His-FemA融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的 构建His标签的金黄色葡萄球菌甲氧西林耐药相关蛋白FemA的融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌中表达,为进一步研究femA基因的生物学功能和临床应用奠定基础.方法 根据GenBank中金黄色葡萄球菌femA基因序列,利用Primer Premier 5.0设计PCR引物,并在引物的5'加入BamHI及SalI酶切位点;以金黄色葡萄球菌基因组DNA为模版,PCR扩增出femA基因片段.将目的DNA片段及质粒pQE30分别进行双酶切、连接并转化大肠埃希菌DH5α;阳性克隆以PCR、双酶切及测序进行鉴定.将鉴定正确的pQE30-femA重组质粒转化大肠埃希菌JM109,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达His-femA融合蛋白;采用SDS-PAGE及Western blot分析对表达蛋白进行验证.结果 经PCR、双酶切签定及序列测定,证实重组质粒pQE30-femA构建成功;重组质粒pQE30-femA转化大肠埃希菌JM109经IPTG诱导后,SDS-PAGE和Western blot分析显示表达出53 kD目的蛋白;经Bandscan软件分析,目的蛋白质在4h的表达量占细胞总蛋白的27.5％.结论 成功构建了His-FemA原核表达载体(pQE30-femA),并在大肠埃希菌中高效表达.     

阴道毛滴虫黏附蛋白65-3基因原核表达质粒的构建及表达

质粒 pMD-18T-ap65-3 经 Xho I 和 BamH I 双酶切, 1.0% 凝胶电泳后纯化回收阴道毛滴虫黏附蛋白 65-3 基因,定向克隆至原核表达载体 pET-32a( ), 构建原核表达质粒 pET32a-ap65-3. 重组质粒转化大肠埃希菌 JM109 感受态细胞中, 筛选阳性克隆, 进行PCR﹑酶切及测序鉴定正确后, 将重组质粒 pET32a-ap65-3 转化于大肠埃希菌 BL21 中,异丙基-β-D硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导重组蛋白表达后利用十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 和免疫印迹 (Western blot) 对重组蛋白进行分析鉴定. 本实验为研究阴道毛滴虫病的致病机制及蛋白生物学功能奠定了基础.     

高赖氨酸蛋白基因在大肠埃希菌中的表达

从四棱豆中克隆高赖氨酸蛋白基因wblys,通过PCR扩增wblys片段,转入原核表达载体pGEX-4T-1,构建pGEX-4T-1/wblys大肠埃希菌工程菌,表达重组蛋白,IPTG诱导后,发现细菌全蛋白在44 ku(含GST标签)处多出1条明显条带。HPLC检测赖氨酸含量。诱导后菌体总赖氨酸含量比正常菌体提高15.84 mg/g。在大肠埃希菌中高效表达植物源高赖氨酸蛋白基因,为该基因在益生菌中表达提供研究工作基础。     

UHRF2结构域突变体的原核表达与纯化

目的构建UHRF2各个以结构域为基础的突变体原核表达载体,在大肠埃希菌中表达并对融合蛋白进行纯化和鉴定。方法以pCMV-3xFlag—UHRF2为模板,PCR扩增UHRF2的各个结构域基因片段,各PCR产物经酶切后连接到pGEX-4T-1载体上;将重组载体转化大肠埃希菌（BL21菌株）,IPTG诱导表达各GST融合蛋白,超声波破碎细菌,离心收获蛋白并经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B（glutathione sepharose 4B）亲合纯化;纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色或免疫印记实验鉴定各蛋白表达情况。结果成功构建了UHRF2结构域突变体的原核表达载体,各突变体蛋白表达正确。结论UHRF2各结构域突变体的成功构建便于用GST pull—down实验研究UHRF2参与与其它蛋白相互作用的结构域,为了解UHRF2功能打下了基础。     

PHD2基因原核表达载体的构建及其在大肠埃希菌中的表达

目的构建PHD2基因原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,实现Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达。方法用SacⅠ酶切pET-43.1b（＋）制备线性化载体,设计与线性化载体两端具有至少15个同源序列的特异性引物,以真核重组质粒pCMV6-Entry-EGLN1为模板,PCR法扩增PHD2目的基因。采用In-Fusion技术构建原核表达载体pET-43.1b（＋）-PHD2,并将其导入大肠埃希菌BL21（DE3）中诱导表达。用SDS-PAGE和Western blot分析并鉴定表达出的融合蛋白。用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白。结果成功构建了PHD2原核表达载体;SDS-PAGE结果显示融合蛋白以可溶性形式表达;Western blot鉴定表明融合蛋白可以与PHD2单克隆抗体特异性结合。结论实现了Nus-PHD2融合蛋白在大肠埃希菌中的可溶性表达,为PHD2生物学功能的研究奠定了基础。     

重组原核质粒GST-hTudor-SN-SN（1～4）的构建及表达

目的 将人类Tudor-SN（tudor staphylococcal nuelease）蛋白SN（1～4）基因片段分别定向连入pGEX-4T-1质粒,使Tudor-SN蛋白sN各功能片段与（;＂蛋白在大肠埃希菌BL21细胞内融合表达.方法 以重组质粒pSG5-Tudor-SN-flag为模板,PCR法扩增出目的 基因,利用EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切法将目的 片段连接纠pGEX-4T-1载体卜,再将构建成功的GST-hTudor-SN-SN（1～4）重组质粒转化人大肠埃希菌BL-21内,IPTG诱导表达后再以考马斯亮蓝染色法检测GST融合蛋白的表达.结果 以单/双酶切和基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,考马斯亮监染色法观察到GST融合蛋白的正确表达.结论 重组原核GST.hTudor-SN-SN（1-4）质粒成功构建和表达.     

布鲁菌bp26基因的原核表达及间接ELISA方法的临床初步应用

构建诊断人布病的优势抗原BP26原核表达载体,并建立以该蛋白作为包被抗原的间接ELISA方法。人工合成bp26基因片段,构建原核表达载体pET30a-bp26,并转化入大肠埃希菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达,Ni柱亲和纯化BP26重组蛋白,间接ELISA检测其抗原活性,并优化间接ELISA方法的各个参数,检测临床大量样本,对该方法性能进行评价。PCR鉴定及DNA测序证实pET30a-bp26重组质粒构建成功,并在0.8 mmol/L IPTG 20 ℃过夜诱导的条件下大量表达,经亲和纯化获得高纯度的可溶性BP26重组蛋白,间接ELISA结果显示该重组蛋白具有抗原活性,优化参数后,该方法的敏感度为70.00%,特异性为94.74%。成功获得高抗原活性的原核表达可溶性BP26重组蛋白,并建立用于临床特异性诊断人类布病的间接ELISA方法。     

幽门螺杆菌重组vacA-ctxB蛋白的基因克隆与表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)vacA毒性片段与霍乱毒素B亚单位(ctxB)基因的原核表达载体,并诱导表达VCTB重组蛋白,为制备防治H.pylori感染的口服疫苗奠定基础。方法以H.pylori基因组DNA为模板,PCR扩增vacA毒性片段基因,克隆至质粒pQE30中,获得重组质粒pQE30-vacA。再以pET32(a) -ctxB质粒为模板PCR扩增ctxB目的基因并插入pQE30-vacA中,构建含双基因的表达质粒pQE-vctB。克隆至大肠埃希菌Top10,并在DH5α中诱导表达。SDS-PAGE分析表达结果,Ni-NTA柱纯化后Western blot鉴定其抗原性,免疫家兔后ELISA法检测血清中VacA和CtxB抗体鉴定其免疫原性。结果vacA的DNA片段为723 bp左右。ctxB基因的DNA片段为372 bp左右,与预计长度相符合。测序结果vctB融合基因由1092 bp组成,编码364个氨基酸残基的多肽,与基因文库相符。表达蛋白VCTB经SDS-PAGE分析,相对分子量为40 000,与预期的一致;表达量约占菌体总蛋白的20%,提纯后SDS-PAGE分析可见单一条带,纯度可达92%以上。Western blot鉴定能与抗VacA人血清发生特异性反应,ELISA测定能与抗ctxB兔血清发生特异性反应。结论含vctA和ctxB融合基因的表达载体构建成功,并在大肠埃希菌DH5α中表达了重组蛋白质VCTB,表达蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,可用于制备口服疫苗。     

肺炎支原体双蛋白多抗原表位表达载体的构建

目的构建肺炎支原体(Mp)双蛋白多特异抗原表位表达载体,提高重组蛋白抗原的敏感性。方法应用生物信息学方法筛选Mp P116粘附蛋白抗原表位序列,PCR点突变技术获取P116蛋白基因片段,与pMD-T载体重组,转入大肠埃希菌JM109,通过限制性酶切图谱和基因序列分析鉴定重组质粒。酶切回收P116基因片段与pGEX 6P-1-P1 DNA重组,转入大肠埃希菌JM109菌株。用Glutathione Sepharose 4B纯化重组蛋白,SDS-PAGE分析表达产物的相对分子量,用Mp免疫血清进行免疫印迹试验,鉴定重组蛋白的免疫原性。结果 PCR点突变扩增Mp黏附蛋白P116的基因片段为597 bp,该基因片段与已知的基因库序列分析比较,除两个突变位点由UAG突变为UGG外,其余核苷酸序列同源性为100%。SDS-PAGE分析多表位重组蛋白相对分子质量(Mr)为77.8 kDa。免疫印迹结果显示,Mp兔多价血清能与纯化的78KDa的重组蛋白发生免疫反应。结论本研究成功构建了Mp双蛋白多表位的表达载体。该表达载体表达的重组蛋白具有Mp特异的免疫反应性。重组蛋白的敏感性有待进一步鉴定。     

沙门菌毒力基因spvB的原核表达及其多克隆抗体的制备

目的:构建沙门菌毒力基因spvB的原核表达载体,诱导表达纯化SpvB蛋白并以其为抗原免疫小鼠,制备多克隆抗体。方法:利用生物信息学软件对SpvB进行分析,选取抗原性较高、易表达的氨基酸序列作为克隆序列,以携带spvB基因的鼠伤寒沙门菌为模板,PCR扩增目的片段后与原核表达载体pET28a(+)连接;将质粒pET28a-SpvB转化大肠埃希菌BL21(DE3)后诱导表达并纯化。目的蛋白免疫小鼠,制备抗SpvB多克隆抗体,Western blot检测抗体特异性。结果:成功构建spvB原核表达载体,经IPTG诱导结果显示,重组蛋白表达且主要存在于包涵体中,将纯化后的蛋白免疫小鼠Western blot检测血清中抗体与SpvB特异性结合。结论:获得具有免疫原性的SpvB蛋白及其多克隆抗体,为进一步研究该基因的功能奠定基础。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

医疗机构合理用药评价模型的构建研究

目的 针对医疗机构的合理用药水平进行评价研究。方法 根据医疗机构合理用药的具体要求,构建医疗机构合理用药评价指标体系,采用基于模糊群决策的方法和多指标评价分析法构建医疗机构合理用药评价模型。结果 构建了基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型,并通过实例分析证明了评价模型的可行性。结论 建立的基于模糊群决策的医疗机构合理用药评价模型能够对医疗机构的合理用药水平进行科学评价,为提高医疗机构合理用药水平奠定基础。     

棉铃虫钙粘蛋白N端多肽多克隆抗体制备及对Bt抗性的初步检测

用重组表达的棉铃虫Helicoverpa armigera(Hübner)中肠钙粘蛋白N端多肽片段制备兔多克隆抗体,并利用其对Bt抗性进行鉴定。通过RT-PCR方法对棉铃虫中肠钙粘蛋白N端多肽的基因片段Cad285进行PCR扩增,将其克隆到pET-30a原核表达载体中,在大肠杆菌BL21(DE3)中经IPTG诱导表达,得到35ku的重组融和蛋白,融合表达的包涵体经过变性、Ni-NTA柱亲和纯化、复性等方法处理包涵体,获得可溶性纯化蛋白,用纯化后蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA检测其效价高于1∶16000;利用最终获得的多克隆抗体对室内纯合Bt抗/感品系的棉铃虫中肠钙粘蛋白进行Western blot分析,结果显示敏感和抗性品系之间有明显差异,表明其能够应用对Bt抗性进行初步检测。     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

青蒿素生物合成机理研究现状

本文总结了目前有关青蒿素生物合成机理方面的研究,主要包括青蒿素生物合成中生理因子的影响,青蒿素生物合成中间体及前体,青蒿素生物合成细胞定位等。指出了存在的一些问题及今后的研究发展前景。     

Time of detection of recessive genes: effects of system of mating and number of examined individuals

Summary Anthers were cultured from two sets of seven lines of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) with different cytoplasms, the euplasmic nucleus donors, Siete Cerros 66 and Penjamo 62, as well as their six alloplasmic lines derived from wild relative species of the genera Triticum and Aegilops. Significant cytoplasmic and nuclear effects but no cytoplasmic-nuclear interaction were found for embryogenic anther response, with the best performance of Penjamo 62 in Ae. kotschyi cytoplasm. Plant regeneration was not affected significantly by the cytoplasmic background of the lines cultured. The possible genetic implications of the observed cytoplasmic and nuclear influences on the in vitro haploid induction of wheat are discussed.