植物内生固氮菌

植物内生固氮菌的发现和研究显现了一个新的固氮系统,深化了根际联合共生固氮的研究。文章综述了10年来植物内生固氮菌的研究进展,并探讨了内生固氮菌进入植物体内的方式和行使固氮功能的可能性。     

植物内生固氮菌研究进展

综述了植物内生固氮菌生物多样性、生物学特性 ,生理特性 ,与寄主植物的相互作用及应用前景等方面的研究进展。     

巨菌草不同生长时期的内生固氮菌群组成分析

【背景】禾本科植物中存在着丰富的内生固氮菌资源,可为植物的生长、营养利用、增强抗逆性等起到重要的促进作用。【目的】揭示巨菌草不同生长时期根、茎、叶内生固氮细菌的组成及其变化。【方法】采用高通量测序技术对不同生长时期的巨菌草根、茎、叶内生固氮菌群进行群落分析。【结果】不同生长时期巨菌草根、茎、叶的15个样本分别得到4-6万条有效序列,主要分布在360 bp左右。根部巨菌草内生固氮菌群在成熟期最高,茎部和叶部均为拔节期最高,同一生长时期则为根叶茎,变化趋势与巨菌草植物样本的固氮酶活性变化趋势一致,其主要的菌群门类为变形菌门(Proteobacteria)和蓝藻菌门(Cyanobacteria),主要核心属为克雷伯氏菌属(Klebsiella)、草螺菌属(Herbaspirillum)和慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)。整体上看,根、叶部来源的各自微生物菌群组成较为接近,茎部来源的菌群与根部、叶部有交叉,成熟期根部的联合固氮菌群种类和丰度最高。典范对应分析表明各来源样本固氮菌群的组成主要受环境温度影响,其次为湿度和pH。【结论】不同生长时期巨菌草根、茎、叶固氮菌群的组成及丰度存在着较大的差异,本研究可为巨菌草内生固氮菌群资源的开发和利用以及种质资源库的建立提供基础依据。     

典型生境巨菌草根内生固氮菌的群落多样性

【目的】探究不同生境巨菌草内生固氮菌群落组成多样性及其分异规律。【方法】采用高通量测序固氮酶nif H标靶基因方法,研究了我国6个典型地区的巨菌草内生固氮菌群,包括福建闽侯县、新疆墨玉县、内蒙古阿拉善左旗、青海贵德县、甘肃安定区、海南那大镇,结合地理气候因子统计,分析了固氮菌多样性的环境驱动机制。【结果】共获得64122条nif H基因的有效序列,640个OTUs,归属于6个门、10个纲、17个目、24个科、33个属和39个种。不同地区巨菌草中优势内生固氮菌群的种类和丰度存在较大的差异。在门水平上,福州闽侯县、甘肃安定区、新疆墨玉县、内蒙古阿拉善左旗和青海贵德县5个地区的优势菌门均为变形菌门,海南那大镇的优势菌门为变形菌门和蓝藻菌门;属水平上,不同地区巨菌草最优势内生固氮菌类群分别为:福州闽侯县(变形菌门中未定属,80.56%);新疆墨玉县(变形菌门中未定属,33.14%);内蒙古阿拉善左旗(变形菌门中未定属,76.23%);甘肃安定区(α-变形菌纲中的未定属,53.78%);海南那大镇(变形菌门中未定属,38.37%);青海贵德县(变形菌门中未定属,46.12%)。Alpha多样性和Beta多样性分析表明,不同地区巨菌草内生固氮菌群落的多样性存在较大的差异,海南那大镇样本中巨菌草各类内生固氮菌群的多样性及丰富度最高,福建闽侯县样本中巨菌草各类内生固氮菌群的多样性及丰富度最低。典范对应分析(CCA)结果表明,年均降雨量和年均气温是影响巨菌草内生固氮菌群变化的主要因素,其次是土壤有机质、土壤全氮和土壤p H。【结论】不同地区巨菌草内生固氮菌群落的组成及丰度存在着较大的差异,海南那大镇巨菌草内生固氮菌群的种类及相对丰度较高,本研究可为巨菌草内生固氮菌群的资源开发及其固氮微生物肥料的菌种选育和生产应用提供理论支持。     

植物内生固氮菌及其固氮机理研究进展

氮素是植物生长必不可少的元素,植物内生固氮菌不仅能够在植物体内产生氮素以供植物利用,而且在自然界氮素循环过程中发挥积极作用,对农业可持续发展具有重要意义。近年来,植物内生固氮菌逐渐成为研究热点。由植物内生固氮菌的发现、作物共生、侵入途径、固氮机理、促生作用机制等方面系统地综述了植物内生固氮菌的研究进展,探讨了植物内生固氮菌新的研究思路以及一些尚未解决的问题,以期为植物内生固氮菌及生物固氮研究提供参考。     

糖蜜草(Melinis minutiflora Beauv.)内生固氮菌分离鉴定

糖蜜草（Melinis minutiflora Beauv．）是热带地区的一种优良牧草。采用选择性培养基在厌氧和好氧两种培养条件下,从糖蜜草根、茎中都可分离得到具有较强固氮酶活性的菌株。通过SDS-PAGE全细胞蛋白电泳技术快速聚类分析表明,来源于糖蜜草中的菌株为同一类群。16S rDNA序列分析和总DNA的G＋c％含量进一步确定糖蜜草中所分离的菌株属于固氮螺菌属（Azospirillum）,与产脂固氮螺菌（Azospirillum lipoferum）亲缘关系较近。BIOLOG板测定结果显示,糖蜜草菌株TMCY243对多种碳源具有很强的适应性,与产脂固氮螺菌（A．lipoferum）的模式菌株DSM 1691存在着较大的差异。以上结果表明,糖蜜草内生固氮菌为固氮螺菌属的一个新类群。     

植物内生固氮菌在绿色农业生产建设中的应用

化学氮肥在解决人类温饱问题中起了极为重要的作用,但近年发现过量施用化肥有较大的负面影响.植物内生固氮菌是近年发现的一类非豆科植物中的高效固氮微生物,这一新型固氮系统为新型绿色农业生产建设提供了一种新的生物固氮途径.本研究综述了化学氮肥在农业生产建设中的危害、生物固氮作用、植物内生同氮菌及其固氮机制、植物内生固氮菌在绿色农业生产建设中的应用,并对应用植物内生固氮菌的可能性和意义,以及需要注意的问题作了一些探讨.     

落地生根内生固氮菌多样性和促生特性

【背景】内生固氮菌可以定殖于植物体内为植物提供营养物质,还能通过代谢促进植物生长,目前对于落地生根内生菌的研究鲜见报道。【目的】研究落地生根中内生固氮菌多样性。【方法】从表面消毒的植物组织中分离纯化内生菌,并通过乙炔还原法测定菌株的固氮酶活性。采用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS指纹图谱对菌株聚类,各类群代表菌株进行16S rRNA基因系统发育分析和生理生化鉴定。测定菌株固氮、分泌生长素和ACC脱氨酶、产铁载体、溶磷和解钾等促生特性。【结果】从落地生根中分离纯化出26株内生固氮菌,聚为5个类群,隶属于4个属的5个菌种,且各类群代表菌株具有多种促生功能。【结论】从落地生根中分离获得的内生菌具有丰富的遗传多样性和促生特性,并且存在新的微生物资源,有待开发利用。     

高秆野生稻内生固氮细菌多样性

高秆野生稻(Oryza alta)是一种重要的种质资源, 其组织内也蕴藏着非常宝贵的功能微生物资源。本实验采用无氮培养基, 从高秆野生稻中分离到43株内生固氮菌, 结合乙炔还原法测定其固氮酶活性。经固氮酶基因(nifH)的PCR扩增检测, 43株内生固氮菌代表菌株均能扩增出固氮酶基因片段。利用IS-PCR DNA指纹图谱和SDS-PAGE全细胞蛋白电泳图谱将获得的菌株聚类为6个类群(I、II、III、IV、V、VI)。对各个类群的代表菌株(ZF3, ZF8, ZF13, ZF15, ZF24, ZF43)进行16S rRNA基因序列测定, 结果表明, 类群I属于土生拉乌尔菌(Raoultella terrigena), 类群II属于类肺炎克雷伯氏菌类肺炎亚种(Klebsiella quasipnmoniae subsp. quasipneumoniae), 类群III属于越南伯克氏菌(Burkholderia vietnamiensis), 类群IV的菌株代表肠秆菌属的一个类群(Enterobacter sp.), 类群V的菌株属于门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina), 类群VI归属于固氮植物菌(Phytobacter diazotrophicus)。Biolog聚类结果与IS-PCR指纹图谱类型及SDS-PAGE全细胞蛋白聚类结果一致。Biolog板测定结果显示, 来自不同类群的代表菌株对碳源的利用差异显著, 说明野生稻内多样的内生固氮菌从环境中获取碳源和氮素的适应能力较强。     

珙桐内生细菌的分离鉴定及系统发育分析

用微生物学传统分离培养方法从珙桐茎、叶及叶柄中分离到内生细菌56株,选取17株内生菌,提取其基因组DNA,并以此为模板,PCR扩增其16S rDNA,扩增出约1 500 bp大小的DNA条带,对15株内生菌16S rDNA测序,用BLAST软件对测序结果进行相似性比对,发现11株为Bacillus属,相似性为95%-98%;2株为Lysinibacillus属,相似性为97%和99%;1株为Bordetella属,相似性为95%;1株为非培养细菌的同源菌,相似性96%。芽孢杆菌为珙桐内生细菌优势菌属。通过构建系统发育树发现这15株内生菌明显聚为2大支。     

不同生境重楼内生真菌及土壤真菌多样性比较

【背景】植物内生菌的群落组成随物种基因型及不同部位、生长地和环境条件不同而发生变化,而植物相关微生物会影响植物的生长、代谢、化学成分的积累与合成,并且可能对药用植物有效成分的合成造成影响。【目的】通过对不同生长环境重楼内生及土壤真菌群落多样性的研究,寻找园区环境与野生环境的差异真菌,为野生药用植物的人工栽培提供理论基础。【方法】测定两种环境中土壤的理化指标,并采用Illumina HiSeq高通量测序技术分别对野生环境及园区环境中重楼内生及土壤真菌群落转录间隔区ITS进行扩增子序列测定,对不同土壤环境真菌群落组成与多样性差异进行生物信息学分析。【结果】对重楼相关土壤及内生真菌的多样性分析结果显示,野生环境中的真菌丰度及多样性均高于园区环境。其中野生环境与园区环境中根际土壤真菌的丰度有显著性差异(P0.05)。真菌群落注释结果表明,两种环境中分别注释到8个门;在属水平上,野生环境注释到82个属,园区环境注释到78个属;不同土壤环境对微生物群落丰度有着较为显著的差异。野生环境中有4.04%特有的OTU,园区环境中有4.84%特有的OTU。通过LEfSe分析找到了园区环境与野生环境具有显著性差异的生物标记物,Ttracladium marohalianum、Thelephorales和Thelephoraceae为区别两种环境的生物标记物。【结论】野生环境较园区环境在土壤条件上更为疏松,并具有较高的含水量,矿质元素含量也更高,其真菌群落多样性及丰度较园区环境更为丰富。该研究结果将对重楼引种栽培后的质效变迁研究提供理论基础。     

ADH evolution and the phylogenetic footprint

The evolution of any given protein reflects the interplay between proximal selective forces involving the conservation of protein structure and function and more general populational factors that shape the action and efficiency of natural selection. In an attempt to address that interplay, we have analyzed patterns of amino acid replacement within a well-conserved molecule, alcohol dehydrogenase (ADH), in the Drosophilidae. A sliding window, moved along the protein sequence in order to quantify the extent of change at each amino acid position, reveals heterogeneous amounts of replacement across the molecule when all ADH sequences are analyzed simultaneously. Surprisingly, the replacement profile for ADH differs significantly in the melanogaster, mulleri, and Hawaiian subgroups, reflecting the imprint of the differing evolutionary histories of each of these assemblages on the evolution of this conservative molecule.Correspondence to: R.L. Dorit     

不同扩增引物对高通量测序分析盐角草内生真菌多样性的影响

【背景】高通量测序分析作为深入了解环境微生物群落组成的重要方法,已成为植物内生真菌多样性研究的有效手段,然而由于引物的扩增差异,采用不同引物可对实验结果分析造成影响。同时,盐角草作为世界上最耐盐的植物之一,存在着多种功能性的内生真菌,而较为全面介绍其内生真菌组成和多样性的报道鲜见。【目的】为了揭示盐角草内生真菌的多样性,解析不同扩增引物对内生菌多样性分析的影响。【方法】分别采用真菌高通量测序常用引物对ITS1-5F、ITS1-1F、ITS2对采自乌鲁木齐达坂城盐湖的盐角草内生真菌进行扩增,开展其内生真菌OTU的分析。【结果】通过不同引物对扩增并测序共获得102个盐角草内生真菌OTU,涉及真菌界8个门和未分类菌群,其中子囊菌门(Ascomycota)占绝对优势,其次为担子菌门(Basidiomycota);在属层次上,盐角草内生真菌共涉及64个属及20个未分类属,其中Alternaria、Cladosporium、Podospora等3个属为盐角草内生真菌优势菌群。对不同引物对扩增测序结果分析表明,不同引物对扩增对分析内生真菌OTU数量和种类具有明显的影响,在全部所得的102个OTU中,...     

Isolation and identification of root associated diazotrophs

Diazotrophs have been isolated from the rhizosphere or roots of plants by many workers. To recognize a certain diazotroph as the most abundant bacterium at a certain site or as the principal agent responsible for N₂-fixation is much more difficult. It is probable that many diazotrophs, including possibly the most efficient ones, have not been identified yet. The use of proper selective media which simulate the environment of the various diazotrophsin situ has led to the discovery of 10 new root-associated diazotrophs, three of them during 1986/1987 (Azospirillum halopraeferans, Herbaspirillum seropedicae and the recently proposedAcetobacter diazotrophicus). The importance of using a variety of carbon substrates in the growth media with pH indicators, and the use of N-free semi-solid media, is discussed. Recognition of plant-bacteria interactions requires, in addition to the identification of the bacteria, the demonstration of effects of the plant on the bacteria and of the bacteria on the plant. Confirmation of the identity of diazotrophs responsible for response of plants to inoculation must be made in experiments with strains labelled with antibiotic resistance or other markers. If establishment of the inoculated strain is demonstrated in plants grown in¹⁵N-labelled soil, the¹⁵N enrichment of the plants will reveal if any observed responses in N yield are due to N₂-fixation or increased soil/fertilizer-N uptake.     

产喜树碱内生真菌的筛选及鉴定

从喜树Camptotheca acuminate树皮和果实中分离得到27株内生真菌,发酵后经HPLC检测,筛选出一株菌丝产喜树碱的菌,产量达774μg/L。对其ITS序列进行系统发育分析,结合其培养特征和显微特征,鉴定为拟茎点霉属(Phomopsis sp.)。这是首次报道分离自喜树的该属真菌发酵产喜树碱。     

The role of parsimony,outgroup analysis,and theory of evolution in phylogenetic systematics

It is argued that both the principle of parsimony and the theory of evolution, especially that of natural selection, are essential analytical tools in phylogenetic systematics, whereas the widely used outgroup analysis is completely useless and may even be misleading. In any systematic analysis, two types of patterns of characters and character states must be discriminated which are referred to as completely and incompletely resolved. In the former, all known species are presented in which the characters and their states studied occur, whereas in the latter this is not the case. Dependent on its structure, a pattern of characters and their states may be explained by either a unique or by various conflicting, equally most parsimonious hypotheses of relationships. The so-called permutation method is introduced which facilitates finding the conflicting, equally most parsimonious hypotheses of relationships. The utility of the principle of parsimony is limited by the uncertainty as to whether its application in systematics must refer to the minimum number of steps needed to explain a pattern of characterts and their states most parsimoniously or to the minimum number of evolutionary events assumed to have caused these steps. Although these numbers may differ, the former is usually preferred for simplicity. The types of outgroup analysis are shown to exist which are termed parsimony analysis based on test samples and cladistic type of outgroup analysis. Essentially, the former is used for analysing incompletely resolved patterns of characters and their states, the latter for analysing completely resolved ones. Both types are shown to be completely useless for rejecting even one of various conflicting, equally most parsimonious hypotheses of relationships. According to contemporary knowledge, this task can be accomplished only by employing the theory of evolution (including the theory of natural selection). But even then, many phylogenetic-systematic problems will remain unsolved. In such cases, arbitrary algorithms like those offered by phenetics can at best offer pseudosolutions to open problems. Despite its limitations, phylogenetic systematics is superior to any kind of aphylogenetic systematics (transformed cladistics included) in approaching a (not: the) “general reference system” of organisms.     

岑溪药用野生稻高效内生固氮菌分离及促生特性

【目的】以广西岑溪市野生稻保护区的药用野生稻为材料,分离纯化内生细菌,筛选固氮酶活性较高和对作物促生效果较好的菌株。【方法】利用乙炔还原法检测固氮酶活性,采用SDS-PAGE全细胞蛋白电泳和IS-PCR指纹图谱技术对分离到的固氮菌进行聚类。利用16S rRNA基因和nifH基因确定其系统发育地位。采用钼锑抗比色法、Salkowski比色法和CAS检测法分别测定菌株溶磷性、生长素的分泌能力和产铁载体能力。通过平板和盆栽试验检测其对水稻的促生作用。【结果】共分离得到35株内生固氮菌,分为6个类群。其中CX24固氮酶活性最高,经鉴定属于Klebsiella variicola,其固氮酶活性为298.64 μmol/(L·h),为参比模式菌株DSM15968的9倍。另外该菌株还具有较高的溶磷性、分泌生长素和产铁载体能力,能够有效地促进水稻的萌发和生长。【结论】菌株CX24属于Klebsiella variicola,是一株高效内生固氮菌,具有很好的生产应用前景。