中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18的原核表达及配体结合特性

【目的】研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator气味结合蛋白MmedOBP18在触角中的表达定位,解析MmedOBP18重组蛋白的配体结合特性。【方法】原核表达中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18;采用荧光免疫组织化学技术研究MmedOBP18在中红侧沟茧蜂雌蜂触角中的表达定位;通过荧光竞争结合实验分析MmedOBP18重组蛋白与99种候选配体的结合特性。【结果】在原核表达系统中成功表达MmedOBP18重组蛋白。荧光免疫定位结果显示MmedOBP18主要表达在触角锥形感器Ⅰ内的淋巴液中。荧光竞争结合实验结果表明,MmedOBP18重组蛋白能够与16种候选配体结合,与低挥发性植物挥发物2-十三酮、十二醛、十四酸和十一酸的结合能力最强,其解离常数K_i值分别为5.21, 6.42, 6.49和6.58μmol/L;而且MmedOBP18重组蛋白与非挥发性植物次生物质棕榈酸、棉酚、槲皮素及亚麻酸也有较强的结合能力,K_i值分别为3.86, 5.07, 5.08和6.51μmol/L;此外,MmedOBP18重组蛋白与鳞翅目昆虫性信息素组分顺-9-十四碳烯醛及顺-11-十六碳醛表现出较强的结合能力,K_i值分别为9.09和11.67μmol/L,提示该蛋白在寄主定位过程中可发挥重要的作用。【结论】中红侧沟茧蜂气味结合蛋白MmedOBP18能够结合长链低挥发和非挥发性化合物,推测其在嗅觉和味觉识别中发挥双重功能,主要参与对寄主和寄主生境的化学信息的近距离识别。     

中红侧沟茧蜂的生活史

中红侧沟茧蜂 (Microplitis mediator)同蜜蜂、胡蜂和蚂蚁等昆虫同属于膜翅目昆虫 ,但它过着一种截然不同的生活 ,是棉铃虫、粘虫等大害虫肝里的“蛔虫”,是过着拟寄生生活的寄生蜂。也许你有在棉田附近踏青的经验 ,你的注意力或许会被眼前 1个飞舞的蚂蚁所吸引 ,那可能并不是 1只会飞的蚂蚁 ,很可能是 1只刚从茧中蜕变出来的中红侧沟茧蜂。这只雌性的寄生蜂只有 3mm,有 1对很显眼的长触角 ,体色淡黄 ,姿态优美。吮吸花蜜 ,这是它成年生活的惟一食物和饮料。与此同时 ,它也在散放着召唤异性的信息——性信息素 ,在不远处有 1只同它一样羽化…     

一种中红侧沟茧蜂畸形细胞分泌的寄生特异蛋白

SDS-PAGE电泳表明,黏虫Pseudaletia separa-ta、棉铃虫 Helicoverpa armigera、小地老虎 Agrotisypsilon的幼虫受中红侧沟茧蜂Microplitis mediator寄生后,血淋巴中都出现一个98.6 kDa的寄生特异蛋白(p98.6)。畸形细胞(teratocytes)的体外培养发现,p98.6是由来自中红侧沟茧蜂胚胎浆膜层的畸形细胞分泌的。这一结果将为研究寄生蜂的寄生生理和畸形细胞在协调寄生蜂和寄主关系中的作用打下基础。     

中红侧沟茧蜂多分DNA病毒基本特征研究

本文首次报道中红侧沟茧蜂 (Microplitismediator)雌蜂卵巢中存在多分DNA病毒 (MicroplitismediatorPlolyd navirus,MmPDV) ,初步研究了MmPDV形态和基本生理生化特征。利用蔗糖密度梯度超速离心分离纯化了MmPDV粒子 ,电镜负染显示PDV粒子分三段 ,带有一明显的尾部结构 ,大小约为 130× 35nm ;SDS PAGE电泳条带较多 ,至少可以分辨出 2 6个电泳条带 ,表明病毒粒子衣壳蛋白复杂 ;琼脂糖凝胶电泳显示MmPDV基因组至少由大小不同、丰度不等的 14个DNA分子组成 ,用 6种内切酶 (EcoRI,HindIII,BssHII,PstI,BamHI,BglI)酶切MmPDV基因组后 ,估算出MmPDV基因组大小约为 10 8kb。用雌蜂输卵管萼液注射小地老虎幼虫 ,注射后的小地老虎体重和龄期发育动态表明 ,MmPDV具有抑制寄主生长发育的生理功能     

中红侧沟茧蜂触角感受器的扫描电镜观察

利用扫描电镜对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator的触角感受器进行了观察,发现了6个类型的感器,分别为毛形感器、板形感器、刺形感器、钟形感器、锥形感器、腔锥形感器。其中,毛形感器具有2种形态,锥形感器具有4种形态。钟形感器仅分布于雌蜂的触角上,锥形感器Ⅲ和Ⅳ仅分布于雄蜂的触角上。结合感受器的形态、分布和已报道的触角电位反应数据,对各感受器的功能进行了推测。     

中红侧沟茧蜂滞育诱导和滞育茧的冷藏

中红侧沟茧蜂Microplitis mediator (Haliday)是夜蛾科害虫低龄幼虫的重要寄生蜂。田间实验表明,在冀中地区秋季田间条件下,当日平均气温为21.5℃、日平均光照时间为12 h 33 min时,少数个体进入滞育;当气温降至17.9℃以下、日光照时间缩短到11 h 45 min以下时,全部个体进入滞育。室内模拟实验结果表明,在17～26℃、光照时间10～14 h范围内,随着温度的降低和光照时间的缩短,滞育率明显提高。高温能抵消短光照对滞育诱导的影响,在26℃下,短光照不能诱导滞育。因此,低温和短光照是诱导该种天敌昆虫滞育的主要因子。中红侧沟茧蜂感受滞育信号的敏感期为低龄幼虫期,以预蛹（茧）进入滞育。低龄幼虫感受滞育信号以后,需要在滞育环境中发育到老熟幼虫才能全部进入滞育。将室内诱导的滞育茧在4℃左右环境条件下冷藏240天,成蜂的羽化率和寄生能力与没有冷藏的非滞育茧差异不显著;冷藏300天,滞育茧仍有81.4%可以正常羽化。本项研究结果为中红侧沟茧蜂的规模化、标准化生产提供了科学的依据。     

热激蛋白90与中红侧沟茧蜂的发育关系

根据热激蛋白90(the heat shock proteins90,Hsp90)基因序列的保守性,设计引物,采用PCR结合RACE扩增的方法克隆得到中红侧沟茧蜂Microplitis mediatorHaliday Hsp90cDNA全序列,并用半定量RT-PCR的方法研究Hsp90与中红侧沟茧蜂发育及滞育间的关系。结果表明,滞育条件和非滞育条件下,热激和冷激都能诱导Hsp90的表达;不论在滞育还是非滞育条件下,Hsp90表达量均在2龄初期最高,随发育时间的增加逐渐降低,成虫期表达量又显著升高;滞育褐茧在4℃保存初期,Hsp90呈现高表达且随保存时间的增加而降低。     

侧沟茧蜂属一新种(膜翅目:茧蜂科:小腹茧蜂亚科)

记述采自浙江省龙王山的侧沟茧蜂属Ｍｉｅｒｏｐｌｉｔｉｓ Ｆｏｅｒｓｔｅｒ一种新,龙王山则沟茧蜂ＭＬｅｒｏｐｌｉｔｉｓ ｔｏｎｇｗａｎｇｓｈａｎａ Ｘｕ ｅｔ Ｈｅ,ｓｐ．ｎｏｖ．。     

Bt杀虫蛋白对不同品系棉铃虫和中红侧沟茧蜂生长发育的影响

以棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)室内敏感品系和田间品系为寄主,研究了亚致死浓度的Bt杀虫蛋白对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator (Haliday)生长发育的影响。结果表明： 当寄主一直取食,或者在被寄生前12小时开始取食含Bt杀虫蛋白浓度为0,0.5,1.0, 2.0,4.0,8.0 μg/g的饲料时,与对照相比,中红侧沟茧蜂的卵-幼虫历期延长,茧重和成虫体重降低,成虫寿命缩短,但对茧期没有明显影响。Bt杀虫蛋白能有效抑制两个棉铃虫品系幼虫的生长,显著降低棉铃虫蛹重;当Bt蛋白浓度为4.0 μg/g时,显著降低棉铃虫化蛹率。用转双基因抗虫棉SGK321（表达Cry1A+CpTI蛋白）饲喂两个棉铃虫品系初孵幼虫,室内品系的第2、3、4和5天校正死亡率分别为48.5%、87.8%、96.6%和 95.8%,显著高于田间品系（30.9%、59.6%、80.9%及86.1%）。本研究表明,不论是田间品系还是室内品系,棉铃虫取食含Bt杀虫蛋白的饲料后,对中红侧沟茧蜂的生长发育都具有显著的负面作用。     

中红侧沟茧蜂对烟草挥发物的触角电生理及行为反应

中红侧沟茧峰 Microplitis mediator是棉铃虫 H elicoverpa armigera的主要内寄生蜂 ,是优良的蜂种 ,在生物防治上具有广阔的应用前景。但迄今 ,有关中红侧沟茧蜂的化学生态的研究甚少。利用触角电位技术 ,测定了中红侧沟茧蜂对烟草叶片粗提物和烟草中 10种挥发物的触角电生理反应 ,并测定了中红侧沟茧蜂的触角电位反应随日龄的变化。以嗅觉仪测定了中红侧沟茧蜂对烟草粗提物、烟草中 4种挥发物的行为反应。结果表明中红侧沟茧蜂利用烟草释放的气味向烟草定向 ,进而找到其寄主——棉铃虫 ,也佐证了烟草同样是棉铃虫的重要寄主植物的论点。雌蜂对脂肪族化合物反应最强 ,对芳香族化合物和糠醛 (杂环化合物 )的反应居中 ,对萜类化合物反应较弱或者不反应。表明烟草挥发性物质在中红侧沟茧蜂寻找寄主的过程中起着重要的作用 ,但挥发物各组分的作用存在着差异。雌性中红侧沟茧蜂对顺 - 3-己烯醇的触角电位反应随日龄的增加而变化。 1日龄的雌蜂的反应较弱 ,2日龄、3日龄的雌蜂反应较强 ,4日龄、5日龄的雌蜂的反应又减弱。这与该蜂产卵习性相符 :羽化当天的雌蜂产卵较少 ,羽化 2～ 3d之后的雌蜂产卵量较大     

中红侧沟茧蜂滞育临界光周期和敏感光照虫态的测定

室内对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator滞育诱导的光周期反应及敏感光照虫态进行了研究。结果表明：在16℃和18℃温度下,当光周期为10L∶14D时,中红侧沟茧蜂的滞育率最高为98%和87.8%;其次是光周期为8L∶16D时,滞育率为78.7%和73%;光周期为12L∶12D时,滞育率为55.8%和50.8%;而在全光照LL, 光周期22L∶2D,20L∶4D,18L∶6D,16L∶8D,14L∶10D ,2L∶22D和全黑暗DD时的滞育率均为0。中红侧沟茧蜂属于典型的长日照发育型,在16℃时诱导滞育的临界光周期是7.03L∶16.97D和12.21L∶11.79D;在18℃时是6.75L∶17.25D和12.03L∶11.97D。16℃时中红侧沟茧蜂对光照反应最敏感时期为2龄幼虫第5～8天,2龄幼虫第1～4,9～12和13～16天及3龄期次之,卵期和1龄幼虫不敏感。     

中红侧沟茧蜂对不同龄期棉铃虫幼虫及其为害棉株的趋性反应

研究中红侧沟茧蜂Microplitis mediator Haliday对棉铃虫Helicoverpa armigera Hübner幼虫及其为害棉株的趋性行为, 可为高效应用中红侧沟茧蜂控制棉铃虫提供理论依据。本研究在实验室内以中红侧沟茧蜂雌蜂、1~5龄棉铃虫幼虫及其为害棉花植株（去虫或未去虫）为试验材料, 采用“Y”型昆虫嗅觉仪测定了中红侧沟茧蜂雌蜂对1~5龄棉铃虫幼虫及其为害棉株的趋性行为反应。结果表明: 中红侧沟茧蜂对3龄、4龄和5龄棉铃虫幼虫均没有明显的趋向行为反应, 1龄和2龄棉铃虫幼虫对中红侧沟茧蜂有显著的引诱作用。此外, 1~5龄棉铃虫幼虫为害后去虫棉株与健康棉株均对中红侧沟茧蜂有吸引作用。在未去虫的处理中, 虫害诱导棉株比健康植株更能吸引中红侧沟茧蜂, 与健康植株差异显著, 而且不同龄期棉铃虫幼虫为害处理间差异较大, 对中红侧沟茧蜂引诱作用的相对顺序为: 5龄为害植株>2龄和4龄为害植株>1龄和3龄为害植株 (2龄和4龄为害处理间差异不显著; 1龄和3龄为害处理间差异不显著)。本研究结果可为中红侧沟茧蜂在生物防治上的应用提供一定的理论指导和实践依据。     

中红侧沟茧蜂寄生对寄主粘虫血淋巴糖类、脂类和蛋白质含量的影响

为揭示寄生蜂寄生对其寄主的生理调控机制, 室内对中红侧沟茧蜂Microplitis mediator寄生与未被寄生寄主粘虫Mythimna separata幼虫血淋巴中糖类、脂类和蛋白含量变化进行了测定。结果显示: 在滞育与非滞育条件下, 被寄生的粘虫血淋巴中糖原浓度均比未被寄生的粘虫高。滞育条件下寄生后12 d差异显著（P<0.05）, 被寄生粘虫糖原含量为7.93 μg/mL, 未被寄生粘虫糖原含量为4.70 μg/mL; 非滞育条件下寄生后6 d差异显著（P<0.05）, 被寄生粘虫糖原含量为14.35 μg/mL, 未被寄生粘虫糖原含量为5.47 μg/mL。海藻糖含量测定结果显示, 在滞育条件下寄生蜂对被寄生粘虫无明显影响, 而非滞育条件下影响效果差异显著（P<0.05）, 寄生后4 d被寄生粘虫海藻糖含量为46.82 μg/mL, 未被寄生粘虫含量为26.72 μg/mL。在滞育与非滞育两种条件下, 寄生与未被寄生寄主脂类和蛋白含量没有显著性差异。结果说明: 寄生蜂的存在使寄主血淋巴中的糖原含量增高; 非滞育条件是影响被寄生粘虫海藻糖含量变化主要因素; 粘虫对中红侧沟茧蜂的寄生表现相当强的适应性和忍受力。     

复配杀虫剂BtA对棉铃虫的杀虫效果及对天敌中红侧沟茧蜂蛹和成虫的触杀毒性(英文)

为了科学施药, 合理保护和利用天敌对棉铃虫Helicoverpa armigera进行综合防治, 本研究在室内测定和比较了复配杀虫剂BtA和7种常用杀虫剂（阿维菌素、 Bt、 β-氯氰菊酯、辛硫磷、定虫隆、氰戊菊酯和丁硫克百威）对棉铃虫的杀虫效果及对其天敌中红侧沟茧蜂Microplitis mediator蛹和雌成虫的触杀毒性。采用浸叶法测定杀虫剂在室内72 h内对棉铃虫3龄幼虫的杀虫效果, 结果表明： 与其他杀虫剂相比, BtA对棉铃虫幼虫具有更高的毒性和致死效应 (LC₅₀=0.7364 mg/mL)。将棉铃虫3龄幼虫接到用浓度4 mg/mL上述杀虫剂分别处理过的大白菜上24, 48和72 h, 发现其死亡率之间存在显著差异（P≤0.05）。但在72 h后, BtA和其他杀虫剂对棉铃虫幼虫的杀虫效果之间并无显著差异(P>0.05)。BtA施药后, 随着时间的延长, 棉铃虫幼虫的死亡率也在增加。另外, 通过杀虫剂对寄生蜂中红侧沟茧蜂蛹和雌成虫的触杀毒性的生物测定发现： 与β-氯氰菊酯、 氰戊菊酯和丁硫克百威相比, BtA对中红侧沟茧蜂蛹和雌成虫的毒性较低, 对其蛹和雌成虫致死率分别仅为13.82%和7.33%。本研究证明BtA对鳞翅目害虫具有中等毒性, 而对寄生蜂中红侧沟茧蜂则具有较低毒性。     

Functional characterization of a Niemann–Pick type C2 protein in the parasitoid wasp Microplitis mediator

Niemann–Pick type C2 (NPC2) is a type of small soluble protein involved in lipid metabolism and triglyceride accumulation in vertebrates and arthropods. Recent studies have determined that NPC2 also participates in chemical communication of arthropods. In this work, two novel NPC2 proteins (MmedNPC2a and MmedNPC2b) in Microplitis mediator were identified. Real‐time quantitative PCR (qPCR) analysis revealed that MmedNPC2a was expressed higher in the antennae than in other tissues of adult wasps compared with MmedNPC2b. Subsequent immunolocalization results demonstrated that NPC2a was located in the lymph cavities of sensilla placodea. To further explore the binding characterization of recombinant MmedNPC2a to 54 candidate odor molecules, a fluorescence binding assay was performed. It was found MmedNPC2a could not bind with selected fatty acids, such as linoleic acid, palmitic acid, stearic acid and octadecenoic acid. However, seven cotton volatiles, 4‐ethylbenzaldehyde, 3,4‐dimethylbenzaldehyde, β‐ionone, linalool, m‐xylene, benzaldehyde and trans‐2‐hexen‐1‐al showed certain binding abilities with MmedNPC2a. Moreover, the predicted 3D model of MmedNPC2a was composed of seven β‐sheets and three pairs of disulfide bridges. In this model, the key binding residues for oleic acid in CjapNPC2 of Camponotus japonicus, Lue68, Lys69, Lys70, Phe97, Thr103 and Phe127, are replaced with Phe85, Ser86, His87, Leu113, Tyr119 and Ile143 in MmedNPC2a, respectively. We proposed that MmedNPC2a in M. mediator may play roles in perception of plant volatiles.     

中华蜜蜂化学感受蛋白基因Acer-CSP1克隆与表达特征分析

化学感受蛋白(chemosensory proteins, CSPs)是昆虫化学感受系统中重要的组成部分之一。本研究克隆了中华蜜蜂Apis cerana cerana化学感受蛋白基因Acer-CSP1, 其核苷酸全长351 bp （GenBank登录号为FJ157352）, 编码116个氨基酸残基, 预测蛋白分子量为13.85 kD, 等电点为4.89, 且含有4个保守的半胱氨酸残基, 均符合昆虫CSPs的一般特征, 且与意蜂CSP1基因具有99.1%的相似性, 与其他昆虫也有45.3%~68.0%的相似性。利用2^-ΔΔCt法及绝对定量法的real-time PCR技术对Acer-CSP1在中蜂不同器官表达特征进行了研究, 得出的一致结论为Acer-CSP1显著水平地高丰度表达于中华蜜蜂触角, 其次大量表达于头部。由于触角为中华蜜蜂最主要的嗅觉器官, 而头部则具有发达的感觉神经系统和味觉系统, 这也提示Acer-CSP1极有可能参与中华蜜蜂的嗅觉以及其他化学感受功能。     

棉铃虫化学感受蛋白HarmCSP6二聚体的组织表达分析及气味结合特征

为了研究棉铃虫Helicoverpa armigera (Hübner)化学感受蛋白（chemosensory proteins, CSPs）在嗅觉识别过程中的功能, 本研究克隆并在原核细胞中表达了棉铃虫化学感受蛋白HarmCSP6, Western blot和快速液相色谱（fast protein liquid chromatography, FPLC）检测证实该HarmCSP6蛋白以二聚体的形式表达。实时荧光定量PCR检测发现HarmCSP6基因在雌雄虫触角中表达量很高, 在雌虫足及翅中也有一定程度的表达。该二聚体蛋白与22种气味分子的荧光竞争结合实验结果表明, 该蛋白与醛类及萜烯类等气味小分子具有较强的结合能力。通过研究该蛋白与小分子的结合, 筛选出合适的气味, 从而为开发棉铃虫引诱剂及驱避剂提供理论依据。     

中国侧沟茧蜂属一新种(膜翅目:茧蜂科:小腹茧蜂亚科)

本记述从寄主斜纹夜蛾饲养得到的侧沟茧蜂属Microplitls Forster 1新种：双斑侧沟茧蜂Microplitis bicoloratus Chert,sp．nov．。模式标本保存于福建农林大学植保学院益虫室。