肿瘤干细胞标记物CD133与miR-429在大肠癌组织中的表达及其相关性研究

目的：检测CD133不同亚群大肠癌细胞HT-29的miR-429表达情况,探讨miR-429及CD133的表达与肿瘤的发生发展之间的关系。方法：采用荧光活化细胞分选法（FACS）分选出CD133不同亚群细胞,实时荧光定量PCR分别检测两组细胞miR-429的表达,合成miR-429寡核苷酸和阴性对照miRNA并分别转染CD133＋和CD133＋两个亚群细胞。再将细胞种植于非肥胖糖尿病／严重联合免疫缺陷（NOD／SCID）小鼠体内构建移植瘤模型,不同时间测量肿瘤体积和重量,RT—PCR及蛋白质印迹检测CD133＋和CD133＋两组肿瘤CD133mRNA和蛋白质表达。结果：血清检出CD133＋细胞为67．9％,miR-429的表达量是CD133＋细胞的（1．83±0．91）倍（P〈0．05）,CD133＋比例与miR-429表达呈负相关（r=0．591,P〈0．05）;miR-429＋／CD133＋组的移植瘤体积及重量与对照组比较有统计学差异（P〈0．05）,且miR-429＋/CD133＋组成瘤时间较对照组晚约2周,但miR-429＋/CD133＋组的移植瘤CD133表达量低,与阴性对照组比较无明显差异（P〉0．05）。结论：miR-429可能作为CD133的负性调控因子,具有抑制肿瘤生长的作用,但miR-429与CD133在肿瘤发生、发展过程中的作用机制有待进一步研究阐明。     

肿瘤干细胞标记物CD_(133)与miR-429在大肠癌组织中的表达及其相关性研究

目的:检测CD133不同亚群大肠癌细胞HT-29的miR-429表达情况,探讨miR-429及CD133的表达与肿瘤的发生发展之间的关系。方法:采用荧光活化细胞分选法(FACS)分选出CD133不同亚群细胞,实时荧光定量PCR分别检测两组细胞miR-429的表达,合成miR-429寡核苷酸和阴性对照miRNA并分别转染CD133+和CD133-两个亚群细胞。再将细胞种植于非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体内构建移植瘤模型,不同时间测量肿瘤体积和重量,RT-PCR及蛋白质印迹检测CD133+和CD133-两组肿瘤CD133mRNA和蛋白质表达。结果:血清检出CD133+细胞为67.9%,miR-429的表达量是CD133+细胞的(1.83±0.91)倍(P0.05),CD133+比例与miR-429表达呈负相关(r=0.591,P0.05);miR-429+/CD133+组的移植瘤体积及重量与对照组比较有统计学差异(P0.05),且miR-429+/CD133+组成瘤时间较对照组晚约2周,但miR-429+/CD133+组的移植瘤CD133表达量低,与阴性对照组比较无明显差异(P0.05)。结论:miR-429可能作为CD133的负性调控因子,具有抑制肿瘤生长的作用,但miR-429与CD133在肿瘤发生、发展过程中的作用机制有待进一步研究阐明。     

Galectin-7对食管鳞癌细胞株Eca-109迁移、侵袭的影响及其机制

为了探讨半乳糖凝集素-7(Galectin-7)在食管癌Eca-109细胞发生发展中的细胞外功能及其机制,该实验采用免疫印迹法检测浓缩细胞上清液中Galectin-7的表达,并利用不同浓度的重组Galectin-7培养食管癌Eca-109细胞。使用免疫印迹、实时荧光定量PCR、细胞划痕实验、MTT实验检测在培养后细胞中基质金属酶-9(MMP-9)、p38、pp38表达水平的变化以及Eca-109细胞迁移和增殖能力的改变。结果显示,Galectin-7存在于Eca-109细胞细胞上清液中,加入重组Galectin-7培养细胞后,MMP-9、pp38的表达水平明显上升,并且细胞的迁移能力也得到了提高,增殖能力无明显变化。由此说明,在食管癌Eca-109细胞中,Galectin-7可以被细胞分泌至细胞外,可能通过结合细胞外膜上特异性糖基配体激活p38 MAPK通路诱导MMP-9的表达,从而在Eca-109细胞侵袭、迁移过程中发挥重要的作用。     

CD133 蛋白在非小细胞肺癌组织中的表达及其与临床病理参数及预后的关系

目的:研究CD133蛋白在非小细胞肺癌(NSCLC)组织中的表达及其与临床病理参数及预后的关系。方法:选择2011年4月~2012年4月间我院收治的42例NSCLC的临床资料,采用免疫组织化学染色法检测癌组织和其中30例癌旁边正常组织CD133的表达,并分析其与肺癌临床病理参数及预后的关系。结果:癌症组织CD133蛋白阳性表达率为57.1%,高于癌旁边正常组织的16.7%,差异有统计学意义(P均0.05);CD133蛋白阳性表达与NSCLC患者年龄、性别以及肿瘤大小、肿瘤位置、组织学类型、组织分化程度以及不同临床分期无关(均P0.05),与淋巴结转移有关,差异有统计学意义(P0.05);CDD133阳性及阴性患者近3年生存率比较,1年生存率比较差异不显著(P0.05),2、3年生存率比较,差异显著有统计学意义(P0.05)。结论:CD133蛋白在NSCLC组织中的高表达,且与NSCLC转移及预后密切相关,对于患者临床特征及预后的关系具有重要的研究价值。     

抑制Plk1表达对食管癌细胞化疗敏感性的影响

研究食管癌细胞中Plk1表达被抑制后对化疗药物敏感性的影响,为进一步研究开发基于Plk1食管癌分子靶向治疗奠定基础。化学合成法合成特异性的短链Plk1siRNA,脂质体转染法将短链siRNA分别导入3代表性的食管癌细胞系;采用RT-PCR和蛋白质印迹法确认siRNA对Plk1表达的抑制效果;MTT分析观察抑制Plk1表达对食管癌细胞化疗药物敏感性的影响。半定量RT-PCR和蛋白质印迹分析结果表明,合成的特异性短链Plk1siRNA在mRNA和蛋白质水平上均能高效、特异性地抑制所使用的3代表性食管癌细胞系中Plk1的表达,抑制程度约90%。MTT分析结果表明,siRNA抑制Plk1表达后,能显著提高3食管癌细胞系对化疗药物阿霉素和顺铂的敏感性。由此证实,siRNA介导的Plk1表达抑制能显著提高食管癌细胞对化疗药物阿霉素和顺铂的敏感性。     

CD133分子与造血干/祖细胞和癌干细胞之间的关系

越来越多的实体瘤癌干细胞(CSCs)研究中鉴定分离出含有CD133+的CSCs亚群。深入了解CD133+分子的生物学特性及在细胞与肿瘤信号转导、药物耐受和放化疗抵抗等的相关性,将有助于靶向治疗CSCs。本文就CD133分子与造血干/祖细胞(HSPC)和CSCs之间的关系及其耐药机制的研究进展作一综述。     

结直肠癌CD133的表达与细胞周期蛋白水平及血清癌胚抗原含量的关系

目的探讨结直肠癌肿瘤干细胞标志物CD133分子的表达与细胞周期蛋白表达有无关系,分析肿瘤CD133分子的表达变化是否影响血清肿瘤标志物癌胚抗原的水平。方法应用流式细胞术检测41例结直肠癌肿瘤组织的CD133,cyclin D1,cyclin E,cyclin A和cyclin B1的表达水平,血清癌胚抗原的含量常规由检验科用放免法检测,数据采集自检验报告单。结果 41例结直肠癌肿瘤组织CD133分子的表达率是0.3%-47.07%,cyclin D1为2.94%-36.93%,cyclin E为0.49%-9.28%,cyclin A为0.42%-22.33%,cyclin B1为1.24%-22.96%。相关分析表明,CD133的表达水平与cyclinD1相关r=0.405 P=0.047,与其它几种细胞周期蛋白的表达水平无关,均为P0.05。CD133的表达水平和血清癌胚抗原的表达呈正相关r=0.601P=0.009。结论结直肠癌CD133分子的表达与细胞周期蛋白cyclin D1的表达正相关,两者一定程度上共同反映了癌细胞的增殖状态。CD133高表达的结直肠癌,常伴有患者血清癌胚抗原的高表达,两者密切相关。     

过表达微小RNA miR-125b对人胚胎干细胞增殖的影响

目的:通过在人胚胎干细胞(hESC)中有效转染微小RNA miR-125b的真核表达载体,研究过表达miR-125b对hESC增殖的影响。方法:将在无饲养层上培养至第3 d,克隆融合达70%的hESC用Accutase酶消化为单细胞,然后用LipofectAMINE2000对hESC单细胞转染pHRS-1cla-miR125b-CMV-EGFP载体及其对照pHRS-1cla-CMV-EGFP载体,通过实时定量PCR对转染后细胞中成熟miR-125b的表达进行检测;进一步进行细胞计数和克隆计数,对miR-125b表达上调的hESC的增殖情况进行分析。结果:实时定量PCR检测结果表明,细胞转染后72 h,miR-125b的表达上调1.45倍,说明hESC转染成功;克隆计数及细胞计数结果显示过表达miR-125b的hESC增殖受到明显抑制(P<001)。结论:转染miR-125b真核表达载体的hESC能够上调成熟miR-125b的表达,hESC中miR-125b的表达上调能明显抑制hESC的增殖。     

肿瘤干细胞标记分子CD133在胶质瘤细胞U87中的稳定表达

目的：在体外胶质瘤U87细胞中稳定表达肿瘤干细胞标记分子CD133。方法：通过脂质体介导将表达载体质粒CD133-1／pCR3．1-Uni转染U87细胞,G418筛选稳定表达抗性的细胞株;用细胞免疫荧光染色鉴定表达CD133分子的U87细胞。结果：转染CD133表达载体的U87细胞可以被CD133单抗识别,而转染空载体的U87细胞免疫染色结果为阴性,表明CD133分子在U87细胞中稳定表达。结论：U87细胞稳定表达CD133分子,为体内外分析CD133阳性U87细胞特性奠定了基础：U87CD133阳性细胞可以作为免疫组化或流式细胞术等检测其他肿瘤干细胞CD133表达的阳性对照细胞。     

维生素D_3联合5-氟尿嘧啶对人食管癌Eca-109细胞移植瘤VDR表达的影响

探讨维生素D3、5-氟尿嘧啶单独与联合使用对人食管癌Eca-109细胞移植瘤维生素D受体(vitamin Dreceptor,VDR)的作用.随机分为对照组(C)、预处理组(PT)、维生素D3组(V)、5-氟尿嘧啶组(F)、预处理+5-氟尿嘧啶组(PT+F)、维生素D3+5-氟尿嘧啶组(V+F).体外培养人食管癌Eca-109细胞,BALB/c裸鼠皮下荷瘤,2.5μg/kg1,25-(OH)2维生素D3、25 mg/kg 5-氟尿嘧啶单独与联合腹腔注射,观察瘤体生长情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹技术(Western blot)检测裸鼠瘤体组织VDR mRNA与蛋白的表达.研究发现1,25-(OH)2维生素D3、5-氟尿嘧啶均能抑制裸鼠移植瘤的生长,PT、V、F、PT+F、V+F组瘤体体积与C组比较差异有统计学意义(P<0.05);RT-PCR与Western blot结果显示经1,25-(OH)2维生素D3单独与联合5-氟尿嘧啶使用后瘤体组织中VDR mRNA和蛋白表达升高,且联合用药更为显著(P<0.05).结果表明1,25-(OH)2维生素D3、5-氟尿嘧啶均能抑制人食管癌Eca-1...     

培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响

目的:比较不同血清浓度培养体系对表皮干细胞增殖分化的影响.方法:采用两步酶消化法和IV型胶原差速贴壁相结合的方法获得人原代表皮干细胞,分别以0%、5%、10%、15%和20%血清浓度的培养基在96孔板中进行培养.观察表皮干细胞形态,克隆形成及增殖的情况,应用四甲基偶氯唑蓝(MTT)比色法检测各组细胞存活和生长情况,分析量效和时效关系;持续传代培养细胞,每次传代的同时取适量细胞,用免疫细胞化学的方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物(K19、K14和K10)的测定.结果:表皮干细胞在各种血清浓度的培养基内均能形成克隆,增殖良好.用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定,所得相同时间点各组OD值在统计学上没有差异(P>0.05),表皮干细胞生长速度各组间无差异.第1代表皮干细胞K19均有表达,而K14和K10表达均为阴性;其后高血清浓度(15%、20%)培养基中细胞较低血清浓度(0%、5%)先出现K14、K10蛋白的表达;培养至第10代是各组细胞均出现K10高表达,而K19、K14表达阴性.结论:在低血清浓度(0%、5%)的培养基中表皮干细胞生长良好,且能够相对较好保持表皮干细胞的特性.     

低氧对胚胎干细胞增殖的影响

目的:观察间歇性低氧和持续性低氧对体外培养的胚胎干细胞(ES细胞)增殖的影响.方法:利用细胞记数法和BrdU (5-溴脱氧尿苷)掺入的流式细胞分析检测细胞增殖,并用RT -PCR的方法检测低氧诱导因子(HIF-1a)的表达变化.结果:①将ES细胞分别放在低氧(3%～10% O2)和常氧(20% O2)的环境中培养24 h后,在低氧环境中培养的ES细胞数较常氧组明显减少;②将ES细胞分别给予间歇性低氧刺激(3%～10% O2),每天10 min,连续4 d后,发现3%低氧组较常氧对照组的细胞增殖明显升高.③用RT-PCR方法观察HIF-1a的表达与细胞增殖的关系,发现在常氧环境中培养的ES即有HIF-1a的表达,ES细胞在持续低氧24 h或间歇性低氧(3%～10% O2)刺激4 d后对HIF-1a的表达均无明显影响.结论:间歇性低氧(3% O2)可明显促进体外培养的ES细胞增殖,而持续性低氧抑制ES细胞增殖,间歇性低氧(3% O2)刺激促进ES细胞增殖的机制尚有待于进一步的研究.     

肝癌细胞系中SP及CD133+细胞的特性分析

近年的研究表明体外培养的肝癌细胞系中存在着少量具有肝癌干细胞功能的细胞群。有研究指出肝癌干细胞存在于侧群细胞(sidepopulation,SP)中,另有研究则发现CD133+细胞是肝癌干细胞的特征。本研究以三种肝癌细胞系(Hep3B、Huh-7和PLC/PRF/5)为对象,利用流式细胞术对其中的SP细胞与CD133+细胞进行了分析,并进一步检测了它们的增殖能力、表型及耐药性等特性。结果显示,肝癌细胞系中存在不同比例的SP细胞和CD133+细胞,且大部分SP细胞呈CD133阳性表达。表型特征分析显示SP细胞表达CK7和CK19,不表达AFP,而CD133+细胞则表达AFP和CK19,却不表达CK7。SP与CD133+细胞都具有较强的增殖能力。另外,相比于其它细胞,SP细胞具有最强的化疗药物抗性。结果表明,肝癌细胞系中SP细胞与CD133+细胞整体特征有一定的区别,提示了它们不同的分化途径。     

不同参数电磁场对干细胞增殖分化的影响

随着电磁理论的不断深化,电磁场(EMF)的应用领域不断扩大,关于EMF的研究也越来越多,尤其是EMF对生命基础_细胞生物学效应的实验研究已成为当前的研究热点,其中有大量研究发现特定参数EMF可促进干细胞增殖与分化.因此,深入研究EMF促进干细胞增殖分化的最佳物理参数有重要意义.本文就不同参数EMF对干细胞增殖分化影响的研究进行综述.     

抗CD133胞外区骆驼多克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备高效价、高特异性的抗CD133胞外区新疆双峰驼来源的多克隆抗体,为制备高亲和力的抗CD133纳米抗体做准备。方法:将CD133胞外区基因序列构建到原核表达载体pET28a中,诱导表达及纯化CD133蛋白,免疫新疆双峰驼及新西兰兔。通过酶联免疫吸附实验(ELISA)和Western blot检测多克隆抗体的效价及与CD133特异性结合活性。结果:ELISA测定抗-CD133骆驼源抗体的效价可达到百万以上,通过Western blot检测多克隆抗体可特异性结合CD133蛋白。结论:重组人CD133蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应,为今后构建骆驼免疫单域抗体噬菌体展示文库奠定基础。     

低糖低氧对神经干细胞增殖和代谢的影响

目的:本研究旨在探讨低糖低氧对大鼠神经干细胞增殖和代谢的影响。方法:实验采用不同葡萄糖浓度的培养基以及不同的氧浓度进行处理:高糖(4.5g/L)、低糖(1.4g/L);常氧(20%O2)、低氧(3%O2);神经干细胞(NSCs)来自孕13.5d的大鼠中脑,在不同糖浓度下培养至第三代进行低氧处理,分为低糖常氧(L+N)、低糖低氧(L+H)、高糖常氧(H+N)、高糖低氧(H+H)组。神经干细胞在上述四种条件下分别培养1、3、5d后,利用CCK-8检测神经干细胞的增殖情况;生化分析仪测定细胞培养上清液中葡萄糖、乳酸、丙酮酸浓度;RT-PCR方法检测葡萄糖转运蛋白4(GluT4)、葡萄糖激酶(GK)、丙酮酸激酶(PK)和乳酸脱氢酶(LDH)的表达变化。结果:在低糖低氧条件下培养3d时NSCs的数量增加最为明显;低糖低氧条件下,葡萄糖浓度降低最为显著;而丙酮酸浓度在低糖处理组均高于高糖处理组;同样地,在低糖低氧处理组培养上清中乳酸含量增加的幅度最大;此外,在低糖或低氧时Glut4和PK的表达也明显高于对照组。结论:低氧能促进NSCs的增殖,而以低氧和低糖共同作用时更为明显;在低氧低糖条件下,神经干细胞的代谢发生变化,葡萄糖的利用明显增加,主要通过糖酵解途径代谢产能。     

大气压冷等离子体对人脐带间充质干细胞增殖和分化的影响

人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)是一种具有多向分化潜能的干细胞,具有广阔的应用前景,但是由于其体外大量增殖和定向分化等问题尚未解决,制约了其进一步应用。既往研究表明,大气压冷等离子体(CAP)可促进离体培养的脂肪或骨髓来源MSCs的增殖和分化,但对hUC-MSCs的影响国内外尚未见报道。因此,本研究的目标是探讨CAP对hUC-MSCs增殖和成骨分化的影响。在电源频率(17 kHz)和气体流量(4 slpm)保持不变的条件下,原代培养的hUC-MSCs经不同放电电压下产生的氦(He)等离子体处理后,在不同时间点收集细胞,采用CCK-8法检测细胞活力,微板法检测碱性磷酸酶(ALP)的活性,茜红素染色检测钙化结节的形成。结果显示,与对照组相比,纯氦气组上述指标无明显变化,而CAP组的细胞活力显著降低,并且与等离子体放电电压和处理时间呈负相关; CAP处理10 s和30 s后,ALP活性则无明显变化,而处理60 s后ALP活性显著下降,同时CAP处理30 s后钙化结节面积无显著变化。以上结果表明,本试验条件下的CAP处理可抑制hUCMSCs的增殖,但对其体外成骨分化无明显影响。     

MicroRNA-133b抑制人横纹肌肉瘤细胞增殖与迁移的研究

该研究首先通过Real-time RT-PCR检测发现,microRNA-133b在人横纹肌肉瘤细胞RD和A204中的表达量比正常肌肉组织中的表达量明显降低,再通过阳离子脂质体介导的方法将microRNA-133b转染入横纹肌肉瘤细胞RD和A204细胞中,并应用MTS法、Transwell法研究发现,microRNA-133b可明显抑制RD和A204细胞的增殖与迁移;采用Western blot法检测转染后细胞内与增殖、迁移及细胞周期相关的蛋白表达,发现microRNA-133b能下调RD和A204细胞中的LIMand SH3 protein 1（LASP1）、c-MET、p-MET、p-AKT、p-ERK1/2、p-Rb的表达水平,并降低RD和A204细胞中细胞周期蛋白CDK4和CDK6表达量。该研究表明,microRNA-133b是通过下调LASP1、c-MET和p-MET的表达水平,影响c-MET下游信号分子p-AKT、p-ERK1/2的表达水平,同时还下调细胞周期相关蛋白如CDK4、CDK6、p-Rb等的表达,从而影响RD和A204细胞的增殖与迁移。     

血卟啉单甲醚对食管癌细胞 Eca-109 的光动力学杀伤效应

目的:探讨血卟啉单甲醚(HMME)介导的光动力疗法(PDT)对人食管癌细胞杀伤效应的最佳作用参数,为HMME-PDT的临床应用提供一定的参考依据。方法:以4μg·m L-1HMME与人食管癌Eca-109细胞孵育不同时间后,利用形态学软件分析其荧光强度;进一步予不同浓度(0.5μg·m L-1~8μg·m L-1)HMME与细胞孵育1.5小时后,在特定波长下以不同能量的激光(2、4、8 J·cm-2)照射,采用CCK8法检测细胞的存活率。结果:HMME在细胞内的荧光强度于给药1.5 h后达到高峰。在一定范围内,随着HMME浓度与激光剂量的增加,细胞存活率逐渐下降,当HMME浓度增高到4μg·m L-1时,光照强度增高到4 J·cm-2,进一步提高药物浓度与激光剂量,细胞存活率并不随之降低。结论:不同的孵育浓度、不同的孵育时间及不同的光照剂量密度可以显著的影响HMME-PDT对人食管癌Eca-109细胞的体外效应。     

营养组合物对再障大鼠干细胞增殖的影响

目的：观察营养组合物对再生障碍性贫血大鼠干细胞增殖的影响,探讨其治疗再障的可能机制。 方法：SD大鼠100只,随机分为正常对照组、再障模型组（AA）及不同剂量的营养组合物组。构建再障模型的同时,第5天开始,分别对大鼠给予高剂量营养组合物2 26695 mg/（kg·d）、中剂量高剂量营养组合物1 5113 mg/（kg·d）、低剂量高剂量营养组合物1 05791 mg/（kg·d）,每天灌胃,直至实验结束（60d）,采用颈椎脱臼法处死大鼠,采用免疫组化法检测再障大鼠的肝、肾、胃、肠、脑干细胞标志物的表达情况。 结果：大鼠肝脏、肾脏及胃的干细胞标志物的含量增加,且随着营养组合物剂量增加而增加;营养组合物处理再障大鼠后,大鼠肠粘膜、神经干细胞的标志物表达量在各组中无显著变化。 结论：营养组合物对再障大鼠肝脏、肾脏及胃的干细胞增殖具有一定的促进作用;而对再障大鼠肠粘膜、神经的干细胞增殖无显著影响。营养组合物一定程度上可以促进再障大鼠的干细胞增殖,此可能为其治疗再生障碍性贫血的作用机制之一。