大乳头水螅RACE cDNA文库的构建

目的:为筛选和克隆大乳头水螅发育调控相关基因的全长cDNA,构建大乳头水螅RACE cDNA文库.方法:提取大乳头水螅总RNA后从其中分离mRNA,运用SMART技术构建RACE cDNA文库.为鉴定所构建文库的质量,根据GenBank中大乳头水螅actin基因cDNA序列设计5'RACE和3'RACE的引物及用于扩增actin基因编码区全长序列的引物.结果:琼脂糖凝胶电泳结果表明,RACE cDNA文库中全长cDNA的长度集中在500-2 000bp之间.5'RACE、3'RACE PCR及扩增actin基因编码区全长序列时均以本文构建的大乳头水螅RACE cDNA文库为模板,这3个PCR反应均能扩增出产物,产物大小与目标片段预计大小相似.PCR产物分别经T/A克隆及测序后证明为大乳头水螅actin基因cDNA的相应序列.结论:RACE cDNA文库的成功构建为通过RACE方法获得大乳头水螅功能基因cDNA全长序列奠定了基础.     

SMART技术构建栀子cDNA文库

目的:构建栀子叶片cDNA文库。方法:提取栀子叶片总RNA。利用SMART技术合成双链cDNA。双链cDNA经限制酶Sfil酶切后与pDNR-LIB质粒连接。利用电刺激转化法将重组质粒导入E.coli DH5α而获得文库。利用PCR法检测文库的重组率。结果:原始文库滴度为2.63×105cfu/ml。随机检测文库中的15个克隆,表明重组率约为86.7%。选择14个插入片段的长度在400bp以上的克隆进行测序和生物信息学分析,结果预测的全长基因占所检测序列的64.3%。结论:成功构建了栀子叶片的cDNA文库,为栀子基因的结构和功能的研究提供了基础。     

cDNA文库技术在植物抗旱机制研究中的应用

cDNA文库是指生物不同生长发育时期特定组织或器官所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA与载体连接后形成的克隆的集合,在基因分离、克隆及功能研究中具有重要作用.就cDNA文库构建及其在植物抗旱机制研究中的应用进行综述.     

cDNA文库的构建策略及其应用

cDNA文库在基因分离和克隆中具有重要的作用。从cDNA文库中能筛选出所需要的目的基因,并直接用于该目的基因的表达。cDNA文库是发现新基因和研究基因功能的基础工具。随着分子生物学技术的发展。cDNA文库构建方法有了很大改进和提高,就cDNA文库的构建方法及其应用进行综述。     

水杨酸诱导湖北海棠全长cDNA文库的构建及应用

以'湖北海棠'为材料,经水杨酸处理后,用改良CTAB法提取总RNA,纯化后构建全长cDNA文库,并进行PGIP基因的克隆.结果表明:(1)提取的总RNA无降解,无污染;mRNA弥散带主要集中在500～2 000 bp左右,没有rRNA 残留.(2)ds cDNA弥散带主要分布于300～2 000 bp之间,PCR验证后片段大小分布于200～2 000 bp之间,说明合成ds cDNA质量较好,成功地构建了全长cDNA文库.(3)通过PCR从该cDNA文库中克隆了PGIP基因,命名为MhPGIP,GenBank登录号为FJ449708;其核苷酸序列及推导氨基酸序列与苹果的一致性分别为98%和97%,该序列含有两个串联的亮氨酸重复序列.综上所述,构建的全长cDNA文库质量很好,该文库的建成可以用于今后抗病新基因的挖掘、克隆和利用,为苹果抗病机理的研究奠定基础.     

基因组研究中全长cDNA克隆的策略

全长cDNA的克隆是目前人类基因组研究中的一个重要方面,与大规模基因组测序相比较,cDNA测序克隆用相对较少费用获得更多的功能基因信息,故也是符合我国国情的基因组研究的主要方向。如何更加高效地获得新的全长cDNA,本文结合作者自己工作中的经验,对从全长文库的建立到全长cDNA的测序及克隆方法作了较为详细的介绍。     

被孢霉cDNA文库的构建及△^9脂肪酸脱饱和酶cDNA序列的筛选

为了克隆被孢霉不饱和脂肪酸生物合成途径的相关酶基因,构建了基于λgt10的被孢霉cDNA文库.cDNA文库库容量为2×106pfu.以已克隆的被孢霉△9脂肪酸脱饱和酶保守区cDNA为探针对被孢霉cDNA文库进行筛选.经过两轮筛选获得1个阳性克隆,其插入片段长度大于1.6kb.     

鼻咽癌组织cDNA文库的构建及抗原基因的筛选

构建人鼻咽癌组织cDNA文库,以SEREX方法从cDNA文库中筛选鼻咽癌抗原基因。采用确诊鼻咽癌患者新鲜活检癌组织构建cDNA文库,测定原始文库滴度,进行蓝白筛选以确定文库的重组率。以建库组织来源患者的自身血清,采用“一对一” 的血清学方法筛选所构建的cDNA文库,阳性克隆经PCR检测鉴定后进行序列分析。经测定原始文库滴度为7.28×10⁶pfu/mL,含3.64×10⁶个重组子,重组率为94%,扩增文库滴度为3.8×10⁹pfu/mL,cDNA插入片段大小在0.5～3.0kb之间。文库经三轮血清学筛选共获得23个阳性克隆,分别代表了16个独立的cDNA插入片段（抗原基因）。其中10个与已知基因高度同源,另外6个基因与GenBank中已知基因的部分同源,其中有3个是新基因。利用SMART技术构建了高质量的人鼻咽癌组织cDNA表达文库,有利于以cDNA文库为基础的进一步的实验研究。应用SEREX技术初步筛选鼻咽癌组织cDNA文库,共得到16个鼻咽癌相关抗原基因,其中有3个是新基因,可能为鼻咽癌的免疫学研究提供新的研究分子。     

毛竹笋全长cDNA文库构建

Gateway技术构建cDNA文库,利用了λ噬菌体的位点特异性重组,避免使用限制性内酶切割cDNA,能够解决常规方法构建cDNA文库的技术缺陷。应用Gateway技术构建毛竹笋cDNA文库,经检测cDNA入门文库的滴度达到1.7×106cfu/mL,文库总容量为8.5×106cfu,平均插入片段在1.0 kb以上。毛竹笋文库的构建为进一步克隆毛竹纤维化分子机理打下了基础。     

用限制性cDNA文库制作K562细胞基因表达谱芯片探针

以人红白血病K562细胞为材料,应用限制性显示PCR（RD-PCR）技术构建cDNA文库,该文库通过PCR引物3′端延伸两个不同碱基形成136对引物对cDNA进行限制性扩增,得到136组不同的PCR扩增产物,纯化后与载体连接并转化细菌,即为限制性cDNA文库,根据不同的分组进行克隆的鉴定和分离。并进行大量扩增制备cDNA芯片探针,该方法构建的文库因经过了限制性分组扩增,每组均含有特定的cDNA,因而大大加快了随后克隆的分离 和鉴定的速度,为基因芯片探针制备提供了一个新方法。     

麋鹿血液cDNA文库的构建

为分离出MHCⅠ、Ⅱ基因,利用TRIzol 试剂从麋鹿血液组织中提取总RNA,经mRNA 纯化试剂盒纯化后,根据Stratagene 公司的cDNA 文库构建系统构建了麋鹿血液组织的cDNA 文库。初始文库滴度为1.96 ×106 pfu/ ml,总库容为1.96 ×106 个独立克隆;cDNA 插入片段平均长度约为1.0 kb;重组率为95.6 % 。文库各项指标均达标准经典cDNA 文库的基本要求。利用本实验室设计的可扩增MHCⅡ类DQA 基因第二外显子的引物检测扩增后的文库,得到了特异性非常好的目标条带,说明本文所建文库可以用于麋鹿MHC 相关基因的分离。     

东亚三角涡虫cDNA文库的构建及EST初步分析

为了快速高效地分离鉴定东亚三角涡虫的发育和再生相关基因,以总RNA为模板,借助CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit和Advantage 2 PCR Kit成功构建了东亚三角涡虫的cDNA文库.经测定,cDNA文库原始库容为1.22×105个独立克隆,重组率超过98 %,插入片段平均大小为900 bp.从文库中随机挑选重组克隆测序,并在NCBI数据库中比对,结果获得208个rRNA基因,148个编码蛋白基因,78个染色体片段基因.该研究为我国涡虫发育和再生的深入研究奠定了坚实的分子基础.     

烤烟品种南江3号均一化全长cDNA文库构建

目的:为了获得功能基因的信息,构建烤烟品种南江3号的均一化cDNA文库.方法:用RNeasy Plant Mini Kit提取烤烟南江3号叶片和花的RNA,用反转录酶逆转录合成第一链eDNA.以LD-PCR扩增获得的双链cDNA为模板,采用基于双链特异性核酸酶(Duplex-Specific Nuclease,DSN)的均一化cDNA文库技术,构建南江3号盛花期的均一化cDNA文库.结果:构建了南江3号盛花期的均一化cDNA文库,文库重组率大为97.47%,库容量约为1.26×10<'6>,插入片段平均长度大于1.2kb.从文库中随机48个克隆进行PCR检测,挑取20个克隆进行测序,序列通过BLAST比对结果显示文库可能包含大量基因和ESTs序列.结论:该文库为研究南江3号的基因功能和资源提供材料来源.     

中国林蛙皮cDNA文库的构建

目的：为研究林蛙皮抗菌肽,筛选、克隆及表达相关抗菌功能基因,构建林蛙皮cDNA文库。方法：提取林蛙皮总RNA后,利用V—gene纯化试剂盒纯化mRNA,RT-PCR合成双链cDNA;取10ng／μLcDNA按照不同比例连接到入噬菌体载体,以选择最佳连接比例。结果：获得克隆总数为1．2×10^5的林蛙皮cDNA文库,重组率为99．4％。结论：所建立的cDNA文库可用于进一步筛选、克隆抗菌功能新基因。     

PCR介导HaNPV罹病幼虫潜伏期cDNA文库的构建

以罹病棉铃虫幼虫为材料提取总RNA ,反转录合成cDNA第一链 ,加oligo(dG)同聚尾 ,PCR扩增合成双链cDNA ,克隆到 pGEM T质粒载体中。随机筛选文库中阳性克隆 ,经酶切分析 ,cDNA插入片段大小在 0 .3～ 1.1kb之间。文库中原代重组子数为 1.66× 10 5,重组百分比为 87.8%。重组质粒的杂交分析表明 ,文库中HaNPV基因的cDNA克隆所占比例超过 50 %。     

基因预测与PCR技术相结合从cDNA文库中获取表达基因的研究

应用计算机工具、GenScan软件预测中国美利奴绵羊MHC Class I区段的BAC文库中453oⅡ克隆的基因数目、特性及结构,建立一种可以从cDNA文库中简便有效获取表达基因的技术方法。选取4个预测基因作研究对象设计引物,应用PCR技术,对已构建好的cDNA文库进行PCR扩增,回收"目的基因"片段并连接pGEM-T载体,转DH5α大肠杆菌中扩增后测序。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,cDNA文库中有目的条带,测序结果与GenBank进行Blast分析,分析结果表明这些基因与羊的基因均具有99%以上的相似性。因此应用基因预测分析与PCR结合技术可简便迅速的从cDNA文库中获取表达基因。     

全长cDNA克隆的三种方法的比较研究

为了得到一段EST所在基因的全长,采用了快速扩增cDNA末端（RACE）、cDNA文库构建、λphage测序引物与特异性引物结合,非放射性探针进行噬菌体原位杂交等方法分别对该基因进行了克隆,结果得到了一致的全长cDNA,三种不同实验方法的应用,为更方便、有选择性地克隆全长cDNA基因奠定了基础。     

人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞(HUS-98)cDNA文库的构建及鉴定

为了进一步分离人尿道(阴茎)鳞癌组织特异性表达基因和鳞癌特异性相关基因,采用SMART技术,构建了人尿道 (阴茎)鳞癌上皮细胞cDNA文库,从人尿道(阴茎)鳞癌上皮细胞中分离总RNA并纯化mRNA,利用经修饰的oligo(dT)引物 合成cDNA第一链,利用SMART核苷酸作为cDNA第一链在mRNA5′端延伸出去的模板,采用LD-PCR合成双链cDNA,双链 cDNA经酶切和过柱分级分离后,克隆入λTriplEx2载体后经体外包装而成cDNA文库。结果表明原始人尿道(阴茎)鳞癌上 皮cDNA文库获得1.57×107个重组子,重组率达到98%。文库扩增后,滴度达到4.0×109pfu/ml,插入cDNA平均长度为2.5kb。 构建的人尿道(阴茎)鳞癌上皮cDNA文库具有良好的质量,该cDNA文库为进一步筛选鳞癌抑癌基因及鳞癌特异性表达基因 奠定了基础。