人溶菌酶基因的合成和克隆

用固相亚磷酰胺法合成了人溶菌酶的全基因,全长为409bp,它包括了编码人溶菌酶的结梅基因,起始密码于ATG,终止密码子TAA、TGA,以及两端的BamHI和SphI的识别顺序。整个基因分成24个寡聚核苷酸片段进行合成,每个片段长度分别为26至38个核苷酸．然后用两种方法酶促连接成完整的人溶菌酶基因。基因克隆到M13载体上。用点杂交和限制酶酶切分析确定阳性克隆株。用双脱氧链终止法进行序列分析,证实所合成的人溶菌酶基因序列与设计的完全一致。     

迄今最长的合成基因

将近两年前,试图合成人类干扰素基因,那是不可能的。从诱导细胞产生干扰素,通过反转录产生DNA,开始测定出干扰素基因的核苷酸顺序,正好是两年了。此后,从mRNA制出CDNA中表明,在人类染色体组中的干扰素基因可能是一个家族--有些相当于白细胞干扰素(α--干扰素),较少的相当于成纤维细胞干扰素(β-干扰素)及更少量的免疫干扰素(γ-干扰素)。这些干扰素中的每种干扰素的氨基酸顺序还没     

迄今最长的合成基因

将近两年前,试图合成人类干扰素基因,那是不可能的。从诱导细胞产生干扰素,通过反转录产生DNA,开始测定出干扰素基因的核苷酸顺序,正好是两年了。此后,从mRNA制出CDNA中表明,在人类染色体组中的干扰素基因可能是一个家族——有些相当于白细胞干扰素(α——干扰素),较少的相当于成纤维细胞干扰素(β—干扰素)及更少量的免疫干扰素(γ—干扰素)。这些干扰素中的每种干扰素的氨基酸顺序还没     

干扰素(IFN)研究的两个主要发现

人干扰素有三大类:HuLeIFN、HuF IFN和HuI IFN。IFN基因在细菌中已实现克隆,并表现其生物活性。在研究细菌IFN的过程中有两个主要的发现:-- 一、发现人细胞中含有几个编码的LeIFN的基因,这个多基因的发现,先是C.Weissmann及其同事(苏黎世大学)发现的,尔后Goeddel D.和Stebbing N.及其同事(基因工程公司和Roche分子生物研究所)也得到类似结果。LeIFN基因最低限度有5个位点或10个位点,他们发现个体基因的核苷酸序列彼此约有15％的不同。然而不是所有的显性基因都能表达,基因工程公司研究工作者测定了其中8个核苷酸序列,发现一个含有终止信号,它阻止指令完全IFN蛋白的合成; 二、在LeIFN基因序列分析研究中发现LeIFN基因缺少间隙子(intron),其DNA片段定位于大多数真核基因,不编码蛋白质结构,迄今只有缺少IFN的其他真核生物基因中找到编码组蛋白,涉及基因表达的控制。 研究者在没有间隙子情况下较易建造生命,他是通过把人基因放入细菌细胞中而建造的细菌“IFN因子”,这就不必担忧细菌是否有产生蛋白质的机构(这种蛋白质是间隙子编码的,而间隙子在细菌细胞中又没有找到),事实上,基因工程公司和苏黎世研究者发现,LeIFN基因如系在细菌合适序列上,则细菌可制造LeIFN,为此,携带人IFN基因的细菌可产生IFN达200-250毫克/升菌液,据Weissmann的意见,基因工程方法产     

干扰素(IFN)研究的两个主要发现

人干扰素有三大类:HuLeIFN、HuF IFN和HuI IFN。IFN基因在细菌中已实现克隆,并表现其生物活性。在研究细菌IFN的过程中有两个主要的发现:—— 一、发现人细胞中含有几个编码的LeIFN的基因,这个多基因的发现,先是C.Weissmann及其同事(苏黎世大学)发现的,尔后Goeddel D.和Stebbing N.及其同事(基因工程公司和Roche分子生物研究所)也得到类似结果。LeIFN基因最低限度有5个位点或10个位点,他们发现个体基因的核苷酸序列彼此约有15％的不同。然而不是所有的显性基因都能表达,基因工程公司研究工作者测定了其中8个核苷酸序列,发现一个含有终止信号,它阻止指令完全IFN蛋白的合成; 二、在LeIFN基因序列分析研究中发现LeIFN基因缺少间隙子(intron),其DNA片段定位于大多数真核基因,不编码蛋白质结构,迄今只有缺少IFN的其他真核生物基因中找到编码组蛋白,涉及基因表达的控制。 研究者在没有间隙子情况下较易建造生命,他是通过把人基因放入细菌细胞中而建造的细菌“IFN因子”,这就不必担忧细菌是否有产生蛋白质的机构(这种蛋白质是间隙子编码的,而间隙子在细菌细胞中又没有找到),事实上,基因工程公司和苏黎世研究者发现,LeIFN基因如系在细菌合适序列上,则细菌可制造LeIFN,为此,携带人IFN基因的细菌可产生IFN达200—250毫克/升菌液,据Weissmann的意见,基因工程方法产     

人恶性疟杂合多肽抗原基因化学合成及克隆

本文报道用固相亚磷酰胺法合成人恶性疟杂合多肽抗原基因。基因全长为216bp,分为10个寡聚核苷酸片段分别合成,然后经T4 DNA连接酶按设计顺序连接成完整的杂合抗原基因,重组到噬茵体M13 mp 18 RF DNA内,转染大肠杆菌JM109。用分子杂交和酶切分析筛选出重组克隆体。经序列分析,证明所合成的人恶性疟杂合多肽抗原基因与所设计完全一致。     

导入小鼠L细胞的人α干扰素基因的调控转录

用无性繁殖的人染色体干扰素-α_1基因转化小鼠细胞,此基因同疱疹胸苷激酶基因连接作为筛选标记。13~*个细胞系中的8个含有人干扰素基因。用新城病毒侵染来刺激人干扰素mRNA的合成--此合成过程与内源的小鼠干扰素基因合成mRNA同时进行。     

人表皮生长因子基因的化学合成和克隆及其在酵母中的表达

用固相亚磷酰胺法合成了人表皮生长因子基因,全长为173个核苷酸,它被分成8个寡核苷酸,分别在DNA合成仪上合成。经分离纯化后的寡聚核苷酸进行酶促连接,然后被克隆到噬菌体M13mpl8中,克隆经分子杂交、限制酶酶切以及DNA序列分析检测,证明合成的人表皮生长因子基因和设计的完全一致。将人表皮生长因子基因的DNA片段插入酵母分泌型表达载休YFD59 HindⅢ位点中,建成表达人表皮生长因子基因的质粒YFDl04,再将此质粒转化酿酒酵母,所得转化子经摇瓶发酵,发酵上清液用受体结合试验表明有人表皮生长因子表达。     

人α-心钠素全基因的化学合成

用固相亚磷酰胺法(solid-phase phosphoramidite method)合成了人α-心钠素(简称α-hANP)的全基因。合成的α-hANP基因全长为96bp,包括编码α-hANP的结构基因、基因5＇端的谷氨酸(作为表达产物用内肽酶Glu-C专一裂解的位点)密码子GAA、基因3＇端的终止信号TGA及基因两端的接头部分。基因分7个寡聚核苷酸片段在DNA合成仪上合成,然后一次性酶促连接成为完整的α—hANP双链基因。化学合成的基因克隆到M13载体上,经分子杂交鉴定筛选出的α-hANP基因克隆株,用双脱氧链终止法进行序列分析,证明核苷酸顺序正确。     

猪干扰素基因的克隆和定位

最近,法国农业研究院格里尼翁试验站的病毒学研究人员从猪白细胞干扰素基因中鉴别出一个猪α-干扰素基因,将其转移到大肠杆菌的质粒DNA上,同时对核苷酸顺序进行了测定。研究人员指出,这个顺序的78％和人α-干扰素是一致的。此外,猪α-干扰素是由10多个亲缘基因编码的非常类似的蛋白质群所组成。法国农业研究院细胞遗传学研究人员用放射性同位素标记这个基因,在猪染色体上进行了定位。据报道,这些研究不仅使法国在不久的将来能     

T4多聚核苷酸激酶的原核表达、纯化及初步应用

原核表达、纯化T4多聚核苷酸激酶,并尝试将纯化的T4 PNK用于短探针序列的连接。本研究以合成的pseT基因为模板,PCR扩增出带有NdeⅠ和Bam HⅠ位点的目的片段,构建pseT-pET-15b原核表达载体,并转入E. coli ER2566中诱导表达。Ni-Agarose亲和层析柱纯化重组蛋白后,再进行Western blot鉴定。用纯化后再浓缩的T4 PNK参与探针连接反应,并设置商品T4 PNK和阴性对照。PCR扩增成功获得大于900 bp的目的基因片段,原核表达载体pseT-pET-15b构建成功,经诱导表达的重组蛋白分子量大小约为35 kD,Western blotting确认蛋白表达正确,浓缩后的蛋白浓度达到826μg/m L。电泳结果显示,重组T4 PNK在探针连接中效果较好。本研究成功表达并纯化了可溶性的T4多聚核苷酸激酶,且具有较好的活性,该蛋白可进一步用于后续大批量探针连接反应或其他相关研究,具有一定实际应用价值。     

最早传入北京地区的SARS冠状病毒S基因序列分析和克隆

SARS冠状病毒的spike(S)蛋白对病毒的致病力至关重要,也是机体特异性体液和细胞免疫主要针对的靶分子。从北京地区最早发现的SARS患者咽拭子细胞培养上清中提取病毒RNA,用反转录巢式聚合酶链式反应(RTPCR)分6个片段扩增出S基因全序列,用TA载体克隆后进行DNA序列分析,再通过重叠PCR将6个片段连接成一条完整的S基因并克隆测序。DNA测序结果表明病毒S基因序列与报告的BJ01株SARS冠状病毒S基因序列完全一致,用重叠PCR将6个S基因片段连接成了一条完整的S基因,插入到pGEMT载体后读序完全正确。上述结果表明最早传入北京地区的病毒与新近报告的BJ01株SARS冠状病毒在分子流行病学上具有同源特征,重叠PCR技术可以用于有效连接多个基因片段。S区全基因的克隆为进一步研究该基因的功能和DNA疫苗等研究提供了基础。     

应用PCR-酶切连接法合成全长sFat1基因

人工合成基因在生命科学研究中有着重要的意义, 因此基因合成是一项常用技术。长片段基因的合成比较困难, 常常因为合成中碱基序列的错配、突变等原因而导致失败。研究者们所熟知的几种现行的方法仍然难以解决该问题。本研究在作者自身的工作经验中建立了一种新的基因合成方法, 即PCR-酶切连接法。应用该方法成功地将化学合成的27个寡聚核苷酸片段(每个片段长60～68 bp)拼接组装起来, 获得了完整的总长为1 226 bp的基因sFat-1。整个过程仅采用3轮PCR(共7个反应)、2轮的酶切连接(3个反应), 而且未曾出现任何偏离预期基因序列的差错。该方法步骤较少, 技术简单, 出错极少, 是合成长基因序列很好的选择。     

干扰素基因

干扰素(IFN)是一类蛋白质,它作用于靶细胞产生抗病毒作用,它还具有抑制细胞生长和调节免疫功能等作用。干扰素的研究无论在理论上还是在临床应用上都有重要意义。随着基因工程技术的发展,用基因工程来研究和生产干扰素便成为科学家努力的目标了。目前,从一公斤大肠杆菌菌体可生产2克α-干扰素(IFN-α)。IFN-α基因在酵母中的表达也获得了成功。β-干扰素(IFN-β)及r-干扰素(IFN-r)的基因工程生产也已成功。干扰素基因工程的研究又促进两个方面的研究得到重要发展,一是干扰素基因结构的研究取得十分重要的进展;另一是干扰素的基因人工合     

人的转化生长因子-α(TGF-α)基因的化学合成和克隆

人的转化生长因子-α(TGF-α)是一由50个氨基酸组成的多肽,在肿瘤的发生和生长过程中可能有着重要的调节作用,其抗体可用于肿瘤的诊断。为了进一步开展对TGF-α的理论和实际应用的研究,我们化学合成并克隆了人的转化生长因子基因,由计算机辅助设计基因合成顺序,通过固相亚磷酸三酯法化学合成了TGF-α的七个基因片段,长度为29至60寡聚核苷酸;通过酶促连接反应一次性地快速构建了完整的TGF-α基因,并将两侧5′端无磷酸基的TGF-α基因直接克隆于pWR13质粒中,避免了小肽基因形成多聚体的可能性。通过顺序分析证明合成的TGF-α基因的顺序正确,但发现有一个克隆株中有G→A变异。     

经体外缺失诱变组建人杂交干扰素αA/γ

使用寡核苷酸指导的定点突变方法,将人αA型干扰素的完整基因与γ干扰素C端16个氨基酸的编码序列融合,在噬菌体λP_L启动子控制下,合成了一个杂交蛋白质。此蛋白质经抗人α干扰素单克隆抗体纯化后,在MDBK细胞上具有抗病毒活性,并像γ干扰素一样,可被依赖于cAMP的蛋白激酶磷酸化。[γ-~(32)P]杂交蛋白与MDBK细胞的结合,可被αA型干扰素大大抑制(70％)。     

我国首次用遗传工程方法实现细菌产生入干扰素(IFN)

中国医学科学院病毒研究所科研人员用遗传工程首先在我国成功地组建细菌合成人干扰素,为进一步大量生产干扰素打下了基础。 该所从1978年开始重视干扰素遗传工程的研究,1979年从人白细胞制取α-ILN,并用于临床,证明人脐带白细胞诱生IFN能力比成年人白细胞高。1980年建立了mRNA转     

核酸类干扰素诱导物的高分辨核磁共振研究

配对良好的双链螺旋结构的聚核苷酸是一种有效的干扰素诱导物。它具有广谱的抗病毒和抑制多种肿瘤生长作用。临床上受到重视的有聚A:U和聚I:C等。一般认为,聚I:C是疗效较佳的一种合成干扰素诱导物。有人认为干扰素合成的遗传机制是在于干扰素基因密码。诱导物作用于干扰素操纵子的0位点上的抑制物,即这个抑制物是辨认分子。又因干扰素诱导物性质上一般是多聚阴离子,所以这辨认分子很可能是组蛋白。研究核酸类干扰素诱导物的结构与功能,不仅有助于了解其临床疗效的分子机制,也是分子     

促进干扰素分泌酶有助肝炎治疗

日本东京都临床医学综合研究所藤田尚志研究员最近发现,一种名为“RIG-I”的酶可以促进干扰素的分泌,这一发现将有助于肝炎等疾病的治疗。正常情况下,人体组织或血清中不含干扰素,它是一种人体细胞在病毒、细菌及其产物的诱导下产生的可溶性糖蛋白,具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用。根据产生细胞类型等综合因素,干扰素可分为抗病毒干扰素和免疫干扰素两种。藤田等人对人体细胞分泌干扰素时起作用的基因进行了研究。结果发现,人体细胞感染病毒后,细胞中有基因合成了一种名为“RIG-I”的酶。这种酶在病毒增殖过程中可以与病毒基因结合,…     

对细菌的3种常见误解

分析对细菌的3种常见误解的原因,说明细菌尽管没有内质网、高尔基体,但也能通过共转运和翻译后转运分泌蛋白质。光合细菌中光合作用的电子供体不是水,而是硫化氢等无机硫化物,因而不放出氧气。通过基因工程生产重组人干扰素,最常用的受体细胞是大肠杆菌,重组人干扰素常常会在细菌体中聚集成不溶性的包涵体,工程菌经发酵后将菌体破裂,经分离、纯化、复性,即得到高纯度、高生物活性的重组人干扰素。