甲基化对牛Igf-2r表达的影响及其在克隆牛发育中的作用

摘要：目的目前认为克隆效率低的主要原因是供体核的不完全重编程（reprogramming）导致在发育过程中一些重要的基因异常表达。本文主要研究表观遗传结构对Igf-2r表达的影响及其在克隆牛发育过程中的作用。方法 首先,运用DNA甲基化转移酶抑制剂5'-脱氧胞苷（5'-azacytidine,5'-AzaC）处理MDBK细胞（牛肾上皮细胞）,并通过实时荧光定量PCR方法对Igf-2r基因的表达进行定量分析。在此基础上,应用亚硫酸盐甲基化测序法检测5头克隆牛及1头正常牛脑、肺、心、肝组织Igf-2r印迹调控区DMR 2（DNA differentially methylated region,DMR）及非印迹调控区3'-UTR（3'-untranslated region,UTR）的DNA甲基化水平。结果 5'-aza处理MDBK细胞后,Igf-2r基因的表达上调。正常牛各组织中Igf-2r DMR 2区的DNA甲基化程度差异较大,3'-UTR区较稳定;与正常牛相比,克隆牛DMR 2区的甲基化程度变化较大,3'-UTR区无显著性变化。结论 DNA甲基化修饰影响Igf-2r基因的表达。正常牛不同组织中Igf-2r基因DMR 2区的DNA甲基化程度不同,提示Igf-2r基因的印迹调控方式在不同组织中可能不同。克隆牛发育过程中,调控Igf-2r基因印迹的DMR 2表观结构被明显改变,而非印迹调控区3'-UTR则无明显变化,提示Igf-2r基因印迹调控区被破坏,很可能是导致克隆牛发育异常的一个重要原因。关键词：Igf-2r,表观遗传结构,克隆牛,DNA甲基化,基因印迹     

DNA甲基化对牛lgf-2r表达的影响及其在克隆牛发育中的作用

目前认为克隆效率低的主要原因是供体核的不完全重编程导致发育过程中一些重要的基因异常表达。运用DNA甲基化转移酶抑制剂5＇-脱氧胞苷（5＇-azacytidine,5＇-aza）处理MDBK细胞（牛肾上皮细胞）,并通过实时荧光定量PCR方法对lgf-2r基因的表达进行了定量分析;在此基础上,应用亚硫酸盐甲基化测序法检测正常牛及克隆牛脑、肺、心、肝组织lgf-2r印迹调控区DMR2（DNA differentially methylated region,DMR）及非印迹调控区3＇-UTR（3＇-untranslated region,UTR）的DNA甲基化水平。研究发现,5＇-aza处理MDBK细胞后,lgf-2r基因的表达上调。正常牛各组织中lgf-2rDMR2区的DNA甲基化程度差异较大,3＇-UTR区较稳定;与正常牛相比,克隆牛DMR2区的甲基化程度变化较大,3＇-UTR区无显著性变化。结果表明,DNA甲基化修饰影响lgf-2r基因的表达。正常牛不同组织中lgf-2r基因DMR2区的DNA甲基化程度不同,提示lgf-2r基因的印迹调控方式在不同组织中可能不同。克隆牛发育过程中,调控lgf-2r基因印迹的DMR2表观结构被明显改变,而非印迹调控区3＇-UTR则无明显变化,提示lgf-2r基因印迹调控区被破坏,很可能是导致克隆牛发育异常的一个重要原因。     

哈尔滨和湛江雄性褐家鼠Gsk3β差异甲基化区域DNA序列多态性分析与调控功能鉴定

糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β, Gsk3β）基因能够参与多条细胞周期信号传导通路,从而通过调控细胞分裂过程,影响组织与器官的发育。本实验室前期研究发现,与湛江褐家鼠种群相比,哈尔滨褐家鼠种群在秋冬季存在睾丸发育受抑制的现象,并通过基因组与甲基化组联合分析,在Gsk3β基因内含子区域筛选到1个差异甲基化区域（differentially methylated region, DMR）。为分析该DMR 的DNA序列多态性及其在Gsk3β基因表达调控中的可能作用,本研究选取了哈尔滨（n=52）和湛江（n=39）共91个性成熟褐家鼠睾丸样品。采用PCR测序方法在群体水平上分析了该DMR的DNA序列多态性,在2个褐家鼠亚种的分化特征,并选取2个群体中具有代表性的单倍型,通过荧光素酶基因报告系统在293T细胞中检测该DMR不同单倍型的调控活性。结果表明,该DMR存在2个SNP位点,共组成3个单倍型、6个基因型。卡方检验表明,其频率在2个群体间发生显著分化（单倍型,P=1.13E-29;基因型,P=1.15E-14）。Gsk3β基因的-2 218/+238 bp区具有明显启动子活性（P<0.05）;哈尔滨和湛江2个单倍型都显示显著的沉默子活性（P<0.05）,同时表现显著的调控活性差异（P<0.05）,表明这2个单倍型可以在293T细胞中作为沉默子抑制Gsk3β基因的启动子活性。2个单倍型调控活性差异,可能与SNP导致的转录因子结合位点的获得/丢失,以及2个单倍型在不同种群中甲基化状态差异有关。本研究结果表明,该DMR可能通过调控褐家鼠Gsk3β基因表达,在睾丸发育过程中发挥作用。2个种群主要单倍型的调控活性差异,及其甲基化状态差异可能是2个种群睾丸发育表型差异的重要调控因素之一。     

植物胚乳发育的表观遗传学调控

被子植物的种子发育从双受精开始, 产生二倍体的胚和三倍体的胚乳。在种子发育和萌发过程中, 胚乳向胚组织提供营养物质, 因此胚乳对胚和种子的正常生长发育至关重要。开花植物发生基因组印迹的主要器官是胚乳。印迹基因的表达受表观遗传学机制的调控, 包括DNA甲基化和组蛋白H3K27甲基化修饰以及依赖于PolIV的siRNAs (p4-siRNAs)调控。基因组印迹的表观遗传学调控对胚乳的正常发育和种子育性具有不可或缺的重要作用。最新研究显示, 胚乳的整个基因组DNA甲基化水平降低, 而且去甲基化作用可能源于雌配子体的中央细胞。该文综述了种子发育的表观遗传学调控机制, 包括基因组印迹机制以及胚乳基因组DNA甲基化变化研究的最新进展。     

小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的克隆及特性分析

依赖于DNA甲基化的基因表达调控在植物生长发育过程中发挥重要功能,而DNA甲基转移酶是调节DNA甲基化模式的功能蛋白之一。本研究采用RACE技术克隆了小麦甲基转移酶基因TaDnMT2的包含完整编码区的cDNA序列,并系统分析了该基因的结构特征及其在小麦生长发育过程中的表达特性。结果表明,TaDnMT2的cDNA序列为1321bp（GenBank登录号：JN642641）,其中5′-和3′-UTR（非翻译区）分别为84和115bp、ORF（开放阅读框）1122bp;TaDnMT2编码的氨基酸序列包含2个S-腺苷甲硫氨酸结合域（I和X）、甲基转移酶活性位点（IV）、靶胞嘧啶结合位点（VI）、中和DNA骨架负电荷域（VIII）和靶位点识别区（IX）6个高度保守域,属于DNA甲基转移酶家族的DnMT2亚类;三维结构预测显示,TaDnMT2蛋白可以形成包括7个β-折叠和4个α-螺旋的特定空间结构。表达特性分析的结果表明,TaDnMT2基因在‘京841’小麦不同发育时期的叶中表达量均较高,且其在三叶龄期和五叶龄期的表达量受春化处理的影响;在种子发育过程中,该基因在授粉后5d的种子中表达量较高,随着种子发育进程的推进其表达水平呈逐渐下降趋势;在不同发育时期的根系中,TaDnMT2基因均具有较高水平的表达,且在分蘖期根系中的表达量最高。推断TaDnMT2基因可能在小麦生长发育过程中发挥重要功能。     

转基因克隆牛胎盘中印迹基因PEG10的DNA甲基化水平

低效率的体细胞核移植技术显著制约着该技术在转基因动物生产上的广泛应用。目前认为供体细胞核不能被受体卵母细胞胞质完全的表观重编程是其效率低下的最主要原因,而DNA甲基化是基因表观修饰的主要方式之一。为了探求转基因克隆牛的死亡是否与其胎盘中印迹基因的甲基化的重编程程度相关,文章通过亚硫酸氢盐测序法(Bisulfite sequencing PCR,BSP)和亚硫酸氢盐联合限制性内切酶分析法(Combined bisulfite restriction analysis,COBRA),对印迹基因PEG10在围产期死亡且存在发育缺陷的转基因克隆牛的胎盘(死亡组)和存活的转基因克隆牛的胎盘(存活组)与正常对照牛胎盘(对照组)的DNA甲基化水平进行了详细的比较。结果发现,与对照组相比,PEG10基因在死亡组上表现出异常的超甲基化水平,而存活组与对照组相比无显著性差异。研究结果显示,胎盘中印迹基因的DNA甲基化表观重编程不彻底可能是导致转基因克隆牛发育异常进而死亡的主要原因之一。     

2型糖尿病患者胰岛素受体底物-2基因3′-非翻译区变异的研究

为了探讨胰岛素受体底物-2(insulin receptor substrate-2,简称IRS-2)基因3′-非翻译区(3′-untranslated region,简称3′-UTR)的分子变异及其与2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,简称T2DM)的关系,从湖南地区128例T2DM患者外周血白细胞中提取基因组DNA,采用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR)．变性高效液相色谱(denaturing hish—performance liquid chromatography,简称DHPLC)技术筛查IRS-2基因3′-UTR,对DHPLC峰型异常样品进行序列分析。在18例T2DM患者IRS-2基因3′-UTR的4064bp处发现T→C的突变。IRS-2基因3′-UTR的T4064→C突变可能与T2DM有关。     

Mash2基因在体细胞克隆牛肺脏中DNA甲基化状态分析

体细胞核移植(体细胞克隆)技术在动物生产、医药工业、治疗性克隆以及对珍稀濒危动物的拯救有重要意义,然而克隆效率低下以及克隆动物发育异常,严重制约了克隆技术的发展和应用．在体细胞核克隆中,供体核来自高度分化了的体细胞,发生在核移植后几小时内供体核的重编程,决定了克隆胚胎的发育能力．印记基因是由等位基因表观遗传修饰的不对称导致的基因表达具有亲本选择性,而DNA甲基化是调控印记的一个主要方式．印记基因Mash2在胚胎发育和器官形成过程中起着非常重要的作用．为了探求核移植过程中Mash2基因DNA 甲基化的表观重编程是否充分,利用亚硫酸氢盐测序法对出生48 h内死亡的体细胞核移植牛和正常对照牛肺脏中Mash2基因的DNA甲基化状态进行分析．结果显示,尽管位于Mash2基因启动子和第一个外显子处的CpG岛在正常牛和克隆牛中甲基化水平都不高(20.04%,5.55%),但克隆组的甲基化水平仍显著低于正常对照组 (P < 0.05)．甲基化模式正常组中9N3有5种不同的形式,9N4仅1种;而克隆组9C3和9C5也分别是1种．推测Mash2基因的异常DNA甲基化很可能是导致克隆牛肺脏发育异常的一个重要原因．     

鲢鱼解偶联蛋白2全长cDNA序列的克隆及其组织表达

从淡水食毒藻鱼类鲢鱼(Hypophthalmichthysmolitrix)肝脏,通过简并引物克隆解偶联蛋白2(un-couplingprotein2,UCP2)cDNA核心序列,应用5′RACE和3′RACE技术分别扩增该序列的5′末端和3′末端序列,最后通过序列拼接获得鲢鱼肝脏UCP2cDNA全序列。序列分析结果表明,鲢鱼肝脏UCP2cDNA全长1452bp,其中5′-UTR长337bp,3′-UTR长182bp,编码区933bp,编码310个氨基酸,推测的氨基酸序列包含线粒体内膜载体蛋白3个特征结构及解偶联蛋白(UCPs)的特征序列。对鲢鱼不同组织UCP2的表达调控研究发现,鲢鱼组织UCP2基因在肠道、肝脏、肌肉、脂肪组织均大量表达,而在脑组织表达量较低,这与鲢鱼体内微囊藻毒素在这几个组织的分布完全一致,表明UCP2的功能可能与抑制微囊藻毒素引发过量活性氧(ROS)生成有关。     

ES小鼠和ES细胞中H19基因甲基化状态

为探讨印迹基因H19的甲基化状态与ES小鼠胚胎发育之间的关系, 以遗传背景相同的正常成年对照小鼠、22只成年ES小鼠和8只新生死亡的ES小鼠以及不同传代次数的ES细胞为实验材料, 利用甲基化敏感性限制性内切酶-PCR技术分别检测了其印迹基因H19的5′非翻译区两个位点的甲基化状态。结果表明, 发育至成年的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与正常成年对照小鼠之间没有差异, 而新生死亡的ES小鼠印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠相比则存在明显差异。推测ES细胞中印迹基因H19所检测位点的甲基化状态与成年ES小鼠以及正常成年对照小鼠之间可能存在 差异。     

六种藓类植物茎的比较解剖学研究

通过对6种藓类植物,即褶叶青藓(Brachythecium salebrosum(Web.et Mohr.)B.S.G.)、湿地匐灯藓(Plagiomnium acutum(Lindb.)Kop.)、侧枝匐灯藓(Plagiomnium maximoviczii(Lindb.)Kop.)、大凤尾藓(Fissidensnobilis Griff.)、大羽藓(Thuidium cymbifolium(Doz.et Molk.)B.S.G.)和大灰藓(Hypnum plumaeforme Wils.)嫩茎和老茎的石蜡切片和显微观察发现,同一藓类植株的嫩茎和老茎,茎结构稳定,不同种藓类植物茎横切面具有不同特征.植物体茎横切面形状、表层细胞的层数、细胞大小和细胞壁厚薄、皮层细胞大小和形状、中轴的有无以及比例等特征可以作为藓类植物的分科分类依据之一.     

真菌类遗传学分析的知识结构教学

本文以认知结构理论为指导,讨论了真菌类遗传分析与高等动植物遗传分析的内在联系,认为利用这种内在联系进行教学可收到好的效果并说明了作者的具体教学过程。 Abstract:In the paper, the relationship between genetic analysis of Fungi and genetic analysis of high animal and plant was discussed.A good results were obtained when we adopted this method in the teaching.     

Cause of Senescence of Nine Sorts of Flowers

The levels of endogenous phytohormones and respiratory rate in nine sorts of flowers such as Cymbidium faberi Rolfe, Nopalxochia ackermannii Kunth and others were investigated both at full bloom and senescence and meanwhile the effect of exogenous phytohormones on prolonging the blossoms and promoting ethylene production were tested. There is a high content of endogenous ethylene in all the long-lived flowere, about 3–16 folds higer than the short-lived ones. There is a high level of ABA at full blooming flowers of short-lived flowers, in which there is no or only some cytokinins in it, but the ratio of CTK (6BA+zeatin)/ABA is smaller(l.7). The endogenous ABA reached a much higher level at senescence in all nine sorts of flowers, so it is reasonable to consider that it is ABA which plays an important role of regulation in controlling flower's senescence. There is a much higher level of GA3 and zeatin in the long-lived flowers which is not demonstrated in the shortlived ones. The respiratory rate is one of the factors controtling the longevity of flowers, but it does not play a decided role. Application of 6BA and zeatin prolongs distinctly orchid’s longevity, however exogenous IAA through the promotive action on ethylene production, evidently extends the longevity of the flowers of the Nopalxochia ackermannii Kunth.     

Time of detection of recessive genes: effects of system of mating and number of examined individuals

Summary Anthers were cultured from two sets of seven lines of hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) with different cytoplasms, the euplasmic nucleus donors, Siete Cerros 66 and Penjamo 62, as well as their six alloplasmic lines derived from wild relative species of the genera Triticum and Aegilops. Significant cytoplasmic and nuclear effects but no cytoplasmic-nuclear interaction were found for embryogenic anther response, with the best performance of Penjamo 62 in Ae. kotschyi cytoplasm. Plant regeneration was not affected significantly by the cytoplasmic background of the lines cultured. The possible genetic implications of the observed cytoplasmic and nuclear influences on the in vitro haploid induction of wheat are discussed.     

龙胆科药用植物化学成分的研究现状

龙胆科植物在我国的分布范围很广,且多数为药用植物,其多数种属的药用植物,至今其化学成分尚未被系统研究。综述了目前龙胆科药用植物的化学成分的研究现状及一般提取方法,对近年来发现的环烯醚萜及裂环烯醚萜类化合物进行了总结,为本科药用植物的更深入研究提供了参考。     

Photoregulation of seed germination of wild-type and of an aurea-mutant of tomato

Seed germination of an aurea mutant of tomato ( Lycopersicon esculentum Mill.) is promoted by continuous irradiation with red, far-red or long-wavelength far-red (758 nm) light as well as by cyclic irradiations (5 min red or 5 min far-red/25 min darkness). Far-red light applied immediately after each red does not change the germination behaviour. Seed germination of the isogenic wild-type, cv. UC-105, is promoted by continuous and cyclic red light while it is inhibited by continuous and cyclic far-red light and by continious 758 nm irradiation. Far-red irradiation reverses almost completely the promoting effect of red light. The promoting effect (in the aurea mutant) and the inhibitory effect (in the wild-type) of continuous far-red light do not show photon fluence rate dependency above 20 nmol m⁻² s⁻¹. It is concluded that phytochrome controls tomato seed germination throgh low energy responses in both the wild type and the au mutant. The promoting effect of continuous and cyclic far-red light in the au mutant can be attributed to a greater sensitivity to P_fr.     

Scales of spatial patterns of distribution of intertidal invertebrates

Few comparative studies of spatial patterns at different scales have examined several species in the same habitat or the same species over a range of habitats. Therefore, variability in patterns among species or among habitats has seldom been documented. This study quantifies spatial patterns of a suite of intertidal snails and a species of barnacle using a range of statistical techniques. Variability in densities was quantified from the scale of adjacent quadrats (over a distance of centimeters) to tens of kilometers. Significant differences in abundances occurred primarily at two spatial scales. Small-scale differences were found at the scales of centimeters or 1–2 m and, for many species on many shores, these accounted for most of the variability in abundances from place to place. These are likely to be determined by behavioural responses to small-scale patches of microhabitat. Large-scale differences in abundance were also found in most species at the scale of hundreds of meters alongshore. These are likely to be due to variation in recruitment (and/or mortality) because of limited dispersal by adults of these species. There was little or no additional variation among shores, separated by tens of kilometers, than was shown among patches of shore separated by hundreds of meters. Identification of the scale(s) at which significant differences in abundance are found focus attention on the processes (and the scales at which these processes operate) that influence patterns of distribution and abundance. Some of the advantages and disadvantages of various procedures are discussed.