转座子标签法在构建G-细菌突变体库中的应用

应用转座子标签法以水稻黄单胞菌 (Xoo)为研究对象 ,构建了Xoo的突变体库 ,为革兰氏阴性细菌突变体库的建立 ,验证了一个较新的方法和思路。经分子生物学检测 ,此方法简便易得、高效稳定 ,可以定向突变 ,为研究G-细菌的各项功能提供了良好的素材 ,加快了研究进程。     

卡瓦胡椒RAPD反应体系的建立

卡瓦胡椒RAPD分子标记的研究,目前国内外尚未见有报道。该试验通过CTAB法提取卡瓦胡椒基因组DNA,通过对模板DNA用量、Mg^2＋浓度、退火温度、电泳上样量等几个单因子试验来建立RAPD稳定扩增体系和反应条件,RAPD扩增结果重复性好,稳定可靠,为卡瓦胡椒RAPD分子标记的研究打下基础。     

水稻插入突变库构建研究进展

水稻是单子叶植物基因组研究的一种模式植物 ,其全基因组测序已经完成 ,在此基础上开展功能基因组的研究。水稻插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容 ,在此基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。水稻插入突变体库构建的方法有T DNA插入突变、Ac Ds系统插入突变、Tos1 7插入突变。分别介绍三种方法的原理及其在水稻突变体库构建中的应用和研究进展。     

高压导致水稻变异品系发生DNA甲基化模式及基因组结构的改变

用高压力诱变水稻品种“毕粳38”, 产生了两个稳定的变异: 变异1与变异2. 对原种及两个变异品系的基因组DNA及Hpa Ⅱ/Msp Ⅰ酶切后的基因组DNA采用ISSR及RAPD分析; 并通过特异引物分析水稻的转座子mPing的变化; 且对变异片段纯化测序; 同时以水稻基因组中潜在活跃的反转录转座子LTR(long terminal repeat)Osr7, Osr36, Tos19(Osr54)以及转座子MITEs(miniature inverted-repeat transposable elements)的mPing和Pong及某些特异片段为探针, 进行Southern杂交. 结果显示原种及两个变异品系不仅存在着基因组结构的变异, 而且发生了DNA甲基化模式的改变. 此外, 对原种及两个变异品系进行了异地栽种, 其形态水平的变异稳定表达. 结果表明: 高静水压对高等植物的种子进行诱变, 产生表型变异的分子基础是由于发生了DNA分子水平上的广泛变异, 并证明高压可导致水稻多种转座元件的可能激活及DNA甲基化模式的改变. 因此可以认为高压是引起植物遗传变异一个重要因素, 可能在作物诱变育种中具有广阔的应用前景.     

化学诱导激活型拟南芥突变体库的构建及分析

利用化学诱导激活XVE（LexA-VP16-ER）系统构建了一个包含40000余个独立转化株系的拟南芥突变体库,并对其中的18000余个株系进行了初步的遗传学和表型分析鉴定。卡那霉素抗性分离比表明,51．6％的株系为单位点插入株系,T-DNA插入的平均拷贝数为每株系1．38个。部分T1代和T2代植株表现出了可见的形态变异,包括下胚轴长度、根长度、植株大小和颜色、叶子颜色和形态、开花时间、种皮颜色及结实情况等对数个代表性突变株系表型及T—DNA插入位点侧翼序列进行了分析,结果表明突变体的表型是由于T—DNA的插入造成的,而且这些突变体中包括前人发现的AP2和AGAMOUS的等位基因。由于T-DNA标记或相邻的基因可被XVE系统诱导性的激活,或被T-DNA破坏导致功能缺失,该突变体库可以用于大规模筛选鉴定功能缺失性和功能获得性突变体。     

水稻T-DNA插入突变体库的构建及突变类型的分析

利用农杆菌介导的转化系统转化中花11成熟胚愈伤组织,获得1489个独立转化的T-DNA插入再生株系。PCR和Southern杂交的结果表明,69．8％转化株系被整合了T-DNA,通过Tail-PCR也从转化植株中扩增出T-DNA侧翼序列。同时对1066个T1转化株系的抽穗期、株高、单株穗数的调查结果表明,不同株系中分离出了突变植株。     

苜蓿红豆草属间体细胞杂种的分子生物学鉴定

通过原生质体融合和培养获得苜蓿红豆草属间体细胞杂种植株。采用一种简便方法从杂种组织再生植株叶片、红豆草羟脯氨酸抗性系再生植株叶片和苜蓿根癌农杆菌702转化系愈伤组织提取DNA用于RAPD和Southern杂交分析。随机引物扩增结果显示两种亲本的RAPD多态具有明显差异。在所用20种随机引物中,6种产生较多的DNA片段。杂种组织具有两种亲本特有的DNA片段,但倾向于排除红豆草亲本的染色体,表明该杂种为非对称杂种,两种亲本染色体之间可能发生了重组。由于红豆草DNA的介入,杂种组织表现出较强的分化能力。分别利用RAPD扩增得到的OPA141000bp红豆草羟脯氨酸抗性系特异产物和OPA141600bp苜蓿根癌农杆菌702转化系特异产物为探针进行Southern分子杂交,证明杂种组织同时具有这两种DNA片段的同源序列。     

一个水稻矮秆突变体的遗传分析及基因定位

水稻（Oryza sativa）是我国重要的粮食作物之一。水稻矮秆材料的引入掀起了第1次＂绿色革命＂。但近年来,在水稻育种中矮生基因遗传单一的问题越来越突出,已经严重影响到水稻产量的持续提高。利用60Co-γ射线辐照籼稻亲本材料M804获得了一个性状能够稳定遗传的矮秆突变体MU101。对该矮秆突变体和台粳16号杂交获得的F2代的遗传分析表明,该矮秆性状受1对隐性单基因控制,并暂命名为ds1。利用已有的SSR分子标记将DS1基因定位在水稻第5号染色体上,通过扩大群体和开发新的Indel标记,进一步将DS1基因定位在2个Indel标记之间,两者间的物理距离大约为384kb。该研究为DS1基因的克隆及其在生产中的应用奠定了基础。     

RAPD影响因素的研究及实验条件的优化进

针对叶种红松和阔叶树种蒙古栎为材料,研究了随机扩增多态ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）的影响因素,优化了各种实验条件。ＲＡＰＤ对模板浓度的适应范围比较广,从１０－８０ｎｇ／反应均可得到一致的效果。     

HBV耐药相关DNA突变体的构建及在寡核苷酸基因芯片分析中的应用

拉米呋啶（Lamivudine)是近年来开发成功的一种治疗HBV慢性感染病人的核苷类药物。随着拉米呋啶在临床上广泛使用,HBV耐药现象已成为临床实践中的棘手问题。建立HBV耐药测定技术成为HBV基础研究和临床实践中企待解决的一个重要问题。寡核苷酸芯片（Oligochip)是近年来发展并逐步成熟的一种高通量基因检测技术,已成功应用于基因突变快速和高通量检测。本研究在构建HBV拉米呋啶抗性相关HBV多聚酶基因突变体基础上,设计并制备了HBV耐药寡核苷酸芯片（HBV－Lam Oligochip)。根据HBV拉米呋啶抗药性相关突变主要位于HBV多聚酶基因的L526、A546、M550和V553等氨基酸位点,设计了28条寡核苷酸探针。探针对应序列为HBV DNA聚合酶基因反义链,HBVHBVhb长度为15－18nt。探针合成时在其3′端接氨基和间隔臂（spacer)等特定修饰;探针纯化与定量后,用基因芯片点样仪点到醛基修饰载玻片上,制成HBV耐药寡核苷酸芯片（HBV－Lam Oligochip)。为了分析基因芯片的性能,克隆了833号HBV病人血清中HBV DNA聚合酶基因,测序证实为HBV DNA野生型（即未发生突变）。以该DNA为模板,用PCR法构建了HBV耐药相关突变体。用HBV－Lam Oligochip对HBV野生型DNA和人工构建DNA突变体进行了检测。结果发现,HBV－Lam Oligochip能有效检测出野生型DNA序列。检测突变体时,HBV－Lam Oligochip检测结果与相应突变体DNA序列一致,表明HBV－Lam Oligochip不仅可检测出野生型序列,而且可有效地分辨出单碱基突变,可应用于HBV耐药基因突变临床检测。     

Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(AcTPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ac×Ds的杂交组合354个.检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性.结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4%.检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中.在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7%.对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制--转座和不完全切离等现象.获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录.探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略.     

Ac／Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性及转座子插入位点旁侧序列的分析

利用本实验室构建的转Ac(Ac TPase)及Ds(Dissociation)的水稻(Oryza sativa L.)转化群体,配置了Ae×Ds的杂交组合354个。检测了转基因植株的T-DNA插入位点右侧旁邻序列,研究了Ac/Ds转座系统在水稻转化群体中的转座活性。结果表明,有些转化植株T-DNA插入位点相同或相距很近,插入位点互不相同的占65.4％。检测到T-DNA可插入到编码蛋白的基因中。在Ac×Ds的F2代中,Ds因子的转座频率为22.7％。对Ac×Ds杂交子代中Ds因子旁侧序列的分析,进一步表明了Ds因子在水稻基因组中的转座活性,除了从原插入位点解离并转座到新的位点之外,还有复制——转座和小完全切离等现象。获得的旁侧序列中,有些序列与GenBank中的数据没有同源性,目前有2个DNA片段在GenBank登录。探讨了构建转座子水稻突变体库进行水稻功能基因组学研究的策略。     

插入玉米Ds转座因子的水稻转化群体及其分子分析

转座子标签法是一种利用转座因子插入高等植物基因组中造成基因突变,然后通过分离转座因子插入的旁邻顺序,进而克隆出突变基因的策略。这种策略在高等植物功能基因组学的研究中是十分有用的。为此目的,将玉米的Ds因子及bar基因连接至载体pCAMBIA1300的T-DNA区域中,构建成重组Ti质粒pDsBar1300。pDsBar1300中T-DNA区域中的潮霉素抗性基因可在转化过程中用作水稻转化植株的选择标记。插入在Ds因子中的bar基因可追踪转化后代的Ds因子。pDsBar1300通过根瘤农杆茵介导引入水稻品种中花11号的幼胚组织。从各转化愈伤组织中获得了1400株独立的Ds水稻转化植株。通过PPT抗性检测和PCR分析证明了水稻转化植株中Ds因子的整合。Southernblot分析了转化植株基因组中Ds因子的插入拷贝数,其中单拷贝插入比率约占70％。这些插有Ds因子的水稻转化植株,当引入自主型的Ac因子反式活化Ds因子后,可使Ds因子跳跃到不同位点上,就可得到更多的突变植株。     

玉米转座因子Ac／Ds导入水稻花药悬浮细胞并再生成植株

使用电激法将分别含玉米转座因子ＡＣ或Ｄｓ因子的质粒ＤＮＡ同时导入水稻花药悬浮系细胞团,得到转化抗性意伤组织,并分化成可育植株。对一些植株的ＤＮＡ进行了Ｓｏｕｔｈｅｒｎ分析和ＰＣ且扩增,发现导入的外源ＤＮＡ已整合到了水稻染色体上而且Ｄｓ因子已发生了转座。抗性测定表明转化植株Ｆ１代和Ｆ２代种子中的大多数仍有Ｄｓ因子存在。     

插入含Ds因子的T-DNA产生的水稻脆秆突变株的遗传和分子分析

在构建由农杆菌介导的玉米Ds转座因子插入的水稻转化群体中,得到了一个茎秆等组织发生脆性突变的株系。理化指标定量测定表明,脆性株系的载荷强度和纤维素含量都比正常植株低很多,可溶性糖含量略有减少。对这个突变株的分子检测结果表明Ds因子在脆性株系中为单位点插入。检测了自前3代（T1,T2,T3)植株中T-DNA(Ds)插入与脆性表型的共分离关系。初步结果表明这个突变是T－DNA（Ds)的插入造成的,这个突变基因可能与水稻纤维素合成有关。     

水稻Ds插入纯合体的筛选和鉴定

采用Basta抗性鉴定、潮霉素抗性鉴定和PCR检测相结合的方法筛选和鉴定了水稻Ds插入纯合体。在T1代236个转化株系中,有16个株系的全部植株表现出对Basta的敏感,其余220个株系的植株表现出对Basta的抗性。经过3代的纯合筛选,共鉴定出Ds插入纯合体203个．这些Ds插入纯合体可用于构建Ac／Ds系统和对Ds插入突变体进行筛选和鉴定,为水稻功能基因组学研究提供了材料。     

利用Ac/Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记转基因植株的方法

获得无选择标记转基因植株是进行重复转基因及消除转基因植株中标记基因潜在危害性的关键。实验采用了Ac／Ds转座子系统在水稻(Oryza sativa,L．)中进行无hpt选择标记的转基因。将含有目的基因bar的Ds元件和hpt标记基因置于同一个T-DNA中,通过农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHAl05介导将Ac-T-DNA及Ds-T-DNA分别转入到不同的水稻植株,再将单拷贝的Ac-T-DNA植株与单拷贝的Ds-T-DNA植株杂交得到同时含有Ac和Ds元件的F1植株,Fl自交产生F2后代,F2植株中转座后的Ds元件与T-DNA独立分离,在总共100株F2水稻植株中筛选得到2株只含有Ds元件插入而无hpt标记基因的转基因水稻植株。结果表明,利用Ac／Ds转座子系统在水稻中获得无选择标记的转基因植株是可行的。     

Production of Transgenic Kidney Bean Shoots by Electroporation of Intact Cells

We obtained transformed bean shoots by electroporation of intact bean cells with the plasmid pDPG165 containing bar gene conferring herbicide resistance to plants. Transformed shoots were selected from electroporated callus on herbicide containing media. Data of molecular analysis (PCR and Southern blotting) confirmed the insertion of bar gene in the genome of herbicide resistant shoots. Detailed procedures for obtaining regenerative bean callus, optimization of electroporation of intact cells and transgenic shoots are given.     

从水稻Ac/Ds插入突变体扩增Ds侧翼序列的最适TAIL-PCR引物

温度非对称交互PCR(TAIL-PCR)技术已广泛应用于从多种生物体系克隆侧翼于已知序列的DNA片段的分子操作中,并极大地促进了反向遗传学研究。但是,可能由于不同物种间基因组大小和序列存在显差异,在采用该技术进行转座元件Ds水稻插入突变体鉴定过程中,常因TAIL-PCR反应的稳定性差而影响突变体筛选效率。有鉴于此,根据Ds核苷酸序列设计了分别对应或互补于Ds插入元件两端长度不同的12个特异引物组成32个组合,在大量预试验基础上与6个不同简并性(32～256)的随机简并引物分别组合进行TAIL-PCR反应,较系统地研究了引物特性对以水稻基因组DNA为模板的TAIL-PCR反应效率的影响。结果发现,第一反应采用长序列特异引物(36～40mer)可显提高扩增特异性,随机简并引物的简并度对反应的影响显。还选择出两个适于从水稻Ds插入突变体基因组高效扩增出Ds插入侧翼片段的最优特异引物组合和最适简并引物。应用本研究结果可显地提高TAIL-PCR技术筛选水稻插入突变体的效率。