家蚕磷酸吡哆醇氧化酶基因的表达谱分析

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B6关键代谢酶磷酸吡哆醇氧化酶（pyridoxine- 5′-phosphate oxidase, PNPO）基因在家蚕不同发育阶段及5龄幼虫不同组织中的表达差异。【方法】将家蚕PNPO基因的重组表达质粒pET-22b(+)-PNPO转化入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达, 纯化蛋白制备多克隆抗体。分别采用荧光定量PCR和Western blot方法对家蚕PNPO基因进行了转录水平和翻译水平的表达分析。【结果】在家蚕发育水平上, 5龄幼虫的PNPO翻译量为最高。PNPO基因在5龄幼虫各组织中的转录水平由高到低依次为精巢、 头、 中肠、 马氏管、 卵巢、 表皮、 脂肪体、 丝腺; 翻译量也以精巢为最高, 其次是头、 中肠和马氏管。【结论】明确了PNPO在家蚕各发育阶段及5龄幼虫各组织中的表达情况。     

基于RNA-Seq分析Ras1~(CA)在家蚕后部丝腺过表达对细胞周期通路基因的影响

【目的】本文旨在挖掘野生型家蚕Bombyx mori和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺中的转录本差异,分析和验证细胞周期通路中的差异表达基因,从而探讨Ras1CA过表达转基因家蚕提高蚕丝产量的分子机制。【方法】利用转录组学比较野生型和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺中的基因转录本差异,经实时荧光定量PCR(q RT-PCR)验证。【结果】野生型家蚕和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺组织中有2 636个差异表达基因,其中细胞周期信号通路中有42个差异表达基因,包括细胞周期依赖性激酶(CDK)、细胞周期素(Cyclin)以及转录因子等。通过q RT-PCR检测cdk1、cyclin D1、cyclin D2、cdc7、cdh1、dp-1,2等6个基因在野生型和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺组织中的相对表达量,发现转基因家蚕中的表达量均显著高于野生型(P<0.05),其中cyclin D2的表达差异极显著(P<0.01)。q RT-PCR结果与转录本差异一致,表明Ras1CA过表达后,能够促进细胞周期通路基因的表达。【结论】野生型家蚕和Ras1CA过表达转基因家蚕后部丝腺中有大量差异表达基因,且Ras1CA能够在转录水平上调控细胞周期通路,影响后部丝腺组织的细胞分裂和器官生长,从而促进蚕丝蛋白的合成。     

家蚕Bcl-2家族基因 BmBuffy 的克隆及表达分析

【目的】本研究旨在获得家蚕 Bombyx mori Bcl-2家族同源基因,并分析其在不同组织和发育阶段的时空表达模式及功能。【方法】用cDNA末端快速扩增方法（rapid amplification of cDNA ends, RACE）克隆家蚕Bcl-2家族基因BmBuffy,利用SSR分子标记连锁分析确定其染色体定位。同时,用RT-PCR和qPCR技术分析该基因在家蚕幼虫及变态期间不同组织中的表达。【结果】克隆获得全长家蚕Bcl-2家族同源基因 BmBuffy,证明该基因位于第 4号染色体上,开放阅读框长879 bp,编码292 aa,预测其分子量大小为32.4 kDa,等电点为9.94,且第130-231位氨基酸之间存在1个Bcl-2_like Superfamily结构域。系统进化发育树表明,其与黑腹果蝇Drosophila melanogaster的DmBuffy关系最近,氨基酸序列一致性为27%。BmBuffy在幼虫组织中的表达结果显示,其在马氏管中表达量最高,而且在不同组织变态期的关键时间点均有明显变化。【结论】家蚕BmBuffy具有Bcl-2家族典型结构域,BmBuffy定位于第 4号染色体上,BmBuffy在家蚕变态期的组织生理变化中起到一定作用。本文为进一步研究家蚕Bcl-2家族基因的功能奠定基础。     

吡哆醛激酶基因在家蚕体内的时空表达特征

【目的】了解家蚕Bombyx mori维生素B₆关键代谢酶吡哆醛激酶（pyridoxal kinase, PLK）在家蚕不同组织间的表达差异。【方法】原核表达家蚕重组PLK, 获得目的蛋白制备多克隆抗体, 利用Western blot方法对PLK在家蚕不同发育时期、 5龄第3天幼虫不同组织及5龄不同日龄幼虫表皮、 头部和马氏管中的表达进行分析; 并采用实时荧光定量PCR的方法对PLK基因在家蚕不同组织中的mRNA转录水平进行比较。【结果】PLK在家蚕5龄幼虫的表达水平最高, 在5龄第3天幼虫各组织中的表达由高到低依次为： 精巢、 马氏管、 表皮、 中肠、 头部、 卵巢、 脂肪体、 丝腺; 5龄期不同日龄幼虫表皮组织的表达差异最大, 头部和马氏管中均为前期表达量稍高于后期。在转录水平方面, 精巢的表达量最高, 其次是马氏管和头部。【结论】PLK在家蚕不同发育时期及组织中的差异表达进一步证实PLK在家蚕VB6代谢中的生物学功能的重要性。     

LncRNA63及其共表达基因Hr3在家蚕中的表达和功能分析

【目的】本研究旨在通过对一个新的长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA)及其共表达基因在家蚕Bombyx mori中的表达和功能进行分析,进一步阐明lncRNA在调控家蚕变态发育中的分子机制。【方法】基于前期家蚕脂肪体转录组测序数据,我们发现在蜕皮激素20E(2 μg/μL)处理5龄幼虫早期的脂肪体中lncRNA63表达显著上调,家蚕激素受体基因Hr3与之共表达。利用qRT-PCR对lncRNA63和Hr3在家蚕不同发育时期(4-5龄幼虫、蛹和成虫)、5龄幼虫不同组织(头、体壁、血淋巴、中肠、马氏管、脂肪体、丝腺、精巢和卵巢)和2 μg/μL 20E处理2, 6, 12和24 h后5龄幼虫脂肪体中的表达谱进行分析;采用核质分离检测和原位杂交技术检测lncRNA63在家蚕BmN细胞中的定位;利用dsRNA干涉家蚕5龄幼虫个体中lncRNA63的表达,并利用qRT-PCR检测RNA干涉lncRNA63对头、丝腺、脂肪体和体壁中Hr3表达的影响。【结果】qRT-PCR结果表明,lncRNA63和Hr3在家蚕羽化前的蛹末期有一个表达高峰;二者在家蚕5龄幼虫头、体壁和丝腺中都有较高表达;lncRNA63和Hr3在2 μg/μL 20E处理2, 6和12 h的家蚕5龄幼虫脂肪体中较对照组(无水乙醇处理组)都显著上调,24 h下降到与对照组相当水平,二者的表达趋势完全一致。LncRNA63主要定位于BmN细胞核,但20E可诱导lncRNA63的核质迁移。利用dsRNA干涉lncRNA63表达后,Hr3的表达显著下调。【结论】20E不仅可调控lncRNA63的表达,还可诱导lncRNA63的核质迁移;lncRNA63可通过调控共表达基因Hr3的表达参与家蚕的变态发育过程。     

家蚕miR-2769靶基因的鉴定及表达分析

【目的】MiRNAs在昆虫变态发育过程中发挥非常重要的作用。对家蚕Bombyx mori miRNAs及靶基因的研究将有助于阐明miRNAs参与调控家蚕变态发育的分子机制。【方法】往家蚕5龄第2天幼虫血淋巴注射蜕皮激素20E后,qRT-PCR检测miR-2769在家蚕脂肪体中的表达;通过生物信息学方法预测家蚕miR-2769的靶基因;利用双荧光酶报告载体系统分析miR-2769与预测靶基因BmE75B的互作;qRT-PCR检测miR-2769及其靶基因BmE75不同剪接体在家蚕不同发育时期(幼虫、蛹和成虫)和幼虫不同组织(头、表皮、丝腺、脂肪体、精巢、卵巢、马氏管、中肠和血淋巴)中的表达量。【结果】研究结果表明,miR-2769可通过与家蚕BmE75B的3′UTR区结合位点的互作,显著抑制荧光素酶报告基因的表达。qRT-PCR结果表明,miR-2769和BmE75A/BmE75B在20E诱导家蚕脂肪体中表达趋势相反。时空表达分析结果表明,miR-2769与BmE75的不同剪接体在家蚕不同发育时期和不同组织中均具有特异性表达特征。在家蚕变态发育的不同阶段,miR-2769和BmE75A的...     

抑制葡萄糖氧化酶基因降低黏虫幼虫对苏云金芽孢杆菌侵染的抗性(英文)

【目的】本研究旨在探讨葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, GOX)在黏虫Mythimna separata发育、消化和免疫防御中的作用。【方法】采用转录组测序技术克隆了黏虫GOX基因的cDNA序列。qRT-PCR检测该GOX基因在黏虫不同发育阶段(1-6龄幼虫、蛹和1日龄成虫)和4龄第1天幼虫不同组织(前肠、中肠、后肠、下唇腺、马氏管、脂肪体和表皮)、以及取食用不同浓度(0.01%, 0.1%, 1%和10%)葡萄糖溶液浸泡10 s的玉米叶片及饥饿和再取食条件下的4龄第1天幼虫中的特异性表达模式。通过RNAi和生物测定研究该GOX基因在黏虫对苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis抗性中的功能。【结果】克隆获得了一条新的长2 187 bp的黏虫GOX基因MsGOX cDNA序列(GenBank登录号: KY348779),其开放阅读框长1 821 bp,编码606个氨基酸,预测分子量为66.4 kD。发育表达谱结果表明MsGOX在黏虫不同发育阶段表达量不同,在4龄幼虫期表达量最高;组织表达谱结果表明MsGOX在黏虫4龄第1天幼虫各组织中均有表达,在下唇腺中表达量最高。饲喂幼虫不同浓度葡萄糖对MsGOX转录的诱导效果不同,在葡萄糖浓度为10%时,该基因的表达水平达到最高。随着饥饿时间的延长,4龄第1天幼虫中MsGOX的表达水平逐渐升高,并在饥饿24 h时达到高峰,饥饿后再用玉米叶片饲喂幼虫,MsGOX的表达水平逐渐回升。注射dsMsGOX 48 h后,MsGOX的表达水平较对照(注射dsEGFP)降低了88.3%; 与同一时间点的对照相比,注射dsMsGOX后48和72 h幼虫 的体重、体长和消化系数均显著降低,苏云金芽孢杆菌侵染48和72 h提高了幼虫的校正死亡率。【结论】MsGOX可能参与了黏虫中肠的消化和抗菌,研究结果为进一步研究黏虫MsGOX的功能并提出新的黏虫防治策略提供了依据。     

家蚕Sox家族基因BmDichaete的克隆与表达分析

【目的】Sox家族是一类转录调控因子,在多细胞动物的发育过程中起到了极其重要的作用。本研究旨在获得家蚕Bombyx mori Sox家族基因,并分析其在幼虫不同组织和发育阶段的表达模式及功能。【方法】采用cDNA末端快速扩增方法(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆家蚕Sox家族基因,并对其序列进行生物信息学分析。构建原核表达载体,诱导原核表达并得到其蛋白的多克隆抗体,并以Western blot验证其蛋白在家蚕胚胎发育时期(产卵后24,48,72,96,120,144,168,192和216 h)和蚁蚕的表达特征。同时,使用半定量RT-PCR技术分析这一基因在家蚕整个发育过程以及5龄第3天幼虫不同组织(精巢、卵巢、神经节、头部、丝腺、脂肪体、马氏管、中肠、后肠、表皮、血液、气管)中的表达谱。【结果】克隆获得一个家蚕Sox家族基因,将其命名为BmDichaete(Gen Bank登录号:KY914554),其cDNA序列全长为1 541 bp,开放阅读框长741 bp,编码246个氨基酸,预测分子量大小为27.3 kD,等电点为9.89。同源序列比对和系统进化分析显示,BmDichaete具有Sox家族的典型HMG结构域,并与其他鳞翅目昆虫的Dichaete蛋白具有较高的同源性。对其表达模式分析发现,BmDichaete在家蚕整个发育时期都有表达,从胚胎发育后期到蛹前期持续高表达,在蛹后期及成虫期表达量有所下降,并且该基因在家蚕5龄第3天幼虫的卵巢、头部、丝腺及后肠组织中显著高表达。Western blot分析结果显示,BmDichaete在家蚕胚胎发育过程中持续而稳定地表达。【结论】家蚕BmDichaete具有典型HMG结构域,属于Sox家族成员。BmDichaete在家蚕胚胎发育的各个时期都发挥作用。本研究为进一步探索该基因在家蚕中的功能奠定了基础。     

家蚕ADP/ATP转运酶(BmANT)抑制BmNPV增殖作用机制研究

【目的】家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,BmNPV)隶属于杆状病毒,需要借助宿主细胞能量代谢进行自身增殖复制。家蚕ADP/ATP转运酶(Bombyx mori ADP/ATP translocase,BmANT)是线粒体转运蛋白,在BmNPV感染条件下和家蚕热休克蛋白60(heatshockprotein60,BmHSP60)具有直接的相互作用。因此,鉴定Bmant基因在BmNPV感染过程中的功能特征,有助于解析杆状病毒劫持宿主细胞因子促进自身增殖复制机制,完善杆状病毒和宿主相互作用网络。【方法】通过结构域预测BmANT蛋白的结构特征,荧光定量PCR分析Bmant基因在BmNPV感染后的变化特征;并过表达BmANT检测其对病毒DNA复制和病毒蛋白表达变化影响;进一步在转录水平分析Bmant和Bmhsp60基因的调控关系;最后通过流式细胞术等技术鉴定Bmant和Bmhsp60基因共同调控BmNPV增殖复制的机制。【结果】SMART软件预测显示BmANT包含3个线粒体载体结构域,BmNPV感染24 h后Bmant基因持续下调表达。过表达Bmant基因能够显著抑制BmNPV DNA的复制和VP39蛋白表达。荧光定量PCR分析显示Bmant和Bmhsp60基因具有相互拮抗作用,能够相互抑制转录。Bmant和Bmhsp60共同过表达分析显示,BmANT和BmHSP60共同作用BmNPV能够抑制病毒的增殖复制。【结论】结果表明,BmANT是一个线粒体载体蛋白,具有显著的抗病毒作用,能够下调Bmhsp60基因表达,并抑制BmNPV增殖复制。     

基于转录组的葱蝇表皮蛋白基因家族的鉴定及在非滞育和冬滞育条件下的表达分析

【目的】昆虫表皮蛋白在昆虫的生长发育、抑制水分蒸发和抵御其他外界不良环境等方面起到重要的作用。通过转录组水平上葱蝇Delia antiqua表皮蛋白基因家族的鉴定及部分基因在非滞育和冬滞育条件下的表达规律分析,为进一步研究葱蝇表皮蛋白在滞育期的抗逆功能奠定基础。【方法】基于转录组数据,通过生物信息学方法对葱蝇表皮蛋白基因进行鉴定分析,系统进化和保守结构域分析并采用实时荧光定量PCR法比较分析了12个基因在葱蝇非滞育和冬滞育不同发育时期的表达变化。【结果】在葱蝇中鉴定出81个表皮蛋白基因,分别属于RR(71个基因)、CPAP(5个基因)和CPLC(5个基因)亚家族,其编码的蛋白质含有92~495个氨基酸,分子量约为8.692~52.2 k D,等电点为3.90~9.93。亚细胞定位预测结果显示67个全长表皮蛋白均为外分泌型。12个葱蝇表皮基因在非滞育和冬滞育过程中有明显不同的表达规律。【结论】葱蝇表皮蛋白基因RR-2型的保守基序中发生了基因突变,引起关键氨基酸的替换,这可能暗示它们在非滞育和滞育不同条件下,不同发育阶段中蛹皮结构重建和某些器官的发生方面发挥不同作用。该研究结果为进一步阐明葱蝇滞育蛹皮结构及抗逆功能的研究提供了重要理论基础。     

中华按蚊含LY结构域的胰蛋白酶基因的分子特征及表达模式分析

【目的】在全基因组鉴定中华按蚊Anopheles sinensis 含LY结构域的胰蛋白酶(LY-trypsin)基因,探究其分子特征、表达模式以及系统发育关系。【方法】以NCBI数据库中冈比亚按蚊An. gambiae、埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和致倦库蚊Culex quinquefasciatus胰蛋白酶家族基因的氨基酸序列为询问序列,通过本地Blast搜索鉴定中华按蚊基因组中胰蛋白酶基因,将中华按蚊LY-trypsin基因依据其结构域特征及系统发生关系进行命名LY-trypsin。运用生物信息学方法预测中华按蚊LY-trypsin基因的结构、在scaffold的定位、结构域、系统发育关系,及其在中华按蚊不同发育时期、成蚊不同组织和吸血前后雌成蚊中的表达模式。【结果】在中华按蚊全基因组上共鉴定得到27个中华按蚊LY-trypsin基因;在黑腹果蝇、冈比亚按蚊、致倦库蚊和埃及伊蚊基因组中未鉴定到LY-trypsin基因。中华按蚊27个LY-trypsin基因分别编码329~1 125个氨基酸,分子量在36.8~125.5 kD之间,等电点在4.73~8.94间。其中, 20个LY-trypsin具有信号肽,信号肽长度在10~62个氨基酸之间。这27个中华按蚊LY-trypsin基因的外显子数为1~5个,内含子长62~20 093 bp。这27个中华按蚊LY-trypsin基因被定位在11个scaffold上,其编码蛋白均有YWTD保守基序(LY基序);其中16个LY-trypsin基因所编码的氨基酸序列具有含丝氨酸、组氨酸和天冬氨酸催化三联体的活性位点。系统发育结果表明,27个中华按蚊LY-trypsin基因聚类为4个分支。在不同发育阶段,半数以上的中华按蚊LY-trypsin基因显示出相似的表达模式,在幼虫阶段均高水平表达;在中华按蚊不同成蚊组织中,LY-trypsin基因均有不同程度的表达;吸血前后雌蚊中仅有个别基因表达,并未发现表达特异性。【结论】本研究在中华按蚊基因组中首次鉴定出LY trypsin基因,并揭示了这些LY-trypsin基因的分子特征和表达模式,为LY-trypsin基因的进一步研究提供了信息框架。     

家蚕鞣化激素基因对翅展及繁殖力的调控作用

[目的]昆虫鞣化激素(Bursicon)是由神经系统分泌的一种异源二聚体神经肽,对昆虫表皮鞣化、翅展等功能具有调控作用.本研究旨在探究鞣化激素基因与家蚕Bombyx mori翅发育及对繁殖力相关基因的关系,明确其对翅展和繁殖力的调控作用.[方法]采用RNAi技术,分别注射Bursicon基因的dsRNA(dsBmBur...     

禾谷缢管蚜鞣化激素基因克隆及功能分析

【目的】探讨禾谷缢管蚜 Rhopalosiphum padi （Linnaeus）鞣化激素基因的发育表达模式及功能。【方法】采用转录组测序得到禾谷缢管蚜鞣化激素基因bursicon-α 和 bursicon-β cDNA序列。通过实时荧光定量PCR方法,分析该基因的发育表达模式。利用RNA干扰（RNA interference, RNAi）介导 bursicon-α 和bursicon-β 沉默,分析鞣化激素的功能。【结果】序列分析结果显示,禾谷缢管蚜鞣化激素α亚基基因（bursicon-α）cDNA序列开放阅读框为480 bp,编码159个氨基酸残基;β亚基基因（bursicon-β）cDNA序列开放阅读框为417 bp,编码138个氨基酸残基。时序表达分析表明,鞣化激素两个亚基基因在禾谷缢管蚜整个发育期均有表达,以1龄若蚜期表达量最高;成蚜有翅个体中表达量显著高于无翅个体。RNAi介导的 bursicon-α 和 bursicon-β 沉默均能显著抑制禾谷缢管蚜成蚜表皮的黑化。【结论】研究结果表明,鞣化激素在禾谷缢管蚜体壁黑化中发挥着重要作用。该结果为进一步研究鞣化激素在蚜虫生长发育过程中的生理功能提供了基础资料。     

松墨天牛漆酶基因MaLac1的克隆、原核表达及表达谱分析

【目的】本研究旨在克隆并鉴定松墨天牛Monochamus alternatus内源漆酶基因MaLac1,分析其在松墨天牛不同发育阶段的表达水平,为进一步明确MaLac1功能提供依据。【方法】基于松墨天牛肠道转录组测序数据,通过RACE克隆松墨天牛MaLac1基因的全长cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;将该基因与pET-32a载体链接构建表达载体pET-MaLac1,导入大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3)使其表达;使用qPCR检测MaLac1基因在松墨天牛不同发育阶段(低龄幼虫、老熟幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫)肠道中的表达差异。【结果】克隆获得松墨天牛MaLac1的cDNA全长序列(GenBank登录号:KY073340)。MaLac1开放阅读框全长2 067 bp,编码一个含688个氨基酸的蛋白质,预测分子量为78.34 kD,等电点为5.30。SignalP 4.1 Server预测MaLac1在N端包含一个15个氨基酸的信号肽。序列比对分析表明,MaLac1具有典型的昆虫漆酶基因特征,与赤拟谷盗Tribolium castaneum漆酶基因的氨...     

牧草盲蝽实时定量PCR内参基因的筛选

【目的】筛选出适合牧草盲蝽Lygus pratensis在不同条件下稳定表达的内参基因。【方法】选取编码牧草盲蝽α-微管蛋白、β-微管蛋白、肌动蛋白、延伸因子、琥珀酸脱氢酶复合体A、泛素、转录起始因子TFIID亚基、谷胱甘肽S-转移酶、核糖体蛋白L32及TATA盒结合蛋白的10条基因为候选内参基因,采用qRT-PCR技术测定其在牧草盲蝽不同性别成虫、成虫不同组织、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫、不同温度及不同杀虫剂分别处理后的成虫共6类样品中的表达量;采用BestKeeper, geNorm, NormFinder及RefFinder 4种计算程序对各候选基因的表达稳定性进行评价。【结果】依据获得的有效qRT-PCR数据前提,利用不同计算方法综合分析得出：在牧草盲蝽成虫不同组织中和对功夫菊酯不同抗性成虫中最稳定表达的内参基因均为RPL32;不同温度处理、不同性别成虫中、不同杀虫剂处理和不同龄期牧草盲蝽中最稳定表达的内参基因分别为UBQ, SDHA, β-tubulin和TAF。通过geNorm软件判断配对变异数确定的内参基因最佳数目,结合RefFinder对基因表达稳定性综合排序的结果可得：牧草盲蝽不同成虫组织中、不同性别成虫中、不同龄期、对功夫菊酯不同抗性成虫中、不同温度及杀虫剂分别处理的成虫等各组的最优内参基因组合分别为RPL32+TAF, SDHA+GST, TAF+GST+UBQ, RPL32+GST, UBQ+ACT+β-tubulin和β-tubulin+TAF+RPL32。【结论】本研究获得的牧草盲蝽在不同条件下表达最稳定及最适内参基因组合,都可用于后续的基因定量表达研究。     

家蚕微孢子虫海藻糖酶3的表达、定位及功能

【目的】本研究旨在初步明确家蚕微孢子虫Nosema bombycis海藻糖酶3(NbTre3)的功能,为家蚕Bombyx mori微粒子病的防治提供理论依据和线索。【方法】通过PCR扩增NbTre3,构建原核表达载体pET28a-NbTre3;经IPTG诱导在大肠杆菌Escherichia coli中表达重组蛋白NbTre3,Western blot检测目的蛋白;Ni柱亲和层析法对重组蛋白NbTre3进行纯化,用获得的NbTre3免疫新西兰兔制备多克隆抗体;利用间接免疫荧光技术对成熟家蚕微孢子虫中的NbTre3进行定位;qRT-PCR检测家蚕微孢子虫感染家蚕5龄起蚕后不同时间中肠中NbTre3的转录水平;通过分别注射siRNA-1, siRNA-2和siRNA-3进行RNAi,qRT-PCR检测RNAi后不同时间感染家蚕微孢子虫的家蚕5龄起蚕中肠中NbTre3和16S rRNA的转录水平。【结果】成功纯化并获得重组目的蛋白NbTre3,大小约为34 kD。免疫新西兰兔后,收集血清,纯化获得NbTre3多克隆抗体,经Western blot鉴定正确。间接免疫荧光结果显示NbTre3主要分...     

柑橘大实蝇内参基因的评估

【目的】柑橘大实蝇Bactrocera minax (Enderlein)是一种危害严重的柑橘害虫。本研究旨在筛选柑橘大实蝇在特定条件下体内稳定表达的内参基因, 以确保使用实时荧光定量PCR分析目标基因表达的可靠性。【方法】选择10种候选内参基因用于进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）, 利用5种软件对柑橘大实蝇在不同虫态下（低龄幼虫、3龄幼虫、1日龄蛹、80日龄蛹、160日龄蛹、雄成虫、雌成虫）以及成虫不同部位（成虫头、胸、腹、整体）中候选内参基因的Ct值进行分析, 明确其表达的稳定性。【结果】在柑橘大实蝇不同虫态和成虫不同部位, 10种候选内参基因的Ct值都处于15~30之间, 各基因Ct值的不同表明各基因的表达量存在差异。 综合分析各种软件对内参基因稳定性的排名, 结合geNorm软件对最佳内参基因数量的分析结果, 推荐在不同虫态下采用UBQ, GAPDH和GST作为内参基因, 在不同成虫部位中采用TUB, GAPDH和GST作为内参基因。【结论】为了获取可信的目标基因表达分析结果, 建议根据不同条件选择使用不同的内参基因组合。本研究结果有利于进一步研究柑橘大实蝇在特定条件下的目标基因表达。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂Bmserpin2对酚氧化酶原激活和抗菌肽基因表达的抑制作用

【目的】丝氨酸蛋白酶抑制剂家族蛋白是昆虫中调控自身免疫反应的重要蛋白酶抑制剂,本研究旨在研究家蚕Bombyx mori丝氨酸蛋白酶抑制剂2(Bmserpin2)在家蚕2个重要的自身免疫通路即酚氧化酶原(prophenol oxidase, PPO)激活通路和革兰氏阳性菌诱导抗菌肽的TOLL通路中的调控作用。【方法】PCR扩增家蚕Bmserpin2基因片段后原核表达并通过镍柱纯化。利用纯化后的重组Bmserpin2蛋白分别与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶和蛋白酶K反应,检测Bmserpin2对上述蛋白酶活性的影响。通过RT-qPCR检测Bmserpin2在家蚕5龄第3天幼虫头、中肠、脂肪体、血淋巴、丝腺和表皮组织中表达的模式。往家蚕5龄第3天幼虫注射Bmserpin2重组蛋白,检测Bmserpin2对其血淋巴中PPO活性的影响。通过滕黄微球菌Micrococcus luteus诱导家蚕5龄第3天幼虫产生抗菌肽并注射Bmserpin2重组蛋白后,RT-qPCR检测其血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin表达量。【结果】成功构建重组质粒并表达纯化目的蛋白Bmserpin2。通过与不同蛋白酶反应得出Bmserpin2可极显著抑制消化酶胰蛋白酶和弹性蛋白酶活性,对胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K活性影响不显著,提示Bmserpin2对不同蛋白酶具有生物学活性和催化特异性。基因表达模式显示Bmserpin2在家蚕5龄幼虫血淋巴和脂肪体中表达量最高。家蚕5龄幼虫注射重组Bmserpin2蛋白后发现目的蛋白能有效抑制血淋巴中PPO活性。利用滕黄微球菌诱导家蚕5龄幼虫产生抗菌肽后,滕黄微球菌和Bmserpin2混合注射组中血淋巴中抗菌肽基因gloverin2和moricin的转录表达与只注射滕黄微球菌的比较被显著下调。【结论】Bmserpin2可能参与家蚕酚氧化酶原激活和TOLL途径的胞外级联反应的免疫通路。