食品抗氧剂-D-异抗坏血酸的研究——Ⅱ.产酮产碱菌E54产生2-酮基-D-葡萄糖酸的发酵条件

2-酮基-D-葡萄糖酸是合成D-异抗坏血酸(简称异维生素C)的前体。而D-异抗坏血酸及其钠盐是广泛应用于食品工业中的优良抗氧剂。本文通过新种产酮产碱菌使葡萄糖发酵产生2-酮基-D-葡萄糖酸,并对该菌发酵的碳源、氮源、通气量、温度、金属离子等影响作了探讨,通过正交试验确定了产生2-酮基-D-葡萄糖酸最佳种子培养基和发酵培养基。并对该菌的发酵代谢作了初步的观察。     

食品抗氧剂-D-异抗坏血酸的研究——Ⅰ.2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌的筛

从199株细菌中筛选出产2-酮基-D-葡萄糖酸的高产菌株2株。产物对葡萄糖的克分子转化率达85.93%、87.56%以上。经生物学鉴定,菌株E301为恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida),菌株E54为产碱菌属的一个新种,为产酮产碱菌(Alcaligenes ketogenes nov.sp.)。将发酵产物及其转化成的D-异抗坏血酸钠样品经红外吸收光谱比较,结果均与标准品相同。可确定这两株菌的发酵产物确系2-酮基-D-葡萄糖酸钙。     

D-异抗坏血酸钠前体产生菌E54发酵条件的优化

产酮产碱菌E54可利用D-葡萄糖发酵产生2-酮基-葡萄糖酸钙,再经甲酯化和化学转化而得到D-异抗坏血酸钢。通过大量摇瓶和罐上试验,进一步优化了培养基组分,改进了发酵条件,并采用批加工艺提高了投糖浓度。菌株在5L罐中发酵周期36h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左在;在147L罐中发酵周期40h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左右。     

D-异抗坏血酸钠前体产生菌E54发酵条件的优化

产酮产碱菌E54可利用D-葡萄糖发酵产生2-酮基-葡萄糖酸钙,再经甲酯化和化学转化而得到D-异抗坏血酸钢。通过大量摇瓶和罐上试验,进一步优化了培养基组分,改进了发酵条件,并采用批加工艺提高了投糖浓度。菌株在5L罐中发酵周期36h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左在;在147L罐中发酵周期40h左右,利用D-葡萄糖浓度18～25g／100ml,充分子转化率达90％左右。     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的研究——Ⅱ.2,5-DKG产酸菌株发酵条件

本文研究了D-葡萄糖两步串联发酵中前一步菌株的发酵产酸条件。实验结果表明,在含有D-葡萄糖、适量的玉米浆、碳酸钙和磷酸盐的培养基中,摇瓶培养48小时,一株葡萄糖酸杆菌突变株SCB611可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸25—30mg/ml,克分子转化率为25%左右;另一株欧文氏菌突变株SCB247可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸45—50mg/ml,克分子转化率为40%。随发酵时间适当延长,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸可逐渐增高。温度28℃,种龄15小时,接种量10%及良好的通气条件,有利于菌株产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸。     

代谢工程改造Gluconobacter suboxydans生产2-酮基-D-葡萄糖酸

2-酮基-D-葡萄糖酸是重要的抗氧化剂和食品添加剂——D-异抗坏血酸的重要前体。弱氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter suboxydans)具有丰富的周质空间氧化还原酶类,可将葡萄糖氧化为葡萄糖酸再氧化为2-酮基-D-葡萄糖酸。以提高2-酮基-D-葡萄糖酸的产量和减少副产物为目标,采用同源重组染色体修饰策略,将编码甘油脱氢酶的基因gldh置换为编码葡萄糖脱氢酶的基因gdh,将编码山梨醇脱氢酶的基因sdh置换为编码2-酮-D-葡萄糖酸脱氢酶的基因ga-2-dh。经PCR、酶活性显色及发酵产物HPLC检测验证表明:构建的工程菌株gdh和ga-2-dh基因被强化而gldh和sdh被敲除;使用10%的葡萄糖复合培养基,摇瓶发酵72h,工程菌2KGA3发酵液中没有副产物5-酮基-葡萄糖酸,2-酮基-D-葡萄糖酸的含量终浓度达到72.3 g/L,比野生菌株提高42.2g/L,工程菌和野生菌的2-D-KGA质量转化率分别为72.3%和30.1%,工程菌比野生菌提高1.4倍。构建获得的工程菌,不需要外加抗生素,可以保持稳定遗传,对于工业化规模生产具有一定优势,为获得可产业化显示的优势遗传资源打下了基础。     

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌种子培养基的优选

本文报道2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌种子培养基优选的结果。用生产菌株荧光假单胞菌K1005和球状节杆菌K1022进行试验,其较好的种子培养基为:葡萄糖2%,玉米浆1.0%,尿素0.2%,KH₂PO₄0.1-0.2%,MgSO₄·7H₂O 0.05%,pH7.0。廉价的玉米浆和尿素可以替代昂贵的牛肉膏、蛋白胨和酵母膏。所优选的种子培养基的原材料成本大幅度下降。     

5-酮基-D-葡萄糖酸发酵生产的工艺条件优化

葡萄糖酸氧化杆菌可将葡萄糖转化为5-酮基-D-葡萄糖酸(5-KGA),而5-KGA是重要食品添加剂L(+)-酒石酸的合成前体。为提高5-KGA产量及其对葡萄糖的转化率,对5-KGA发酵生产的工艺条件进行优化。在摇瓶水平最适的培养基和培养条件下,5-KGA最高产量为19.7 g/L,较优化前提高43.8%。在5 L发酵罐上控制恒定pH值5.5、溶氧浓度15%条件下,5-KGA产量达到46.0 g/L,较摇瓶最高产量提高1.3倍,应用葡萄糖流加工艺,5-KGA最高产量达到75.5 g/L,转化率超过70%,与已见报道的最高水平相比提高了32.0%,为实现微生物发酵生产5-KGA、进而合成L(+)-酒石酸的工业化提供了切实有效的途径。     

-L-古龙酸的研究—Ⅱ.2,5-DKG产酸菌株发酵条件

本文研究了D-葡萄糖两步串联发酵中前一步菌株的发酵产酸条件。实验结果表明,在含有D-葡萄糖、适量的玉米浆、碳酸钙和磷酸盐的培养基中,摇瓶培养48小时,一株葡萄糖酸杆菌突变株SCB611可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸25—30mg/ml,克分子转化率为25%左右;另一株欧文氏菌突变株SCB247可产生2,5-二酮基-D-葡萄糖酸45—50mg/ml,克分子转化率为40%。随发酵时间适当延长,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸可逐渐增高。温度28℃,种龄15小时,接种量10%及良好的通气条件,有利于菌株产生2,     

D-葡萄糖直接发酵产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸 Ⅲ.SCB3058对2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化

棒状杆菌(Corynebactcrium sp.)突变株SCB 3058将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸转化为维生素C前体-2-酮基-L-古龙酸。含2,5-二酮基-D-葡萄糖酸的发酵液经表面活性剂SDS处理可直接用作菌株SCB3058的转化底物。D-葡萄糖为最佳碳源,同时作为还原的氢供体。培养基中加入NH.Cl对2-酮基-L-古龙酸的生成有明显的促进作用。转化的最适pH为7.5。摇瓶发酵64小时后,2,5-二酮基-D-葡萄糖酸到2-酮基-L-古龙酸的转化率为50mol%。     

2-酮基-D-葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌K1005抗噬菌体菌株的选育

从２－酮基－Ｄ－葡萄糖酸产生菌荧光假单胞菌Ｋ１００５的异学发酵液中分离到两种噬菌体,分别将其命名为ＫＳ５０２和ＫＳ５０３。电镜观察表明ＫＳ５０２呈微球形,直径为６１ｎｍ;ＫＳ５０３呈蝌蚪形,具有直径为６８ｎｍ的六角形头部及８５ｎｍ长的尾部。利用紫外线诱变的方法,经多次分离筛选,获得了２株抗性稳定且产酸水平超过对照敏感菌的抗噬菌体菌株,可以应用于生产。     

微生物混合培养从D-山梨醇产生维生素C前体—2-酮基-L-古龙酸发酵条件的研究*

在成功利用SCB329和SCB110混合培养完成从D-山梨醇转化产生2-酮基-L-古龙酸的基础上。为了消除副产物和获得高的产量,首先对两菌搭配比例,初始pH值、培养基成分等发酵培养条件进行单因子实验,在此基础上采用L9(3⁴)正交实验优化其发酵培养基,其最终的优化培养基的成分为:D-山梨醇9g,玉米浆1.5g,尿素1.5g,磷酸二氢钾0.1g,碳酸钙0.2g。用优化后的培养基发酵,没有检测出副产物2-酮基-D-古龙酸,2-酮基-L-古龙酸产量提高了20％。     

Vc二步发酵中伴生菌的作用机制*

应用细胞培养和膜分离技术研究了Vc两步发酵中伴生菌巨大芽孢杆菌 (Bacillusmegaterium)对氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacteroxydans)产酸作用机制。结果表明 :巨大芽孢杆菌培养液中分子量在 30～ 5 0kD及大于 1 0 0kD组分明显促进产酸 :其组分通过凝胶层析分离纯化 ,自动紫外检测仪检测 ( 280nm) ,聚丙烯酰胺凝胶电泳及考马斯亮兰G2 5 0特异染色 ,初步证实为蛋白质 ,且至少是两种以上蛋白质 ,它们在低温下稳定性较好。     

D-葡萄糖串联发酵生产2-酮基-L-古龙酸的工艺条件

研究了在10L发酵罐中D-葡萄糖串联发酵生产维生素C前体——2-酮基-L-古龙酸的发酵工艺条件。第一步发酵采用欧文氏菌(Erwinia sp.)的突变株SCB247,培养36小时,可将D-葡萄糖转化成中间体2,5-二酮基-D-葡萄糖酸,在发酵液中约累积180mg/ml。第二步发酵采用棒状杆菌(Corynebacterium sp.)SCB3058,可将2,5-二酮基-D-葡萄糖酸专一性地还原生成2-酮基-L-古龙酸。在细胞生长进入对数生长期后期时,加入经十二烷基硫酸钠处理的第一     

山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸氮源代谢规律

对山梨糖发酵产生2-酮基-L-古龙酸氮源代谢规律进行了初步研究。通过对这一混合发酵体系蛋白和尿素代谢的研究表明,氮源代谢与单一菌体发酵相比有其特殊性,主要表现在尿素的加入有两个作用,即作为生理碱性物质调节体系pH和为菌体代谢提供部分氮源,而体系的蛋白含量随发酵时间的延续不断增加,其增加的原因是巨大芽孢杆菌由营养体转变成芽孢所致,这是该发酵体系的特点。本文还对该发酵体系各种氨基酸变化规律进行了讨论,将一共17种氨基酸按其变化规律分成了三类,较好地解释了各种氨基酸的变化情况,为进一步深入研究该体系的动力学特性提供了数据基础。     

玉米浆对Vc二步发酵产2-酮基-L-古龙酸影响的研究

通过在培养基中添加不同量的玉米浆,研究其对氧化葡萄糖酸杆菌（俗称小菌）生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸的影响,并研究玉米浆成分中的12种主要氨基酸对小菌产酸的影响。结果表明：每100 mL发酵培养基中添加2.5 g左右过滤除菌玉米浆时,2-酮基-L-古龙酸产量高达26.84 mg/mL,小菌活菌数为不添加玉米浆时小菌单菌发酵下的9.74倍。过量玉米浆抑制小菌产酸。12种氨基酸单独与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养及全部混合后与氧化葡萄糖酸杆菌发酵培养对产酸及菌体生长无影响。     

维生素C前体2-酮基-L-古龙酸二步混菌发酵研究新进展

维生素C（Vc）二步混菌发酵是我国首创具有自主知识产权的唯一应用于工业化生产Vc的微生物转化方法,该方法利用混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体物质-2-酮基-L-古龙酸,再经化学转化合成Vc;具有简化工艺,减少污染,降低能耗等优点。本文主要从产酸菌代谢关键酶、伴生菌胞外物质、组学以及外源添加物等方面综述Vc二步混菌发酵的最新研究进展,并提出进一步研究和探索的方向。     

混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-酮基-L-古龙酸研究进展

利用混合菌发酵L-山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸(2-KCA),再经化学转化合成维生素C(Vc),是我国工业生产Vc的主要途径,具有简化工艺,减少污染,降低能耗等诸多优点.从菌系组合、菌种选育、代谢途径与酶学特性、工程菌构建、伴生作用机制及发酵工艺等方面出发,综述混合菌发酵L-山梨糖生产Vc前体2-KGA的研究现状和最新进展,并提出进一步研究和探索的方向.