差速贴壁法体外分离培养小型猪脂肪间质干细胞的实验研究

目的探讨差速贴壁法对小型猪脂肪间质干细胞(ADSC)提取和纯化的可行性。方法从两成软骨10月龄的中国实验用I系小型猪皮下脂肪组织获取ADSC,培养4~6 h倒置显微镜下观察,见少量细胞贴壁,立刻将含有未贴壁细胞的培养基接种到新培养瓶内继续培养,传统培养法不换培养瓶,以后均每3 d换液1次。完全培养基传至第3代MTT法绘制生长曲线,并测定两种培养法获得的细胞不同代数的贴壁时间;诱导培养基向脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞诱导并鉴定。贴壁时间、表面抗原阳性率、分化诱导染色阳性率实验数据比较采用单因素方差分析及t检验。结果采用差速贴壁培养法可分离培养出小型猪ADSC,并可除去部分贴壁的成纤维细胞、上皮细胞和脂滴,传代后培养瓶中脂滴明显减少;差速贴壁培养法获得的ADSC在贴壁时间方面较传统方法获得的ADSC短,前者传代后的贴壁时间(3.5±0.2)h较后者(5.8±0.3)h短,差异具有统计学意义(t=12.55,P=0.01);两种方法获得的ADSC中CD34阳性率:差速法为(1.17±0.01)﹪,传统法为(0.99±0.03)﹪;CD44阳性率:差速法为(88.90±0.03)﹪,传统法为(89.23±0.10)﹪;CD106阳性率:差速法为(1.18±0.05)﹪,传统法为(1.56±0.06)﹪;差异均统计学意义(t=0.12,1.23,0.37,P=0.06,0.07,0.06)。油红O、苏丹黑B、Von kossa、茜素红、阿尔新蓝、II型胶原染色结果表明差速贴壁法获得的ADSC可分化为脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞,且阳性染色率分别为(78±2)﹪、(82±6)﹪、(85±1)﹪、(83±3)﹪、(76±9)﹪、(74±1)﹪,较传统法的(68±1)﹪、(69±2)﹪、(73±0)﹪、(75±1)﹪、(69±3)﹪、(65±4)﹪高,差异具有统计学意义(t=5.21,12.56,16.27,10.33,17.01,23.97;P=0.02,0.03,0.01,0.01,0.00,0.00)。结论采用差速贴壁培养法可从小型猪皮下脂肪组织可以分离培养出ADSC,从细胞形态学、生物学特性及多向分化能力等方面都较传统法获得的ADSC具有优势。     

免疫磁珠分离淋巴细胞在流式交叉配型试验中的应用及研究

目的探讨免疫磁珠快速分离法及密度梯度离心(Ficoll)分离法分离外周血单个核细胞(PBMC)在流式细胞交叉配型中的应用比较。方法取10例交叉配型供体外周抗凝血各10 ml,受体非抗凝血5 ml,分别采用密度梯度离心与免疫磁珠阴性选择试剂盒从相同体积的抗凝血中分离PBMC。用血细胞计数比较两种方法分离的WBC、PLT、RBC粒度分布和PBMC中淋巴细胞的纯度;用细胞流式和淋巴细胞表面标记荧光抗体检测两种方法分离得到的PBMC中T、B和NK细胞的数量质量;将免疫磁珠阴性分离和密度梯度离心法分离的供者PBMC与受者血清共孵育,加入羊抗人IgG-FITC,洗涤后加入抗人CD3-PE、抗人CD19-APC单克隆抗体,再用流式细胞仪检测细胞表面荧光强度。采用方差分析和t检验进行统计学分析。结果免疫磁珠阴性分离的PBMC数量是Ficoll分离PBMC的0.42倍,但淋巴细胞的比例[(99.2±0.08)﹪]高于PBMC分离的淋巴细胞比例[(82.5±5.27)﹪(t=9.91,P0.01)],且两种方法分离的PBMC中RBC分别为(0.001±0.001)×10~6/μl和(0.02±0.009)×10~6/μl(t=6.64,P0.001);血小板的数量分别为(1.00±0.05)×10~3/μl和(196.00±4.21)×10~3/μl差异均有统计学意义(t=146.46,P0.01)。流式细胞检测免疫磁珠分离的PBMC中CD3~+T细胞为(81.33±4.60)﹪,CD19~+B细胞为(8.41±0.87)﹪,CD3-CD56~+NK细胞为(9.35±0.67)﹪和CD3~+CD56~+NKT细胞为(2.47±0.07)﹪。而Ficoll分离的PBMC中CD3~+T细胞为(37.36±3.27)﹪,CD19~+B细胞为(5.79±0.94)﹪,CD56~+NK细胞为(6.60±0.91)﹪,且差异均有统计学意义(t=24.64、6.470、7.70、51.31,P均0.01)。T和B淋巴细胞流式交叉配型试验中,设门定量读取T和B淋巴细胞与受者血清中抗体结合情况,密度梯度离心获得的淋巴细胞中混有血小板等,使流式检测结果中会混有假阴性,而免疫磁珠分离法没有出现假阴性结果。证明免疫磁珠分离的PBMC可应用于临床交叉配型试验。结论免疫磁珠阴性选择分离全血PBMC,用时短,纯度高,去除了99﹪的血小板,不混有红细胞、血小板,是一种优于Ficoll分离PBMC的新方法。     

人大隐静脉干细胞原代培养方法的改良

旨在探讨如何高效获取优质的人大隐静脉(Great saphenous vein)原代干细胞。大隐静脉剪碎后分别采用组织块贴壁法和Ⅱ型胶原酶消化法获取血管壁细胞。倒置显微镜下观察不同时间段两组血管壁细胞形态学变化,台盼蓝染色测定血管壁细胞存活率,流式分选CD34和CD117双阳性干细胞,免疫荧光进一步证实。细胞培养至第三代(P3)时组织块贴壁法提取的细胞出现纤维化老化,而酶消化法提取的细胞仍有集落样生长,细胞存活率分别为(91.7±1.2)%和(97.2±0.7)%(P=0.005)。流式分选结果显示:组织块法和酶消化法获得CD34和CD117双阳性细胞所占比例分别为(0.16±0.05)%和(0.44±0.07)%,差异有统计学意义(P=0.005)。免疫荧光染色显示,分选出的干细胞培养1周后组织块法获得双阳性干细胞的阳性率(89.41±2.06)%,酶消化法为(94.03±1.83)%,P0.05。流式细胞仪检测分选出的干细胞中CD31、VEGF2和SMA阳性率分别为(0.12±0.01)%、(0.19±0.02)%和(0.45±0.01)%,与阴性对照组差异无统计学意义(P0.05),排除成熟内皮细胞和平滑肌细胞存在的可能性。分选出的干细胞进行管腔形成实验进一步证实其具有向内皮分化的潜能。上述结果显示,采用酶消化法可以获得形态更好、数量更多、存活率相对更高的干细胞,可广泛用于临床和基础研究。     

人外分泌汗腺细胞分离方法的优化

目的:优化人外分泌汗腺细胞的分离方法,以高效地提取外分泌汗腺细胞。方法:新鲜的皮肤样本剪成组织微粒(大小约1 mm3),A组采用胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)和胶原酶Ⅱ型(2 mg/ml)体积分数1∶1混合的方法;B组采用传统消化方法,即胶原酶Ⅱ型;C组采用胰蛋白酶-EDTA消化的方法,三组同时置于恒温培养箱内,比较三种方法处理后汗腺细胞团的获取情况。将挑取的汗腺细胞团种于培养皿内,观察细胞贴壁和生长情况,并用流式细胞仪测定各组细胞的增殖指数,最后进行免疫细胞化学检测汗腺细胞标志性蛋白的表达。结果:A组和C组在消化30 min后,镜下可见少部分的汗腺细胞团,2 h后A组游离汗腺细胞团明显增多,C组游离汗腺细胞团很少;B组在消化6 h后,才出现部分游离的汗腺细胞团。将汗腺细胞团培养3 d后发现C组汗腺细胞贴壁情况差、成活细胞少;A组和B组的汗腺细胞贴壁情况良好,培养9 d后呈"铺路石样"生长,细胞增殖指数分别为(18±4)%和(17±6)%,无明显差异,免疫细胞化学结果表明:两组细胞癌胚抗原(CEA)和细胞角蛋白7(CK7)表达均为阳性。结论:胰蛋白酶-EDTA和Ⅱ型胶原酶联合消化法能明显缩短汗腺细胞的分离时间,且不影响细胞的活性和增殖特性。     

人脐带和骨髓间充质干细胞体外分离培养及生物学特性比较

目的体外分离培养、扩增人脐带间充质干细胞(h UC-MSC)和人骨髓间充质干细胞(h BM-MSC),并对其生物学特性进行比较。方法采用组织块贴壁法从足月胎儿脐带分离、纯化和培养h UC-MSC,健康成人骨髓肝素抗凝后,采用密度梯度离心法分离、纯化和培养h BM-MSC;用倒置显微镜观察两种细胞的形态及细胞生长增殖情况,流式细胞仪分析检测第3代细胞表面标志的表达,Von?Kossa染色及油红O染色检测分化潜能。结果镜下两种细胞均为贴壁生长,形态为均一的成纤维细胞样,取相同数量的细胞传代接种后,h UC-MSC的增殖速率快于h BM-MSC,两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29、CD44、CD105,不表达CD45、CD34、HLA-DR、HLA-G、CD80、CD86,两种细胞都有成骨、成脂分化潜能,但h UC-MSC的分化潜能更强。结论 h UC-MSC与h BM-MSC具有相似的生物学特性,且前者具有更强的增殖能力和分化潜能,h UC-MSC有望成为h BMMSC理想的替代来源。     

一种同时分离培养大鼠肝细胞及肝枯否细胞技术的建立

目的:建立简便、经济的同步分离培养肝细胞及kupffer细胞的方法.方法:采用肝脏原位灌洗结合离体胶原酶灌注消化的方法获得总细胞悬液,差速离心分离肝细胞及肝非实质细胞,经多次低速离心可分离肝细胞,经percoll密度梯度离心以及选择性贴壁法得到纯化的kupffer细胞.台盼蓝染色鉴定细胞活力.使用倒置相差显微镜、HE染色、PAS染色及白蛋白免疫组织化学染色对培养肝细胞的形态及功能进行检测.使用光学显微镜、荧光显微镜及CD68免疫荧光染色鉴定分离的kupffer细胞.结果:体外成功的同步分离培养了肝细胞及kupffer细胞,肝细胞产率为1.37± 0.53× 108/大鼠,kupffer得率为3.45± 0.41×106/g肝脏.细胞存活率及纯度都可达90％.肝细胞培养24h后呈典型肝细胞形态,7天后仍具有糖原合成和白蛋白合成能力.贴壁后的kupffer细胞呈典型的星型或三角形,且其标志分子CD68免疫荧光染色阳性.结论:应用改良的原位灌注方法可以很好的同时分离具有活性及功能的肝细胞和kupffer细胞.     

毛囊干细胞体外诱导成血管内皮细胞的实验研究

目的建立简单、可靠的毛囊干细胞体外定向分化为血管内皮细胞的方法。方法无菌条件下切取1周龄SD大鼠触须部皮肤,Dispase酶和Ⅳ型胶原酶混合液消化,显微镜下分离毛囊隆突部,改良的组织块贴壁法培养rHFSCs,差速贴壁法纯化,流式细胞仪检测及细胞免疫荧光染色联合鉴定。用含10 ng/ml和20 ng/ml VEGF165作为主要诱导因子将细胞分为两种浓度组别,不传代的情况下分别在1、2、3周内观察诱导后细胞形态;通过流式细胞和细胞免疫荧光染色检测分化效率;选取最佳诱导因子浓度和工作时间,对诱导后的细胞进行体外官腔形成实验,并在透射电镜下观察W-P小体。流式细胞术检测分化效率实验数据的比较采用单因素方差分析及独立t检验。结果分离、培养、纯化的rHFSCs克隆能力好,活力强,生长曲线呈S型。流式细胞及免疫荧光染色联合检测β1(98.9%)、α6整合素(97.9%),CK15(68.1%)、P63(98.5%)呈高表达,阴性表达CD31(13.6%)、VE-cadherin(17.9%)。在诱导液的作用下,两组细胞从1周到3周后,均由扁平铺路石样改变到完全被长梭形样细胞占据。流式细胞及免疫荧光染色检测CD31和VE-cadherin显示,CD31在诱导1周时表达最强,两种诱导因子比较无差异[(65.27±0.57%)vs(66.13±0.60)%,t=1.812,P=0.145]。而VE-cadherin在诱导1周时表达也最强,10ng/ml要优于20ng/ml VEGF165的诱导作用[(95.57±0.85)%vs(78.10±1.25)%,t=19.977,P=0.001]。10 ng/ml VEGF165诱导1周后的细胞体外管腔形成实验阳性,在透射电镜下可以观察到内皮细胞特有结构W-P小体。结论毛囊干细胞体外在10ng/ml VEGF165的诱导下,1周后可成功得到性能良好的血管内皮细胞。可为组织工程血管、细胞移植治疗缺血性疾病等提供理想的种子细胞。     

豚鼠肾小管上皮原代细胞的培养

目的建立一种简便易行的豚鼠原代肾小管上皮细胞培养方法。方法运用筛网分离法和多种酶消化法获取高纯度的肾小管上皮细胞。利用免疫组化法和形态学观察法鉴定培养的肾小管上皮细胞性质及纯度。结果通过肾小管节段贴壁,胶原酶消化组织节段和细胞等方法,有效地促进肾小管原代细胞增殖;胰酶节段消化法的细胞贴壁效果稍差,细胞传代状态不理想;胰酶消化法则细胞贴壁较少,细胞生长状态较差。结论培养豚鼠原代。肾小管上皮细胞是可行的。     

三阴性乳腺癌干细胞的富集及CD44+CD24-/low、CXCR4表达测定

目的:探讨MDA-MB-231细胞经无血清培养富集三阴性乳腺癌干细胞,观察再成球、集落形成及CD44+CD24-/low、CXCR4表达。方法:将MDA-MB-231乳腺癌细胞进行微球体培养,取培养第7-9天的微球体,判断干细胞富集的程度;比较不同细胞浓度对癌球细胞成球率影响;流式细胞仪测定CD44+CD24-/low含量;Western blot法分析CXCR4蛋白表达;单个癌球细胞再成球能力;观察癌球与贴壁细胞集落形成。结果:1).在含20 ng/m L EGF,10 ng/m L b FGF,2%b27无血清培养基中可培养三阴性乳腺癌癌球,1×104/m L、2×104/m L、3×104/m L、4×104/m L、5×104/m L细胞浓度癌球细胞成球率分别为(5.61±0.02)%、(3.23±0.54)%、(2.28±0.48)%、(1.05±0.13)%、(0.91±0.01)%,组间比较差异有统计学意义P值均0.05。2).贴壁MDA-MB-231细胞与癌球细胞CD44+CD24-/low含量分别为(38.54±2.00)%VS(66.35±2.06)%,差异有统计学意义P=0.003。3).癌球细胞CXCR4蛋白表达高于贴壁MDA-MB-231细胞,灰度扫描分析差异有统计学意义,P=0.03。4).单个癌球细胞具有再成球能力。5).软琼脂糖集落形成能力癌球需200个细胞即可见集落形成,而贴壁细胞需1 000个MDA-MB-231细胞。结论:1.通过无血清培养可以富集三阴性乳腺癌干细胞,低细胞密度有利于癌球形成。2.癌球中CD44+CD24-/low含量高于贴壁MDA-MB-231细胞。3.CXCR4在癌球中表达高于贴壁MDA-MB-231细胞。     

重组人MG53蛋白对人脐带间充质干细胞氧化损伤的保护作用

目的建立人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)的H_2O_2氧化损伤模型,探讨重组人MG53蛋白(rh MG53)对h UC-MSCs氧化损伤的保护作用。方法使用组织块培养法从健康人脐带沃顿胶组织中分离培养h UC-MSCs,流式细胞仪检测细胞表型;CCK-8法检测h UC-MSCs的增殖和H_2O_2损伤程度。实验分为正常对照组(NC组)、rh MG53组、H_2O_2组和H_2O_2+rh MG53组。分别采用CCK-8法、Transwell小室、流式细胞术和β-半乳糖苷酶染色检测rh MG53蛋白对h UC-MSCs增殖、迁移、周期凋亡和衰老的影响。各组、各个时间点的吸光值采用析因设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析。结果 h UC-MSCs贴壁呈梭型生长,高表达间充质干细胞标志CD44、CD133、HLA-ABC,低表达CD34、CD45;H_2O_2对h UC-MSCs具有浓度和时间依赖性的损伤作用,确定200μmol/L的H_2O_2处理16 h为h UC-MSCs氧化损伤的最适条件。与NC组相比,H_2O_2组细胞增殖(0.994±0.011 vs 1.331±0.014)、迁移率(8.15﹪±2.47﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)和S期细胞比例(29.67﹪±3.69﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)显著降低,细胞衰老(44.07﹪±5.26﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(52.63﹪±5.76﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著增加,差异具有统计学意义(均P0.05);rh MG53组细胞增殖(1.509±0.086 vs 1.331±0.014)和迁移率(52.13﹪±5.46﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)显著提高,S期比例(35.27﹪±4.79﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)变化差异无统计学意义(P0.05),细胞衰老(3.92﹪±1.31﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(3.96﹪±1.06﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。与H_2O_2组相比,H_2O_2+rhMG53组细胞增殖(1.252±0.056 vs 0.994±0.011)、迁移率(18.93﹪±3.12﹪vs8.15﹪±2.47﹪)和S期比例(34.84﹪±3.45﹪vs 29.67﹪±3.69﹪)显著提高,细胞衰老(17.89﹪±2.64﹪vs 44.07﹪±5.26﹪)和凋亡比例(4.65﹪±1.23﹪vs 17.63﹪±2.56﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。结论 rhMG53对H_2O_2造成的h UC-MSCs氧化损伤有保护作用。     

恒河猴静脉内皮细胞培养的研究

利用胶原酶对恒河猴血管内皮细胞进行消化,以9.92±3.34×10~3个细胞/cm~2的接种率接种于35mm培养皿中原代培养,体外培养7.7±1.82天,细胞增长了7.39±5.04倍,以1:6及1:2比例分别传第一代、第二代共历时13.89±1.36天细胞增长了147.93±88.68倍。对原代及传代细胞进行染色体及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检查,证实所培养的细胞为内皮细胞。通过检测培养上清中vWF和PGF1α的含量,原代、第一代与第二代之间均无明显差异(P>0.05)。     

不同细胞密度冻存对奶牛乳腺上皮细胞的影响

本试验采用了内蒙古呼和浩特健康荷斯坦奶牛乳腺组织经5代纯化后,将奶牛乳腺上皮细胞分别设为1组(1×10~4个细胞/ml)、2组(1×10~5个细胞/ml)、3组(1×10~6个细胞/ml)、4组(1×10~7个细胞/ml)4个密度梯度进行冻存,复苏后检测细胞死亡率、贴壁率、凋亡率并进行形态学观察。结果显示4组复苏后死亡率极显著低于其他三组(P0.01),贴壁率显著高于其他三组(P0.05)。3组细胞凋亡率显著低于其他三组(P0.05)。3、4组细胞到第3d基本铺满瓶底,生长状态良好。     

胎盘间充质干细胞的体外培养及其生物学特性研究

目的：探讨胎盘间充质干细胞（PMSCs）的体外分离和培养方法,建立稳定的PMSCs体外培养扩增体系。方法：将胎盘组织经胶原酶消化、密度梯度离心、贴壁筛选法分离,获得并培养人PMSCs,观察细胞形态及其超微结构;应用流式细胞术测定细胞周期及CD14、CD29、CD34、CD44、CD45的表达,研究其增殖和生长特性。结果：在体外培养条件下,人PMSCs贴壁生长,为成纤维细胞样,与骨髓间充质干细胞相似;CD14/CD34/CD45阴性,CD29/CD44阳性,核浆比大,细胞周期检测G0/G1期约占95%,具有原始细胞的特征。结论：体外获得的PMSCs形态单一、生长稳定、增殖能力较强,具有与骨髓间充质干细胞相似的细胞形态、表面标志。由于其来源方便、丰富,无伦理学限制,因此可进一步用于细胞治疗的研究。     

树鼩原代皮肤成纤维细胞的分离培养技术

建立稳定的树鼩(Tupaiabelangeri)皮肤成纤维细胞的体外培养体系,可为有关此类细胞的实验和疾病树鼩细胞模型提供技术支持。取树鼩大腿内侧皮肤用组织块贴壁法和胶原酶Ⅰ消化法分离皮肤细胞,胰蛋白酶差别消化法纯化细胞;用MEM(10%FBS)完全培养基和含低血清生长添加物(LSGS)的培养基培养细胞;免疫荧光和蛋白印迹法鉴定细胞,并测定细胞的生长、冻存和复苏特性。经树鼩皮肤细胞分离效果比较,胶原酶消化法比组织块贴壁法更适合用于树鼩原代皮肤细胞分离;对分离及冻存复苏后细胞生长状况观察比较发现,添加了LSGS的MEM培养基更利于细胞存活、生长;细胞形态观察、免疫荧光和蛋白印迹检测鉴定所分离的细胞为树鼩皮肤成纤维细胞。成功建立了树鼩原代皮肤细胞的分离、纯化方法,并优化了该细胞的培养条件。     

口腔鳞状细胞癌患者外周血Naa10及淋巴细胞免疫分型的特点及临床意义

目的探讨口腔鳞状细胞癌（OSCC）患者外周血N-α-乙酰基转移酶10 （Naa10）及淋巴细胞免疫分型的特点,并分析其临床意义。 方法选取97例OSCC患者及50名健康体检者,分别纳入患者组、对照组。检测两组受试者外周血Naa10、淋巴细胞免疫分型,并比较不同TNM分期、不同淋巴结转移状态患者外周血Naa10、淋巴细胞免疫分型的差异,总结其特点与临床意义。不同性别人数采用χ²检验,计量资料行正态性检验,满足正态性且组间方差相等则采用t检验,不满足正态性则采用非参数Wilcoxon秩和检验,相关性分析采用Pearson法。 结果患者组血清Naa10为（62.91±17.15）pg/ml,高于对照组的（38.82±9.04）pg/ml,差异有统计学意义（t?= 9.280,P?< 0.05）。患者组CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、NK细胞百分比分别为（71.63±9.11）﹪、（34.34±4.26）﹪、（1.03±0.28）、（14.23±4.61）﹪,低于对照组的（76.25±2.87）﹪、（45.41±7.08）﹪、（1.77± 0.39）、（19.96±5.13）﹪,CD8⁺、B淋巴细胞百分比分别为（14.23±4.61）﹪、（14.91±3.29）﹪,高于后者的（19.96±5.13）﹪、（9.11±2.60）﹪,差异有统计学意义（P?< 0.05）。TNM分期Ⅰ~Ⅱ期患者42例,其血清Naa10为（64.08±15.26）?pg/?ml,与Ⅲ~Ⅳ期患者的（61.71±13.15）pg/ml比较,差异无统计学意义（t?= 0.820,P?> 0.05）。淋巴结转移者34例,其血清Naa10为（65.15±14.07）pg/ml,与无淋巴结转移者的（61.45±12.66）?pg/?ml比较,差异无统计学意义（t?= 1.321,P?> 0.05）。Ⅰ~Ⅱ期患者CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/CD8⁺、NK细胞百分比低于Ⅲ~Ⅳ期患者,其CD8⁺、B淋巴细胞百分比高于后者,差异有统计学意义（P?< 0.05）。Pearson相关性分析示,外周血Naa10与CD3⁺ （-0.631）、CD4⁺ （-0.529）、CD4⁺/CD8⁺ （-0.587）、NK细胞百分比（-0.603）呈负相关,与CD8⁺ （0.558）、B淋巴细胞百分比（0.670）呈正相关（P?< 0.05）。 结论OSCC患者外周血Naa10明显升高但与TNM分期、淋巴结转移无关;其淋巴细胞免疫分型存在明显改变,且TNM分期的上升、淋巴结转移的发生伴随着CD3⁺、CD4⁺、CD4⁺/?CD8⁺、NK细胞百分比的下降,以及CD8⁺、B淋巴细胞百分比的上升。     

前列腺基质细胞的原代培养方法

目的:建立一种操作简单、成功率高、重复性好的前列腺增生组织原代基质细胞(PSC)培养方法。方法:采用胶原酶消化法、组织块贴壁法和胰酶消化组织块贴壁法,从70岁及以上男性的良性前列腺增生组织中分离培养PSC,通过显微镜观察比较PSC的数量、形态、培养周期,用免疫荧光染色法鉴定PSC的纯度。结果:胶原酶消化法得到的贴壁细胞少,细胞体积较小且形态无法铺展,增殖能力较弱;组织块贴壁法培养72h后细胞会从组织边缘缓慢爬出,生长周期长;胰酶消化组织块贴壁法,细胞培养7d后基本融合,折光性强,细胞多呈长梭形,通过免疫荧光染色鉴定,基质细胞纯度在95%以上。结论:利用胰酶消化组织块贴壁法建立了一种易行、高效且重复性好的前列腺增生组织基质细胞培养方法。     

人间充质干细胞对乳腺癌细胞生长的影响研究

目的通过构建间充质干细胞(MSC)与乳腺癌细胞间相互作用的共培养模型,探讨MSC对乳腺癌细胞生长的影响。方法用含荧光基因第三代自身失活慢病毒载体感染人类脐带分离提取的MSC和乳腺癌细胞MDA-MB-231、MCF-7,以单独培养的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7分别设立对照,2种乳腺癌细胞分别与MSC共培养,检测乳腺癌细胞在MSC作用下增生能力的改变,流式细胞术检测共培养后细胞表面标记物表达。两组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析,多重比较采用Dunnet-t检验。结果MSC在与乳腺癌细胞共培养过程中促进肿瘤细胞生长,第3天共培养组乳腺癌MDA-MB-231细胞数高于单独MDA-MB-231培养组[(5.50±0.71)×10^3个比(1.63±0.41)×10^3个],培养至第7天,两组间MDA-MB-231细胞数差异进一步增大[(81.25±7.40)×10^3个比(26.25±4.15)×10^3个],差异具有统计学意义(P均<0.001);共培养后MSC促进乳腺癌细胞表达干细胞特有标记物CD90,MCF-7从共培养第2天CD90表达率(1.38±0.30)﹪升高至第9天(92.45±2.04)﹪。在共培养中MSC围绕肿瘤细胞集落方式生长,在形态上变长,并发现一种新型混合细胞(hybrid融合细胞)同时表达绿色和红色荧光,且对化疗药物更敏感。结论MSC促进乳腺癌细胞的生长,伴随MSC形态学改变和hybrid融合细胞出现,乳腺癌细胞获得MSC特有CD90表达。     

脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34~+细胞的扩增效果研究

目的研究脐带间充质干细胞联合UM171对脐血来源CD34~+细胞的扩增效果。方法脐血来源CD34~+细胞及脐带来源间充质干细胞分为以下4组进行体外扩增培养10 d:对照组、UM171培养组、间充质干细胞共培养组、UM171联合间充质干细胞共培养组,采用方差分析比较不同组别间细胞扩增倍数及流式表型和集落培养情况。结果脐带间充质干细胞CD105,CD73,CD90,不表达CD14,CD34,CD19,CD45,HLA-DR,经过诱导可以向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化。CD34~+细胞在不同条件下体外培养10 d后,UM171培养组总有核细胞数扩增14倍,CD34~+细胞扩增13.5倍;MSCs共培养组总有核细胞数扩增11倍,CD34~+细胞扩增10倍;联合培养组总有核细胞数扩增达22倍,CD34~+细胞扩增21倍。联合培养组扩增后细胞CD34~+CD38~-比例达(91.49±2.67)﹪,较间充质干细胞培养组(78.11±2.35)﹪及UM171培养组(91.49±2.68)﹪相比差异具有统计学意义(P均0.01)。扩增后细胞集落培养14 d后,各系集落形成良好,UM171扩增组细胞较MSCs扩增组在红系及粒系形成能力方面存在优势。结论脐带血间充质干细胞作为细胞滋养层可提高CD34~+细胞体外扩增效果,UM171在扩增过程中可较好的保持细胞干性,二者联合应用扩增效果最佳,建立的脐带间充质干细胞联合UM171对脐血源CD34~+细胞的扩增方法可用于CD34~+细胞体外扩增培养。     

犊牛肝细胞的分离与原代培养

以初生犊牛作肝细胞供者,采用稍加改良的两步胶原酶灌流法和一步灌流结合组织块消化法分离获取肝细胞,并进行原代培养;以台盼蓝染色法测细胞活力,在倒置显微镜下观察肝细胞形态变化,采用Beckman全自动生化分析仪检测较好培养体系不同时间培养上清液中白蛋白、乳酸脱氢酶(LDH)、尿素的含量。结果显示,相比较于一步灌流结合组织块消化法,胶原酶消化法所获取的肝细胞形态完整、贴壁良好、活性高、功能强;LDH漏出量、白蛋白分泌及尿素合成等指标在1周内呈现规律性变化,第3和第4天时LDH漏出量最低,白蛋白分泌及尿素合成功能正常,表明所分离的肝细胞在培养第3￣4天功能最佳。     

TGF-b1对骨髓间充质干细胞迁移力及 Snail表达的影响

采用密度梯度离心结合贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSCs),用免疫荧光法对培养第3代的细胞进行鉴定.用改良的Transwell小室及MTT法检测不同浓度TGF- b1对细胞迁移力及细胞增殖的影响;流式细胞仪检测细胞凋亡;RT-PCR检测TGF-b1作用不同时间细胞snail、基质金属蛋白酶2(MMP-2)mRNA表达;免疫荧光和Western印迹检测snail表达情况.结果表明密度梯度离心结合贴壁法能有效分离、纯化大鼠BMMSCs,免疫荧光检测显示培养的细胞CD29、CD44表达阳性,而CD34、CD45表达阴性;外源性TGF-b1对BMMSCs迁移力的促进作用具有剂量依赖性,在2 ng/ml时达到最高.高浓度却抑制BMMSCs的迁移.在2 ng/ml TGF-b1刺激下,细胞凋亡明显降低,snail、MMP-2 mRNA及snail表达明显增高,但对细胞增殖无明显影响.通过研究TGF-b1对BMMSCs的迁移力的影响及作用机制,为体外调控BMMSCs高效迁移入脑从而发挥其修复神经损伤作用提供实验依据和理论基础.