综述与专论: 核酸适配体在分子医学中的应用

分子医学着眼于从疾病的分子层面出发,为个性化精准诊疗提供解决方案。然而,在众多疾病的诊疗中由于缺乏有力的分子识别工具,目前从分子水平上理解和研究疾病仍受到制约。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化（SELEX）技术在体外筛选得到的单链寡核苷酸,具有高选择性、高亲和力、易细胞内化、良好的组织渗透和快速的组织积累能力。近年来,由于其易合成、成本低、稳定性高且免疫原性低,核酸适配体作为分子工具应用于疾病的诊疗一体化受到广泛关注。本综述围绕分子医学中的核酸适配体,讨论了核酸适配体在疾病诊断中的应用,包括基于核酸适配体的肿瘤标志物发现、液体活检、分子成像。介绍了核酸适配体在癌症治疗中的应用包括基于核酸适配体的抑制剂、核酸适配体药物偶联物、纳米药物和核酸适配体介导的免疫治疗。最后对核酸适配体在临床诊疗和产业化面临的问题进行了讨论,包括基于应用场景的筛选方法、核酸适配体与靶标复合物结构、亲和力的机制以及核酸适配体在血液循环中的稳定性等方面。     

综述与专论: 核酸适配体在肾癌中的应用

肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一,发病率呈上升趋势。肾细胞癌作为肾脏肿瘤的主要类型,具有较高的局部浸润和远处转移的频率,约33%~50%的肾细胞癌患者在发现时已发生转移。由于肾细胞癌早期无特异性体征和症状,主要治疗手段是手术切除,对放化疗不敏感,治疗手段有限,因此肾细胞癌的早期诊断能够大大提高肾细胞癌有效治疗的机会,对于肾癌的有效治疗具有十分重要的意义。核酸适配体是通过指数富集的配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX）,从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段,能够选择性地与小分子配体或高亲和力的蛋白质靶标结合,对靶分子或细胞具有较高的亲和力和特异性,目前已广泛应用于肿瘤影像学诊断及靶向治疗中。本文主要综述了与肾癌相关的核酸适配体,并对于适配体在肾癌诊疗中的应用进行了总结和讨论。     

综述与专论: 核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战

核酸适配体是一类具有特异性分子识别能力的单链DNA或者RNA分子,通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到。核酸适配体相比抗体具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点,在生物分析、生物医学、生物技术等众多领域引起广泛关注。高质量的核酸适配体是应用的基础,然而目前能够满足实际应用的核酸适配体数量还非常有限。如何获得高亲和力、高特异性、高体内稳定性的核酸适配体是核酸适配体领域的技术瓶颈。本文首先简单介绍了SELEX技术的基本原理和核酸库的设计、筛选过程监控、次级文库制备、测序和候选适配体筛选等关键步骤。接着归纳总结了30多年来核酸适配体筛选技术的6个主要研究方向、研究进展和局限性。这6个主要研究方向分别是提高适配体特异性的筛选方法、提高适配体稳定性（抗核酸酶降解能力）的筛选方法、快速筛选方法、复杂靶标适配体筛选方法、小分子靶标适配体筛选方法、提高适配体亲和力的筛选方法。其中快速筛选技术是长期以来持续关注的研究方向,几乎所有物理分离手段都已用于提高SELEX的筛选效率。最近,高效化学反应与SELEX技术的结合为核酸适配体的快速筛选提供了新的策略。本文随后对适合小分子靶标核酸适配体筛选的3类方法进展和存在的问题进行了重点评述。这3类方法分别是基于靶标固定的筛选技术、基于文库固定的筛选技术（捕获-SELEX,Capture-SELEX）和均相筛选技术（氧化石墨烯-SELEX,GO-SELEX）。基于靶标固定的筛选技术尽管存在空间位阻等众多问题,由于其操作的简单性,目前依然应用广泛。近年来Capture-SELEX应用广泛。结合36种靶标适配体的筛选实验条件（文库设计、正筛靶标浓度、负筛靶标的选择和浓度）和所获得的适配体的亲和力（K_D,解离常数,dissociation constant）和特异性,对Capture-SELEX的实验条件与适配体性能的关系进行了讨论。统计数据表明,降低正筛靶标浓度有利于提高适配体的亲和力,但不是必要条件。负筛选是目前提高适配体特异性的主要技术手段,但适配体的特异性还不能满足实际需求。负筛选靶标及其浓度的选择差异很大,而且36种靶标中有20种靶标的适配体筛选没有进行负筛选。如何提高核酸适配体的特异性是目前小分子靶标核酸适配体所面临的难题,急需寻找新的策略。本文还列表归纳了近三年利用GO-SELEX进行的13种小分子靶标的实验条件和所获得的适配体的K_D和特异性。统计数据表明,GO-SELEX比Capture-SELEX所需要的筛选轮数少,两种方法所获得的适配体的亲和力多在纳摩尔每升水平。Capture-SELEX相对较低的筛选效率应该主要由于文库的自解离问题。核酸适配体的亲和力评价是候选核酸适配体结构与性能评价的重要组成部分。常用的核酸适配体亲和力评价技术包括基于分离、基于固定、均相体系三大类十多种方法。假阳性和假阴性是各种评价技术都有可能存在的问题。本文以纳米金比色法和等温热滴定技术为例评述技术进展,讨论导致不同亲和力评价技术结果不一致性问题的根本原因。本文最后对核酸适配体筛选技术、亲和力评价技术和技术的标准化的未来发展趋势进行了展望。     

综述与专论: 基于核酸适配体的细胞外囊泡分离分析方法

细胞外囊泡通过参与细胞间通讯，在诸多生理病理过程中发挥着重要作用。因此，细胞外囊泡的分离分析对理解其生物学功能以及发展基于囊泡的疾病诊疗方法具有重要价值。细胞外囊泡的高效分离以及高灵敏可靠检测很大程度上取决于识别配体。核酸适配体是一类高效、特异结合其靶标分子的单链寡核苷酸。核酸适配体的易修饰和可程序化设计等特征，使其成为细胞外囊泡分离和分析的理想识别配体。为提高细胞外囊泡的分离效率，研究者们提出多种策略用于提升核酸适配体的亲和力，以及界面与细胞外囊泡的接触几率。此外，分离不同亚型的细胞外囊泡有助于理解细胞外囊泡的生物学意义。在细胞外囊泡分析方面，根据核酸适配体与细胞外囊泡识别信号的转导方式不同，分为电化学、可视化、表面增强拉曼光谱、荧光法等方法。本文综述了核酸适配体的筛选以及其在细胞外囊泡分离和分析中的最新进展、挑战及未来方向。     

基于核酸适配体的生物分析新方法研究进展

核酸适配体是从随机文库中采用SELEX技术筛选所得的单链短链寡核苷酸片段(通常为15-80个ss DNA或ss RNA)。其能够折叠形成独特稳定的三维结构,通过静电相互作用,氢键,范德华力,碱堆叠或多种作用力组合特异性地与多种靶标结合。适配体因具有构象变化能力而被用作生物分析中的理想识别配体。目前,基于适配体的生物分析新方法得到广泛研究,并用于蛋白多肽类药物分析、疾病标志物诊断、外泌体检测、循环肿瘤细胞检测和病毒检测等方面。本文综述了核酸适配体用于生物分析方法开发的最新进展,比较和讨论不同分析方法,并对基于适配体的生物分析新方法提出了设想和展望,为开发新的生物分析方法和检测技术提供了思路和借鉴。     

综述与专论: 适配体功能化外泌体在肿瘤靶向治疗中的应用

传统的肿瘤治疗方法因缺乏足够的靶向性而会产生严重的毒副作用。外泌体（exosome）是一种天然的纳米囊泡,参与细胞间的信息传递,并且作为药物递送载体具有出色的性能优势,包括低免疫原性、低毒性和能够穿越天然屏障等特点。然而以外泌体为载体的药物递送系统的靶向能力仍有不足。适配体（aptamer）是一类化学合成的单链核酸分子,具有分子质量小、易于修饰和免疫原性低等特点,可作为亲和性配体与靶向分子特异性结合。通过在外泌体表面修饰适配体,药物可以被精确递送到肿瘤细胞发生部位,从而实现对肿瘤的靶向治疗,提高肿瘤治疗效果,减少毒副作用。本篇综述将重点讨论适配体功能化外泌体药物靶向递送系统在各种肿瘤治疗方面的应用,并对其未来的挑战和机遇进行阐述。     

综述与专论: 基于核酸适配体传感器的即时检测（POCT）技术

即时检测（point-of-care testing，POCT）是一种检测成本低、检测速度快、准确度高、能自我采样获得临床诊断结果的新型诊断技术。该技术在临床诊断、病情监控与疫情防控等领域发挥了重要作用。核酸适配体是一种能够特异性识别多种靶标的分子探针，具有易合成、批间差异小、易实现信号放大等突出优势，是生物医学传感器中重要的分子识别元件。本文概述了核酸适配体探针的现有筛选方法和进展，总结了核酸适配体POCT传感器信号放大策略，着重介绍了各类核酸适配体传感器在POCT领域的应用现状，并对核酸适配体POCT传感器的发展前景进行了展望。     

综述与专论: 肿瘤相关碳水化合物抗原的适配体研究

肿瘤细胞异常的糖基化模式是癌症的标志,在恶性转化和癌症进展中起着至关重要的作用。不同机制导致的肿瘤相关碳水化合物抗原（tumor-associated carbohydrate antigens,TACAs）不仅是临床肿瘤学诊断中公认的生物标志物,也为治疗干预提供了特定的靶点。适配体作为抗体或凝集素的有力替代品,近年来在碳水化合物的识别中展现了潜在的应用价值。本文聚焦于癌症中异常的糖基化改变,综述了目前TACAs识别适配体的开发进展。依据适配体筛选程序中的靶标来源,阐述了针对3种类型靶标,包括糖类分子、蛋白质聚糖表位,以及血清糖类抗原的筛选策略。从筛选方法、性能指标及相关应用性方面对适配体进行了总结,并讨论了当前研究中存在的问题和未来发展方向。     

研究报告: 基于核酸适配体的胶体金比色法检测鳗弧菌

目的 鳗弧菌（Vibrio anguillarum）可引起鲑鱼、鳗鲡、鲈鱼和牙鲆等多种水产养殖动物的疾病,是水产养殖中的一种重要病原菌,对其进行快速检测是确保水产养殖安全和食品安全所必需的。方法 本文利用鳗弧菌与其核酸适配体之间较强的亲和力,通过鳗弧菌夺取胶体金颗粒表面的核酸适配体,使胶体金溶液的吸光度发生变化,从而建立一种可定量检测鳗弧菌的方法。结果 该方法对鳗弧菌的吸光度值显著高于对溶藻弧菌、铜绿假单胞菌、变形假单胞菌、嗜水气单胞菌和迟钝爱德华氏菌等非目标菌的吸光度值（P<0.01）,并在1~10⁵ CFU/ml的检测范围内呈现较好的线性关系。用该方法对不同盐度和鱼体组织样品进行加标回收检测,结果显示回收率和相对标准偏差等指标都符合相应检测标准。结论 该检测方法对鳗弧菌有较好的特异性,可用于水产品或食品中鳗弧菌的定量检测。     

发光核酸适配体的筛选及应用

发光核酸适配体(light-up nucleic acid aptamers,LNAs)是一类能够特异性结合目标分子并增强目标分子发光性能的功能核酸(functional nucleic acids,FNAs)。LNAs具有组成简单、结构稳定、表达时间短等优点,因此在细胞成像、物质检测等传感领域显示出巨大潜力。随着对细胞内基因原位分析的研究深入,现存胞内成像技术的不足逐渐显露,LNAs成像系统应运而生。本文梳理并概括了不同类型LNAs的筛选方法,并从胞内、体外两个方面对LNAs的前沿应用进行了分析,指出了当前LNAs研究以及传感系统存在的不足,展望了LNAs在无细胞传感中的巨大发展前景,以期能够促进LNAs系统成为胞内外传感研究的一件利器。     

研究报告: 基于Ser-SELEX技术的结肠癌血清适配体的筛选及其应用研究

目的 为了解决癌症早期诊断困难的问题，实现结肠癌的早期检测。方法 采用Ser-SELEX技术筛选了结肠癌血清的特异性适配体。通过前期结肠癌血清正筛-正常人血清反筛步骤和后期结肠癌血清正筛-其他癌症血清反筛步骤循环的方式，经过16轮筛选流程，共选取4条候选适配体，并对其进行序列分析、二级结构和三级结构模拟、特异性分析等。结果 候选适配体主要形成的结构是茎环和假结两种，qPCR法测试亲和力，K_d约为10 nmol/L，适配体与结肠癌患者血清特异性结合情况分析表明，候选适配体APT-2具有良好特异性，且此种方法检出率约为 82.5%。结论 适配体（APT-2）应用于结肠癌早期诊断具有良好的发展前景。     

研究报告: 基于AS1411适配体的DNA-RNA杂交载体的抗肿瘤研究

目的 研究连接适配体的DNA-RNA分子作为杂交载体靶向肿瘤细胞并导入功能性RNA分子进入细胞的有效性，以及对肿瘤细胞的影响。方法 设计合成短的互补DNA、RNA分子，组装成DNA-RNA杂合链；连接AS1411适配体为靶向分子，再分别连接p21 saRNA和TIGIT siRNA作为药物分子，记为P21 saRNA和TIGIT siRNA，构成杂交载体，通用结构式为AS1411-DNA/RNA-sxRNA；检测AS1411-DNA/RNA-sxRNA能否靶向结合并进入肿瘤细胞及其对瘤细胞生存、迁移、侵袭和凋亡的影响。结果 将设计的杂交载体各部分等摩尔加入杂交缓冲体系并于特定温度条件下孵育，TBM聚丙烯酰胺凝胶电泳检测到AS1411-DNA/RNA-sxRNA成功组装；AS1411-DNA/RNA-sxRNA杂交载体在10%血清条件下也显示出良好的抗降解稳定性；荧光显微镜和激光共聚焦显微镜下观察，SKOV3细胞表面及胞内存在绿色大量荧光信号，杂交载体成功进入肿瘤细胞。杂交载体孵育后：在mRNA水平上，p21基因表达（2.14±0.25）是对照组（1.02±0.10）2倍以上，P<0.05；TIGIT基因表达（0.63±0.09）低于对照组（1.09±0.15），P<0.05；在蛋白质水平上，p21基因表达（1.57±0.16）是对照组（1.10±0.09）1.5倍以上，P<0.05；TIGIT基因表达（0.61±0.12）低于对照组（1.01±0.07），P<0.05。CCK-8实验显示，P21 saRNA（3.10±0.13）和TIGIT siRNA（2.91±0.13）杂交载体孵育组与空白对照组（3.67±0.15）相比，卵巢癌细胞增殖能力显著下降（P<0.05）；划痕实验结果显示，P21 saRNA孵育组愈合率（42.53±2.90）%、TIGIT siRNA孵育组愈合率（36.23±3.43）%，明显低于空白对照组（76.47±3.64）%，P<0.05；Transwell检测迁移能力发现：P21 saRNA孵育组（128.25±5.36）、TIGIT siRNA孵育组（119.50±8.79）低于对照组（186.5±8.56）；侵袭能力：P21 saRNA孵育组（145.5±9.45）、TIGIT siRNA孵育组（112.25±5.63）也显著低于对照组（202.50±10.12），P<0.05；细胞凋亡率：P21 saRNA孵育组（11.74%±2.47%）、TIGIT siRNA孵育组（17.12%±2.04%）明显高于对照组（5.66%±1.44%），P<0.05。结论 所制备的AS1411-DNA/RNA-sxRNA杂交载体能够有效靶向肿瘤细胞，携带功能性小RNA靶向导入肿瘤细胞并调控目的基因表达，使肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移能力受到抑制；该结果为利用DNA-RNA偶联AS1411适配体作为靶向工具的杂交载体，靶向杀伤表面表达NCL蛋白的肿瘤细胞提供了实验基础。     

综述与专论: 河鲀毒素的检测技术与应用

河鲀毒素（tetrodotoxin, TTX）是毒性极强的小分子生物碱类毒素,包括中国在内的亚洲沿海国家因误食TTX污染食品而中毒的事件时有发生,其发病迅速且无特效解毒剂,对环境安全、食品安全与社会安全造成极大的威胁。通过检测食品与环境中的TTX含量可以实现TTX的风险预警,可有效防范TTX中毒事件的发生。本文梳理了4类TTX的检测技术,分析比较了传统的生物检测法、化学检测法、免疫检测法之间的优势、不足与实际应用进展,介绍了基于适配体技术的新型检测技术的兴起、发展与广阔的应用前景,对生物安全领域中TTX风险的管理与控制有现实意义。