微生物分子生态学发展历史及研究现状

微生物群落多样性是微生物生态学和环境学研究的重点之一。分子生物学方法应用于微生物群落结构分析使得对环境样品中占大多数的不可培养微生物的研究成为了可能。由于功能上高度保守,序列上的不同位置具有不同的变异速率,核糖体RNA（rRNA）是目前在微生物分子生态学上最为有用以及应用最广泛的分子标记,通过rRNA序列比对,可以分析不同分类水平的系统发育关系。元基因组学研究方法通过对环境样品中的各种微生物群落的总的基因组进行分析,充分展示了环境微生物代谢途径,极大地扩展了对微生物的认识。快速发展的高通量测序极大地促进了各项微生物生态学技术的发展,带来了新的突破。     

深海沉积物微生物元基因组文库来源的新的酯酶基因的克隆、表达及酶学性质

【目的】从深海沉积物微生物元基因组文库中克隆新的酯酶基因,并进行酶学性质研究。【方法】利用含有三丁酸甘油酯的酯酶选择性筛选培养基,从深海沉积物微生物元基因组文库中筛选得到酯酶阳性Fosmid克隆。对筛选得到的fosmid FL10进行部分酶切构建亚克隆文库,筛选得到酯酶阳性亚克隆pFLS10。PCR扩增目的片段后与pET28a连接构建酯酶基因原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21。纯化表达产物并对其进行活性测定及酶学性质研究。【结果】序列分析显示该pFLS10亚克隆质粒含有一段924bp的ORF(Open Reading Frame),与一海洋元基因组文库中筛选出的酯酶ADA70030序列一致性为71%。该酶为一新的低温酯酶,对C4底物(对硝基苯丁酸酯)水解能力最强。该酶最适作用温度为20℃,最适作用pH为7.5,20℃时较为稳定,pH8-10的范围内有良好的pH稳定性,K+、Mg2+对该酶具有一定的激活作用,Mn2+等对其具有不同程度的抑制作用。【结论】应用元基因组技术筛选到了新的酯酶基因fls10并进行了克隆表达,该酶在低温及碱性条件下较为稳定且活力较高,对于工业化生产具有一定的应用潜力。关键词:深海沉积物;元基因组文库;低温酯酶;酶学特征     

宏基因组学的研究方法进展及应用概述

宏基因组学是以某一特定环境样品中的微生物群体基因组为研究对象,通过提取DNA、构建文库、文库筛选等基本流程来研究微生物多样性、进化关系以及寻找新基因等为研究目的的新的微生物学研究方法,其总体流程包括环境样品总DNA提取、宏基因组文库构建、宏基因组文库筛选三个阶段。宏基因组学做为一个崭新的技术在微生物生态学、生物酶制剂开发以及医学等方面都取得了可喜的成绩。本文将就宏基因组学的概念、技术流程和应用三个方面作简单介绍。     

RNA干扰文库在功能基因组学研究中的发展及应用

RNA干扰（RNAi）是双链RNA分子在mRNA水平上诱发的序列特异性转录后基因表达沉默,从基因组水平设计针对多个靶基因的RNAi序列,建立RNAi文库进行系统性、大规模的筛选工作是功能基因组学研究的有力工具。目前RNAi文库主要包括质粒（或病毒）文库、siRNA表达盒文库、寡核苷酸文库和随机RNAi文库,已经被成功应用于基因功能鉴别、信号转导途径解析和药物靶标筛选等研究领域。近年来,这一领域发展迅速,本文就RNAi文库的发展应用以及存在的问题与展望进行综述。     

高通量分析技术在资源微生物及功能基因发掘中的应用

随着新的微生物资源不断被发现以及微生物基因组测序数据的积累和完善,目前研究重点和难点是如何从大量数据中快速发现和鉴定与微生物重要表型相关的功能基因,这就需要高通量的分析研究手段,主要涉及建库和筛选两个主要技术单元。其中,建库是指构建能够覆盖微生物全基因组的突变或干扰文库,所涉及的技术包括宏基因组、转座子插入突变、RNA干扰(RNA interference,RNAi)、反转录子文库重组工程(retron library recombineering,RLR)、CRISPR抑制(CRISPRi)和CRISPR激活(CRISPRa)等。筛选则是通过某种胁迫压力来促使文库菌群的差异化生长,并结合高通量测序全面发掘与特定表型相关的功能基因,从而为后续研究提供有效信息。本文对功能基因组学研究中现有的高通量分析技术进行了梳理、总结和展望,以期为这类技术方法的拓展、优化以及应用提供参考。     

宏基因组学研究进展

不可培养微生物占据微生物总数的99%以上, 这己成为微生物资源开发利用的一个限制性因素。宏基因组学是通过提取某一环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库及对文库进行筛选寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法。它避开了微生物分离培养的过程, 极大地扩展了微生物资源的利用空间, 是现代基因工程一个新的发展方向和研究热点。本文主要对宏基因组的DNA提取方法、文库的构建、筛选策略的选择及近年来宏基因组学在各领域中的应用研究现状进行了综述。     

微卫星标记在分子生态学中的应用及其位点的分离策略

微卫星DNA作为一种优良的遗传标记在分子生态学领域得到了广泛应用,本文综述了其在分子种群生物学、分子环境遗传学、分子适应等研究领域中的应用情况.微卫星位点的获得是开展各项研究的前提,传统的构建微卫星文库再杂交筛选的方法工作量大、效率低,因而在实践过程中又产生了富集文库法、PIMA法、FIASCO法等新的分离策略.本文对几种微卫星位点分离技术进行介绍并对其进行分析比较,为分子生态学研究过程中微卫星位点筛选方法的选择提供参考.     

微生物分子生态学技术在污水处理系统中的应用

微生物分子生态学作为分子生物学与微生物生态学交叉而形成的学科,在污水处理方面广泛应用。本文从分子生态学实验技术角度,综述了目前污水处理系统中微生物群体结构、多样性及其与功能相关性的研究进展,探讨了分子生态学技术的发展与应用前景,并指出研究该体系微生物对于认识微生物系统发育地位具有重要意义。     

宏基因组学挖掘新型生物催化剂的研究进展

微生物蕴藏着大量具有工业应用潜力的生物催化剂。然而,传统培养方法只能从环境中获得不到1%的微生物。宏基因组学是通过提取某一特定环境中的所有微生物基因组DNA、构建基因组文库并对文库进行筛选,寻找和发现新的功能基因的一种方法。它绕过了微生物分离培养过程,成为研究环境样品中不可培养微生物的有力手段。因此,从宏基因组中挖掘新型生物催化剂一直倍受生物学家的关注。以下主要对宏基因组文库的样品来源、DNA提取方法、文库的构建和筛选策略的选择这4个方面的研究状况进行了综述,列举了近年来利用宏基因组技术所获得的新型生物催化剂,并对其今后的研究方向提出了展望。     

环境微生物不依赖于培养的基因组学研究及应用

微生物在生物圈中分布广泛,并且在地球物质循环中占有重要地位,但是约99﹪的微生物目前还不能通过传统的培养方法得到纯培养物（即未培养微生物）,给这些未培养微生物的研究带来很大的困难。随着分子生物学的快速发展及其在微生物研究中的广泛运用,促进了以环境中未培养微生物为研究对象的新兴学科--环境基因组学的产生和发展。在不进行相关微生物培养分离的情况下,通过从环境样品中直接提取获得所有微小生物的全部遗传物质,并构建环境基因组文库;进一步利用功能基因组学研究策略,从文库中寻找编码产生新的有生物活性产物的基因;通过对系统发育相关锚定位点基因序列分析,从而确定特定生态环境体系中未培养微生物的种类结构组成及进化地位,并最终重建该体系中微生物群体的基本物质循环模式。此外,环境基因组学也可以在对未培养微生物生理生化特性深入了解的基础上,建立发展合适的培养体系,最终获得某些特定微生物的纯培养物。本文对环境基因组的构建及相关分析研究策略的进展进行了综述;同时介绍了其在微生物分类及生态学研究的应用。     

空气微生物群落解析方法:从培养到非培养

随着世界范围内流行性疾病以及我国空气雾霾事件的不断发生,空气生物性污染的研究开始受到高度重视,其研究方法也随着分子生物学技术的快速发展而不断更新,由早期以生化技术为基础的研究方法转变为以现代分子生物学技术为基础的研究方法。综述了空气微生物群落多样性解析方法从培养到非培养的发展过程,包括培养技术法、BIOLOG技术、生物标记法、基因指纹图谱技术、核酸杂交技术、实时荧光定量PCR、空气微生物宏基因组学及基因芯片技术,阐述了这些技术的基本原理,比较了各种技术的优缺点并重点介绍了它们在空气微生物群落多样性研究中的应用概况,最后展望了空气微生物学研究的发展方向。     

微生物分子生态学研究方法的新进展

环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点,长期以来,由于受到研究技术的限制,对微生物的群落结构和多样性的认识还不全面,微生物的功能及代谢机理方面了解也很少.随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新,微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化.高通量测序技术改变了微生物多样性、宏基因组学和宏转录组学的研究方法,GeoChip高密度覆盖海量已知功能的基因探针于单张芯片,能快速确定微生物和已知功能基因的存在与否.总结和比较了目前最新的研究手段,并归纳了这些方法的适用性和优缺点.     

微生物生态学理论框架

微生物是生态系统的重要组成部分,直接或间接地参与所有的生态过程。微生物生态学是基于微生物群体的科学,利用微生物群体DNA/RNA等标志物,重点研究微生物群落构建、组成演变、多样性及其与环境的关系,在生态学理论的指导和反复模型拟合下由统计分析得出具有普遍意义的结论。其研究范围从基因尺度到全球尺度。分子生物学技术的发展,使人们可以直接从基因水平上考查其多样性,从而使得对微生物空间分布格局及其成因的深入研究成为可能。进而可以从方法学探讨微生物生物多样性、分布格局、影响机制及其对全球变化的响应等。在微生物生态学研究中,群落构建与演化、分布特征(含植物-微生物相互关系)、执行群体功能的机理(生物地球化学循环等)、对环境变化的响应与反馈机理是今后需要关注的重点领域。概述了微生物生态学的概念,并初步提出其理论框架,在对比宏观生态学基础理论和模型的基础上,分析微生物多样性的研究内容、研究方法和群落构建的理论机制,展望了今后研究的重点领域。     

Microbial Biofilms: from Ecology to Molecular Genetics

Biofilms are complex communities of microorganisms attached to surfaces or associated with interfaces. Despite the focus of modern microbiology research on pure culture, planktonic (free-swimming) bacteria, it is now widely recognized that most bacteria found in natural, clinical, and industrial settings persist in association with surfaces. Furthermore, these microbial communities are often composed of multiple species that interact with each other and their environment. The determination of biofilm architecture, particularly the spatial arrangement of microcolonies (clusters of cells) relative to one another, has profound implications for the function of these complex communities. Numerous new experimental approaches and methodologies have been developed in order to explore metabolic interactions, phylogenetic groupings, and competition among members of the biofilm. To complement this broad view of biofilm ecology, individual organisms have been studied using molecular genetics in order to identify the genes required for biofilm development and to dissect the regulatory pathways that control the plankton-to-biofilm transition. These molecular genetic studies have led to the emergence of the concept of biofilm formation as a novel system for the study of bacterial development. The recent explosion in the field of biofilm research has led to exciting progress in the development of new technologies for studying these communities, advanced our understanding of the ecological significance of surface-attached bacteria, and provided new insights into the molecular genetic basis of biofilm development.     

Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.

Biofilms are complex communities of microorganisms attached to surfaces or associated with interfaces. Despite the focus of modern microbiology research on pure culture, planktonic (free-swimming) bacteria, it is now widely recognized that most bacteria found in natural, clinical, and industrial settings persist in association with surfaces. Furthermore, these microbial communities are often composed of multiple species that interact with each other and their environment. The determination of biofilm architecture, particularly the spatial arrangement of microcolonies (clusters of cells) relative to one another, has profound implications for the function of these complex communities. Numerous new experimental approaches and methodologies have been developed in order to explore metabolic interactions, phylogenetic groupings, and competition among members of the biofilm. To complement this broad view of biofilm ecology, individual organisms have been studied using molecular genetics in order to identify the genes required for biofilm development and to dissect the regulatory pathways that control the plankton-to-biofilm transition. These molecular genetic studies have led to the emergence of the concept of biofilm formation as a novel system for the study of bacterial development. The recent explosion in the field of biofilm research has led to exciting progress in the development of new technologies for studying these communities, advanced our understanding of the ecological significance of surface-attached bacteria, and provided new insights into the molecular genetic basis of biofilm development.     

分子生物学方法在环境微生物生态学中的应用研究进展

随着分子生物学方法的不断发展和改进,微生物在生态系统中的作用被更好的挖掘出来。目前快速发展的先进的分子生物学技术,已经开始应用于分析环境微生物的多样性、微生物的生物地理学及微生物对气候变化的响应等。一般环境微生物的研究目标主要有3个,即确定微生物的种类和多样性、微生物的功能或潜在作用及在特定时间点活跃的微生物等。然而,现有微生物的研究方法复杂多样,容易给研究者在方法的选择上带来困惑。将从微生物的多样性和功能研究两个方面介绍和分析相应的分子生物学方法,尤其是近年来快速发展的高通量测序、宏组学和单细胞水平研究方法(如纳米二次离子质谱与荧光原位杂交相结合的方法)等新技术及其应用情况,以期为研究者选择合适的研究方法进行环境微生物的研究提供依据。     

Molecular community analysis of microbial diversity

New technologies that avoid the need for either gene amplification (e.g. microarrays) or nucleic acid extraction (e.g. in situ PCR) have recently been implemented in microbial ecology. Together with new approaches for culturing microorganisms and an increased understanding of the biases of molecular methods, these techniques form the most exciting advances in this field during the past year.     

Microbial signature lipid profiling and exopolysaccharides: experiences initiated with Professor David C White and transported to Tasmania, Australia

Developments and applications with signature lipid and exopolysaccharide (EPS) methodologies covering a thirty year period in the DC White laboratories at Florida State University and the University of Tennessee at Knoxville are illustrated. These powerful techniques were used to gain new insight into microbial communities, not obtainable by classical approaches. Selected case examples are highlighted and include: use of a specific dimethyl disulphide (DMDS) derivitization procedure with monounsaturated fatty acids (MUFA) to precisely determine double bond position and geometry; application of the DMDS procedure in taxonomic and environmental studies including the degradation of pollutant halogenated hydrocarbons in groundwater and subsurface aquifers; exploiting the ubiquitous nature of uronic acids in microbial EPS to quantify these exopolymers in complex environmental samples; development of rapid and non-destructive approaches including FT-IR to follow biofilm formation in a unique manner not possible with other approaches. The foundations laid in the DC White laboratories have seen a wide suite of applications in modern microbial ecology and associated fields. The training of young scientists by DC White will also ensure that his unique approach and quest for new and or novel methodologies for use in environmental microbiology will continue.     

环境DNA技术在地下生态学中的应用

地下生态过程是生态系统结构、功能和过程研究中最不确定的因素。由于技术和方法的限制,作为"黑箱"的地下生态系统已经成为限制生态学发展的瓶颈,也是未来生态学发展的主要方向。环境DNA技术,是指从土壤等环境样品中直接提取DNA片段,然后通过DNA测序技术来定性或定量化目标生物,以确定目标生物在生态系统中的分布及功能特征。环境DNA技术已成功用于地下生态过程的研究。目前,环境DNA技术在土壤微生物多样性及其功能方面的研究相对成熟,克服了土壤微生物研究中不能培养的问题,可以有效地分析土壤微生物的群落组成、多样性及空间分布,尤其是宏基因组学技术的发展,使得微生物生态功能方面的研究成为可能;而且,环境DNA技术已经在土壤动物生态学的研究中得到了初步应用,可快速分析土壤动物的多样性及其分布特征,更有效地鉴定出未知的或稀少的物种,鉴定土壤动物类群的幅度较宽;部分研究者通过提取分析土壤中DNA片段信息对生态系统植物多样性及植物分类进行了研究,其结果比传统的植物分类及物种多样性测定更精确,改变了以往对植物群落物种多样性模式的理解。同时,环境DNA技术克服传统根系研究方法中需要洗根、分根、只能测定单物种根系的局限,降低根系研究中细根区分的误差,并探索性地用于细根生物量的研究。主要综述了基于环境DNA技术的分子生物学方法在土壤微生物多样性及功能、土壤动物多样性、地下植物多样性及根系生态等地下生态过程研究中的应用进展。环境DNA技术对于以土壤微生物、土壤动物及地下植物根系为主体的地下生态学过程的研究具有革命性意义,并展现出良好的应用前景。可以预期,分子生物学技术与传统的生态学研究相结合将成为未来地下生态学研究的一个发展趋势。