一株嗜热链球菌产多糖条件的优化

使用单因素和正交试验设计相结合的方法对培养基配方及培养条件进行优化提高嗜热链球菌AR333的胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)产量.获得最佳培养基配方为:脱脂乳粉15％(w/v)、半乳糖1％ (w/v)、大豆蛋白胨0.5％ (w/v)、磷酸氢二钾0.1％ (w/v).最佳培养条件为:接种量3％,40℃,初始pH6.5,发酵时间16 h.优化后嗜热链球菌AR333的EPS产量可达256.97mg/L,比优化前的产量提高了3.6倍.     

聚乙二醇对ELP[I]40相变温度的影响

目的:研究聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)对类弹性蛋白(elastin-like protein,ELP)ELP[I]40相变温度(inverse temperature transition,Tt)的影响.方法:设计并合成ELP[I]40基因(由40个(VPGIG)五肽单元串联组成),表达纯化后,检测不同浓度PEG条件下ELP[I]40的Tt.结果:在ELP[I]40终浓度为25 μmol/L时,PEG浓度为5％,10％,15％,20％,25％时分别使Tt由29℃降至26.5℃,22℃,15.2℃,8.8℃,2.5℃.结论:PEG可降低ELP的Tt,可通过PEG促进ELP重组蛋白分离纯化.     

EGCG通过STAT3抑制血管内皮细胞炎性因子表达

[目的]研究茶多酚EGCG对脂多糖(LPS)诱导的血管内皮细胞炎性因子表达的抑制作用及其机制。[方法]利用MTT和流式检测LPS和EGCG对血管内皮细胞的毒性作用,实时荧光定量PCR检测炎性因子mRNA的水平,多重液相蛋白定量技术检测炎性因子的蛋白表达,Western Blot检测STAT3及其磷酸化水平。[结果]EGCG最大浓度(100μmol/L)对血管内皮细胞无毒性;LPS处理可显著或极显著诱导炎性因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8)在mRNA和蛋白水平的表达(P<0.05或P<0.01),LPS对炎性因子的促进作用具有剂量效应;25μmol/L或50μmol/L EGCG预处理能极显著抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎性因子的表达(P<0.01),同时抑制LPS诱导的STAT3磷酸化;STAT3抑制剂能显著增强EGCG抗炎效果。[结论]EGCG通过STAT3通路抑制LPS诱导的血管内皮细胞炎症因子的表达。     

L-羟脯氨酸-Zn(Ⅱ)的配合机制及其抗氧化性研究

以L-羟脯氨酸(Hyp)和ZnSO4制备Hyp-Zn(Ⅱ)配合物,研究其配合机制及抗氧化能力。与L-羟脯氨酸相比,配合物在1100cm-1处出现了一新的红外吸收峰,说明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物的差热-热重图与L-羟脯氨酸相比,在290℃和375℃的吸热峰消失了,确证L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物核磁核磁共振图中3.5~3.9ppm的羧基氢和羟基氢的信号峰的消失,表明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生配合的位置是L-羟脯氨酸的α碳的羧基或γ碳的羟基氧;从配合物的原子力显微形貌相图可见数个L-羟脯氨酸围绕Zn(Ⅱ)形成的配合结构。透析实验结果证实L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)配合的比例为4∶1(mol/mol)。上述测定和表征表明所形成配合物的分子式为Zn(Hyp)4.H2O。(Hyp)4-Zn(Ⅱ)配合物抑制Zn(Ⅱ)产生的羟基自由基,抑制百分比为75.5%,其总抗氧化能力为80.167u/mL,抗超氧阴离子活力为53.19u/mL。     

壳聚糖-Zn(Ⅱ)亲和层析介质的制备及表征

以自制的壳聚糖微球为载体,环氧氯丙烷(ECH)为活化剂,亚氨基二乙酸(IDA)为螯合配基,Zn2+为螯合金属离子制备壳聚糖-Zn(II)亲和层析介质。最佳活化工艺:M壳聚糖(g)∶VECH(m L)为1∶4、Na OH浓度为1.2 mol/L、活化温度为50℃,活化时间为4 h,测得环氧基修饰密度达0.2472 mmol/g;最佳螯合工艺:IDA作为配基、浓度为0.6 mol/L、反应温度为70℃、反应时间为6 h,Zn Cl2作为螯合金属盐、浓度为0.1 mol/L、反应时间为3 h,Zn2+螯合量达到最大值。通过红外光谱表征,证明壳聚糖与Zn(II)发生了螯合配位反应,生成了壳聚糖-Zn(II)配合物。     

类弹性蛋白标签在大肠杆菌周质空间中表达研究

旨在研究类弹性蛋白[I]_(40)(elastin-like polypeptide[I]_(40),ELP[I]_(40))在大肠杆菌周质空间的表达。构建表达载体pIG6LH/ELP[I]_(40)及pIG6LH/ELP[I]_(40)+Trx,分别将构建的表达载体转化入表达宿主菌E.coli BLR(DE3),IPTG诱导表达,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)技术纯化蛋白。测定ELP[I]_(40)及ELP[I]_(40)+Trx蛋白相变温度(T_t),检测ELP[I]_(40)、ELP[I]_(40)+Trx蛋白浓度及NaCl对相变温度的影响。结果显示,经3轮ITC纯化得到了ELP[I]_(40)、ELP[I]_(40)+Trx蛋白。分别测定ELP[I]_(40)和ELP[I]_(40)+Trx在10、25、50、75和100μmol/L浓度下的T_t,其T_t依次为31.5℃、29℃、27℃、26℃、25℃和31.8℃、29.5℃、27.5℃、26℃、25.5℃;测定了不同浓度的NaCl对T_t影响,在ELP[I]_(40)和ELP[I]_(40)+Trx终浓度为25μmol/L,NaCl浓度为0.25、0.5、0.75、1.00和1.25 mol/L时,分别使ELP[I]_(40)的T_t由29℃降至24.5℃、22℃、19℃、15℃和11.5℃,使ELP[I]_(40)+Trx的T_t由29.5℃降至25℃、23℃、20.2℃、15.5℃和11.8℃。在大肠杆菌周质空间表达的ELP[I]_(40)与胞内表达的具有相同的理化性质,ELP可作为在大肠杆菌周质空间表达的蛋白质分离纯化标签。     

刚毛柽柳（Tamarix hispida）种子萌发特性的研究

目的:研究温变周期、盐分和储藏时间对刚毛柽柳种子萌发的影响.方法:利用不同温变周期,不同浓度NaCl溶液,储藏时间等处理对刚毛柽柳种子进行萌发试验,测定其萌发率和萌发速度.结果:在5/15℃、5/25℃、15/25℃和25/35℃(暗/光:12h/12h)四个温度周期下,刚毛柽柳种子的萌发率均大于90%;在5/25℃、15/25℃和25/35℃三个温变周期下,刚毛柽柳种子萌发迅速,初始萌发时间均仅为10h;低浓度的NaCl溶液(≤0.60mol/L)促进种子萌发,高于1.00mol/L浓度的NaCl溶液抑制种子萌发,当浓度增高至1.40mol/L时,种子萌发率降低为0;将在NaCl溶液中处理8d未萌发的种子转移至蒸馏水中后,原来较高浓度(≥0.80mol/L)处理的种子具有较高的萌发恢复率(>70%);种子寿命约11个月.结论:温变周期25/35℃(暗/光=12/12h),低浓度的NaCl溶液(≤0.60mol/L)最适宜刚毛柽柳种子的萌发.     

L-羟脯氨酸-Zn(Ⅱ)的配合机制及其抗氧化性研究

以L-羟脯氨酸(Hyp)和ZnSO₄制备Hyp-Zn(Ⅱ)配合物,研究其配合机制及抗氧化能力。与L-羟脯氨酸相比,配合物在1100cm^－1处出现了一新的红外吸收峰,说明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物的差热-热重图与L-羟脯氨酸相比,在290℃和375℃的吸热峰消失了,确证L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生了配位作用;配合物核磁核磁共振图中3.5～3.9ppm的羧基氢和羟基氢的信号峰的消失,表明L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)发生配合的位置是L-羟脯氨酸的α碳的羧基或γ碳的羟基氧;从配合物的原子力显微形貌相图可见数个L-羟脯氨酸围绕Zn(Ⅱ)形成的配合结构。透析实验结果证实L-羟脯氨酸与Zn(Ⅱ)配合的比例为4∶1（mol/mol）。上述测定和表征表明所形成配合物的分子式为Zn(Hyp)₄·H₂O。（Hyp）₄-Zn(Ⅱ)配合物抑制Zn(Ⅱ)产生的羟基自由基,抑制百分比为75.5%,其总抗氧化能力为80.167u/mL,抗超氧阴离子活力为53.19u/mL。     

HPLC法测定大鼠血浆中EGCG的血药浓度

目的:建立快速、高效、灵敏的HPLC法测定大鼠血浆中的EGCG血药浓度。方法:以睾丸酮为内标物,血浆经盐酸和乙酸乙酯等去除蛋白。采用Agilent 20RBAX SB-C18色谱柱,乙腈-0.3%乙酸为流动相,流速1.0ml/min,检测波长为280nm,柱温40℃。结果:EGCG和内标的出峰时间分别为12.21min和15.4min。EGCG在0.05μg/ml-100μg/ml范围内线性关系良好(R2=0.9920),高、中、低3种浓度下的日内、日间精密度RSD均低于15%,相对回收率与绝对回收率均在100±15(%)范围内,稳定性好。结论:本方法灵敏、准确、高效,适用于大鼠血浆中EGCG的血药浓度检测。     

绿茶、乌龙茶、红茶中的主要组分和酚类化合物抑制脂肪氧合酶活性和抗油脂自动氧化特性的研究

绿茶、乌龙茶和红茶中含有多种抑制脂肪氧合酶及抗油脂自动氧化的有效成分。实验结果表明,其中以表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)的抗氧化活性最强,延缓猪油自动氧化诱导期为55.5小时,比无添加抗氧化成分的延长11倍,抑制脂肪氧合酶活性的IC_(50)值为10.0μmol/L。茶黄素单酯-2B(TFM-2B)和茶黄素双酯(TFD)比EGCG抑制脂肪氧合酶活性的效果更强,其IC_(60)值分别为0.57和0.23μmol/L。在三种茶叶的四种溶剂萃取物中,以乙酸乙酯萃取物的抗氧化活性最强。本文还研究了茶叶中主要生物活性物质的分离与纯化方法,以及抗氧化活性与结构的关系。     

利用甲壳素固定大肠杆菌（E.coli）细胞转化苯丙酮酸形成L—苯丙氨酸的研究

利用甲壳素作为固定化介质,能够保留83.3％的游离细胞转氨酶活性,以0.35mol/L苯丙酮酸为前体,于37℃下反应9小时,可产L-苯丙氨酸54.3g/L,其克分子转化率为94％。同时,用25％戊二醛溶液(30μl/g·cell)处理细胞1小时,再用0.3％OP溶液浸泡处理15小时,可以使固定化细胞转化率有较大的提高,Mg~(2+)对转化也有促进作用。     

关于ISSR反应弥散背景消除方法的几点讨论

目的:讨论消除ISSR反应弥散背景的一些方法。方法:对于不同的反应条件,分别进行梯度试验,包括:退火温度(45℃、47℃、49℃、50℃)、不同引物浓度(0.2μmol/L、0.4μmol/L、0.6μmol/L、0.8μmol/L)、不同模板浓度(50ng、100ng、200ng)及不同纯度。结果:梯度试验结果如图1~10所示。退火温度47℃,引物浓度0.6μmol/L,模板浓度100ng左右,纯度高的模板,在这些条件下得到的电泳图谱比较清楚。结论:导致弥散背景产生的主要原因有:过低的退火温度;不适当引物浓度;较高的模板浓度;还有模板纯度不高。     

EGCG对H2O2诱导HLE细胞氧化损伤的保护作用

目的:探讨表没食子酸酯(EGCG)对体外培养的人晶状体上皮(human lens epithelial,HLE)细胞氧化损伤的保护作用及可能机制。方法:HLE细胞传代培养,分为阴性对照组:以正常培养液培养;氧化损伤组:100μmol·L~(-1)的H_2O_2作用12 h;EGCG低浓度组:10μmol·L~(-1)EGCG孵育24 h后,加入H_2O_2作用12 h;EGCG高浓度组:100μmol·L~(-1)EGCG孵育24 h后,加入H_2O_2作用12 h。MTT比色法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,Hochest33258染色观察凋亡细胞形态,比色法检测凋亡相关因子caspses-3及caspase-9的表达。结果:EGCG能明显抑制H_2O_2诱导的HLE细胞活力的下降,用不同浓度EGCG处理后,HLE细胞活性分别提高到51.00%±2.37%和63.67%±2.29%,与氧化损伤组(40.33%±2.86%)比较差异具有统计学意义(P0.05);经不同浓度EGCG处理后,HLE细胞凋亡率分别下降至33.33±3.12%和22.80±1.67%,与氧化损伤组(43.03±2.43%)比较差异具有统计学意义(P0.05);此外,EGCG还能明显减少H_2O_2所致HLE细胞内caspses-3及caspase-9的表达。结论:EGCG通过抑制caspses-3及caspase-9的表达有效抑制了H_2O_2对HLE细胞的损伤,从而为其用于治疗HLE细胞损伤提供可靠的实验依据。     

蓝莓提取物对副溶血性弧菌的抑制作用

本文以北高丛蓝莓中的栽培品种埃利奥特为原料,通过L16(43)正交实验,分析比较了16种提取物对副溶血性弧菌的抑菌效果及各提取物的pH值.结果表明:在30℃下,以65％乙醇(w/w)为溶剂,超声提取25min为最优提取条件.采用此条件得到的提取物具有最低的pH值,在浓度为100和40 mg/mL时,对副溶血性弧菌的抑菌率分别达100％和81.3％.     

表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠运动疲劳的拮抗作用

目的:探索腹腔注射表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对小鼠运动疲劳的拮抗作用。方法:将120只小鼠随机分为生理盐水对照(1 ml/kg·d)(A组)、EGCG低浓度组(10 mg/kg·d)(B组)、EGCG高浓度防护组(50 mg/kg·d)(C组)(n=40)。建立疲劳小鼠训练模型,每天腹腔注射不同剂量的EGCG或生理盐水,持续给药28 d。检测小鼠负重游泳、轮转耐力、爬杆、动物耐缺氧时间及血乳酸水平(BLA)、血尿素氮(BUN)、血乳酸脱氢酶(LDH)及肝糖原(LG)、肌糖原(MG)等疲劳相关指标。结果:腹腔注射EGCG组(B组、C组)小鼠负重游泳、爬杆、轮转耐力持续时间及耐缺氧存活时间显著延长,且较对照组相比具有显著性差异(P0.05,P0.01);同时提高小鼠血清中LDH浓度,降低BLA、BUN浓度及升高MG和LG含量。高浓度EGCG的抗疲劳效果与低浓度组相比更为明显(P0.05)。结论:EGCG具有拮抗小鼠运动疲劳的作用。     

黄鳝ISSR-PCR反应体系的建立及条件优化

以黄鳝基因组DNA为模板,采用正交试验设计方法,对各反应因子、引物退火温度和循环参数进行优化.建立了黄鳝的最适ISSR-PCR反应体系,25 μl反应体系中含2.5 mmol/ L Mg2+,250 μmol/ L dNTPs,0.25 μmol/ L 引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,30 ng DNA模板.最佳反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性40 s,48～57℃复性40 s(随引物而确定),72℃延伸1.5 min,循环次数40;72℃延伸10 min.利用所建立的ISSR反应体系,获得了清晰、重复性好、多态性高的DNA谱带.     

壳聚糖Fe（Ⅲ）配合物的合成、表征及抑菌性能

合成了壳聚糖Fe(Ⅲ)配合物,利用IR、UV、和TG-DTA对配合物进行了表征.研究了壳聚糖及壳聚糖铁(Ⅲ)配合物对常见的两种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌)的抑菌性能.结果表明:水溶性的壳聚糖在配合前后,其结构表征发生了一定的变化,并且壳聚糖铁(Ⅲ)配合物的抑菌性能比水溶性壳聚糖本身显著提高(P＜0.05).     

壬基酚对金鱼（Carassiusauratus ）胚胎发育毒性的初步研究

目的:观察环境激素壬基酚(Nonylphenol,NP)对金鱼胚胎发育的毒性效应。方法:在繁殖季节选取雌雄健康成年金鱼,采用人工受精的方法获取金鱼受精卵于23℃培养箱孵育。将正常发育的囊胚早期金鱼胚胎(50枚胚胎/培养皿)分别暴露在1μmol·L~(-1)、4μmol·L~(-1)、8μmol·L~(-1)、12μmol·L~(-1)和16μmol·L~(-1)的NP实验液中,设空白对照。通过显微成像技术观察NP暴露对金鱼胚胎发育形态、不同发育阶段胚胎死亡率、受精后72小时(72 hpf)孵化率及畸形率的影响。从原肠期开始每隔12 h观察一次。结果:低浓度NP主要影响金鱼胚胎晚期发育,使其尾部脊索弯曲上翘;高浓度NP可导致金鱼胚胎卵凝结、发育延迟、组织坏死、尾部卷曲、体轴缩短并出现血栓。各发育阶段胚胎死亡率和72 hpf畸形率随NP浓度升高而增加,72 hpf孵化率则随NP浓度升高而降低;NP对金鱼胚胎24 h、48 h、72 h的半数致死浓度(LC50)分别为:16.28μmol·L~(-1)、8.27μmol·L~(-1)和6.52μmol·L~(-1)。结论:NP对金鱼胚胎具有明显发育毒性,金鱼胚胎对低浓度NP也具有较高敏感性,在评价环境激素胚胎发育毒性方面具有潜在应用价值。     

正交试验优化八角ISSR-PCR反应体系

利用正交试验设计研究Taq DNA聚合酶、DNA模板、引物(UBC 886)、dNTP、Mg2+浓度5个因素对云南八角ISSR-PCR反应的影响,建立其最佳反应体系。结果表明:25μL的反应体系中5个因子的最佳水平为:Mg2+3 mmol/L、Taq DNA聚合酶0.5 U、DNA模板0.016 ng、引物0.8μmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L。PCR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸1 min,40次循环;72℃最后延伸7 min,4℃保存。     

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制脂多糖诱导人视网膜内皮细胞中调节活化正常T细胞表达与分泌趋化因子的表达

本研究旨在探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)对脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人视网膜内皮细胞(human retinal endothelial cells,HRECs)炎症反应通路中调节活化正常T细胞表达与分泌趋化因子(regulated upon activation normal T cell expressed and secreted,RANTES)表达的影响及可能机制。将HRECs作为研究对象,分别用实时细胞计数法和非同位素细胞增殖法检测LPS(50～250 ng/mL)和EGCG(0～200μmol/L)对HRECs的毒性作用,确定合适的实验药物浓度。再将细胞随机分为正常对照组、LPS组和LPS+不同浓度EGCG(100、50、25、12.5、6.25μmol/L)共7组,用不同浓度EGCG预处理2 h,再加入LPS刺激24 h后,酶联免疫吸附法测定各组培养上清液中RANTES的表达水平,Western免疫印迹法检测蛋白激酶Akt及其磷酸化水平。结果显示,LPS可显著刺激诱导HRECs产生RANTES,EGCG抑制LPS诱导的RANTES表达,作用呈剂量依赖性。免疫印迹结果也显示,LPS对HRECs炎症过程中的Akt通路起重要作用,EGCG可显著抑制LPS诱导HRECs中Akt信号分子的蛋白磷酸化水平。以上结果提示,EGCG能有效抑制LPS诱导HRECs中RANTES的表达,其机制可能与抑制Akt信号通路有关。