领域未来可能的发展方向．     

蛋白质体外磷酸化方法的建立

蛋白质的磷酸化与去磷酸化调节方式在细胞信号传递过程中占有极其重要的位置. 建立鉴定蛋白质磷酸化的可靠方法具有重要意义. 毛细血管扩张性共济失调症突变蛋白(ataxia-telangiectasia mutated, ATM）是直接感受DNA双链断裂损伤,并起始诸多DNA损伤信号反应通路的主开关分子. 电离辐射（IR）细胞学反应中,ATM激酶可通过磷酸化活化p53蛋白,原核表达p53融合蛋白,免疫沉淀IR活化的野生型ATM蛋白,进行蛋白质的体外磷酸化反应. 实验验证了ATM对p53蛋白的磷酸化作用. 这一方法的建立可为研究细胞信号转导途径中蛋白激酶对底物的磷酸化作用及筛查激酶底物提供标准化的技术手段.     

蛋白质人为进化的研究进展

蛋白质人为进化是目前蛋白质工程研究的热点之一.易错PCR、DNA shuffling及高突变菌株的应用,使许多蛋白质在功能上大幅度改善.     

基于新杂合进化算法的蛋白质折叠计算

蛋白质能量最小化是蛋白质折叠的重要内容。用于蛋白质折叠的新的杂合进化算法结合了交叉和柯西变异。基于toy模型的蛋白质能量最小化算例表明,这个新的杂合进化算法是有效的。     

同源基因拼接技术在酶体外进化中的应用

同源基因拼接技术是一种全新概念的酶人工定向进化策略,本文在介绍这一技术基本概念的基础上,主要对该技术的两个关键环节;突变体基因库的构建以及高通量的重组子筛选手段进行详细论述,最后对该技术在酶改性中的应用研究进展进行综述,并对其发展前景及存在问题进行评述。     

蛋白质定向进化的研究技术及应用

蛋白质定向进化是在人类改造蛋白质的过程中产生的。蛋白质定向进化通常分三步进行,即随机诱变、体外重组和筛选。每一步都有多种研究技术。蛋白质定向进化大大加速了人类改造蛋白质的步伐,在实际应用研究和基础理论研究中都具有重要意义。     

蛋白质定向进化的研究进展

定向进化是改造蛋白质分子的一种有效的新策略。主要是在实验室里模拟自然进化过程,通过由易错PCR、致突变菌株诱变等方法对编码蛋白质的基因进行随机诱变,由DNA改组、随机引导重组和交错延伸等方法进行突变基因体外重组,设计高通量筛选方法来选出需要的突变株。它不仅可快速产生工业上有用的新酶,而且对研究蛋白质的结构与功能的关系具有非常重要的意义。     

定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3 剪接活性的研究

目前,蛋白质内含子在蛋白质工程领域中得到越来越广泛的应用。为提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3(Trichodesmium erythraeum)在异源宿主中的剪接活性,采用易错PCR技术,通过改变反应体系中dNTP、Mg2+、Mn2+的浓度等手段,借助依赖卡那霉素的蛋白质内含子筛选系统进行筛选。Western印迹结果表明:通过定向进化,其中5号突变体的剪接活性从原始的约20%提高至约85%;9号突变体能够避免发生剪接副反应,即N端断裂反应。氨基酸突变位点与剪接活性变化的相关性分析表明:参与α-helix形成的氨基酸的突变极有可能影响蛋白质内含子的断裂反应,参与β-sheet形成的氨基酸的突变则有可能影响蛋白质内含子结构的紧凑性。通过定向进化提高微小蛋白质内含子Ter DnaE-3在异源宿主中的剪接活性,进一步验证依赖卡那霉素抗性的筛选系统的可行性,为扩大蛋白质内含子的应用范围奠定基础。     

蛋白质定向进化及其在微生物代谢调控中的应用

蛋白质定向进化是非理性改造蛋白质的一种有效方法。利用蛋白质定向进化技术可以改变代谢流,扩展或构建新的代谢途径,弱化或消除不必要或有害的代谢途径,从而达到提高某种代谢产物产率或降解有害物质的目的。蛋白质定向进化技术在代谢调控中的应用有效拓宽了代谢工程的应用范围。本文介绍了主要的蛋白质定向进化技术如易错PCR技术、DNA改组技术、交错延伸技术和临时模板随机嵌合技术等,评述了蛋白质定向进化技术对微生物细胞代谢中的关键蛋白进行定向改造,从而改善其代谢能力,调控微生物代谢等的应用。     

酶的分子定向进化及其应用

酶的分子定向进化是20世纪90年代初兴起的一种蛋白质工程的新策略,是一种在生物体外模拟自然进化过程的、具有一定目的性的快速改造蛋A质的方法.该方法引起了生物催化技术领域的又一次革命.目前分子定向进化技术已被广泛应用于工业、农业及制药业等的相关领域.本文详细综述了酶的分子定向进化的概念、过程、基本策略及其核心技术,并着重介绍了酶的分子定向进化技术在提高酶的活力、稳定性、底物特异性和对映体选择性等几方面的应用及取得的相关成果.     

几种定向进化技术的比较及文库构建策略

蛋白质定向进化在蛋白质工程中取得了令人瞩目的成就,其核心技术---随机突变库构建技术已成为近年来体外定向进化研究的热点。在概述定向进化基本原理基础上,对几种随机突变技术进行了介绍、分类和比较,并对突变库的特征及构建策略予以分析和描述 。     

蛋白质定向进化技术的研究进展

蛋白质定向进化技术是蛋白质分子改造的一个重要策略.重点介绍了易错PCR、DNA改组等对编码蛋白质的基因进行随机突变和重组的技术,以及构建突变体库和高通量筛选的方法,并探讨了定向进化技术在蛋白质工程中的应用及前景.     

改进酶稳定性的定向进化技术

酶作为一种生物催化剂,以其独特的优良特性,在绿色化学和清洁生产中得到了广泛的应用。随着酶定向进化技术的建立和发展,通过定向进化改进酶稳定性的研究越来越多。详细综述了各种定向进化方法的特点及在提高酶稳定性方面的应用,并从结构和功能的角度进一步解释了相关机理。     

Directed polymerase evolution

Polymerases evolved in nature to synthesize DNA and RNA, and they underlie the storage and flow of genetic information in all cells. The availability of these enzymes for use at the bench has driven a revolution in biotechnology and medicinal research; however, polymerases did not evolve to function efficiently under the conditions required for some applications and their high substrate fidelity precludes their use for most applications that involve modified substrates. To circumvent these limitations, researchers have turned to directed evolution to tailor the properties and/or substrate repertoire of polymerases for different applications, and several systems have been developed for this purpose. These systems draw on different methods of creating a pool of randomly mutated polymerases and are differentiated by the process used to isolate the most fit members. A variety of polymerases have been evolved, providing new or improved functionality, as well as interesting new insight into the factors governing activity.     

模仿自然界——基于基因高频突变的蛋白质人工进化技术

从上世纪50年代发现DNA双螺旋结构以来,科学家积累了大量的有关生物的生理和病理分子机理的知识。人们期望从生物学的基础研究中衍生出高效、环保的生物相关制造产业,为人类服务。为了发展生物制造产业,生物基础元件蛋白质和基因的制造技术必不可少。最近出现了一种基于基因高频突变的蛋白质人工进化技术。这一技术已成功应用于新抗体的产生,以及抗体和荧光蛋白质的改造。这一技术的进一步发展将成为蛋白质改造、乃至新蛋白质制造的重要工具。