lncRNA MAGI2-AS3下调miR-31-5p抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭并促进凋亡

目的研究lncRNA MAGI2-AS3对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响和潜在的分子机制。方法根据转染载体不同将A549细胞分为pcDNA3.1组(转染pcDNA3.1)、pcDNA3.1-MAGI2-AS3组(转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、anti-miR-31-5p组(转染anti-miR-31-5p)、pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组(共转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3和miR-NC)、pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-31-5p组(共转染pcDNA3.1-MAGI2-AS3和miR-31-5p mimics)。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-31-5p和MAGI2-AS3 RNA的表达,四氮唑蓝(MTT)法测定A549细胞增殖活性,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力,双荧光素酶报告系统验证MAGI2-AS3与miR-31-5p的调控关系,流式细胞术检测细胞凋亡与周期。两组间比较采用独立样本t检验进行分析;多组间比较采用单因素方差分析,组内多重比较采用SNK-q检验。结果与人正常肺细胞HBE相比,肺癌细胞A549中的MAGI2-AS3表达量(0.48±0.03比1.29±0.06)降低,miR-31-5p表达量(1.01±0.05比0.25±0.02)升高;与pcDNA3.1组比较,pcDNA3.1-MAGI2-AS3组A549细胞活力(0.48±0.04比0.77±0.06)、迁移[(81.33±2.87)个比(124.33±3.09)个]和侵袭[(32.00±2.83)个比(53.00±3.27)个]细胞数、S期细胞所占比例(23.01﹪±1.00﹪比32.95﹪±1.06﹪)均降低,凋亡率(19.95﹪±1.25﹪比7.23﹪±0.51﹪)、G0-G1期细胞所占比例(43.58﹪±2.15﹪比33.56﹪±1.23﹪)均升高;与anti-miR-NC组比较,anti-miR-31-5p组A549细胞活力(0.53±0.04比0.78±0.06)、迁移[(76.00±3.74)个比(108.33±2.87)个]和侵袭[(30.00±1.63)个比(42.33±2.05)个]细胞数、S期细胞所占比例(24.43﹪±1.13﹪比32.91﹪±1.08﹪)降低,凋亡率(18.21﹪±1.24﹪比7.29﹪±0.51﹪)、G0-G1期细胞所占比例(41.56﹪±2.19﹪比33.53﹪±1.27﹪)升高,差异有统计学意义(P均<0.05);双荧光素酶报告系统结果显示,MAGI2-AS3靶向负调控miR-31-5p的表达。与pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-NC组比较,pcDNA3.1-MAGI2-AS3+miR-31-5p组A549细胞活力(0.68±0.06比0.50±0.04)、迁移[(91.00±1.63)个比(52.67±2.62)个]和侵袭[(62.67±2.49)个比(31.67±4.03个)]细胞数升高,凋亡率(10.59﹪±1.0﹪比21.11﹪±1.14﹪)降低,差异有统计学意义(P均<0.05)。结论lncRNA MAGI2-AS3通过靶向miR-31-5p抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞凋亡。lncRNA MAGI2-AS3是肺癌潜在分子治疗靶点。     

基质交联分子1表达下调对人胰腺癌SW1990细胞周期及细胞凋亡的影响

目的探讨基质交联分子1(STIM1)表达下调对人胰腺癌细胞株SW1990细胞周期和细胞凋亡的影响,并研究其分子作用机制。方法构建携带STIM1基因si RNA的慢病毒载体转染SW1990细胞,分为对照组、空载体组和STIM1组。采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot验证STIM1组SW1990细胞STIM1表达下调。通过MTT增殖实验和流式细胞术检测STIM1表达下调对细胞增殖、周期和细胞凋亡的影响,采用RT-PCR和Western blot法检测细胞周期和细胞凋亡相关分子表达的变化。两组间比较采用t检验。结果STIM1组SW1990细胞中STIM1表达mRNA(0.261±0.029)、蛋白(0.120±0.032)低于空载体组mRNA(1.002±0.091)、蛋白(0.996±0.053),t=20.74、26.89,P均0.01。SW1990细胞24、48、72 h的增殖水平STIM1组分别为(0.122±0.008)、(0.252±0.031)、(0.373±0.028),相比空载体组(0.223±0.035)、(0.618±0.017)、(0.924±0.140),t=6.48、16.90、23.99,P0.01,受到抑制。STIM1组中SW1990细胞G2/M期细胞比例(41.47±0.66)﹪高于空载体组(10.30±2.24)﹪,t=23.14,P0.01。STIM1组中SW1990细胞凋亡率(25.21±1.96)﹪高于空载体组(3.71±1.23)﹪,t=16.03,P0.01。半定量RT-PCR和Western blot提示,STIM1组细胞周期蛋白B1(cyclin B1)表达mRNA(0.344±0.031)、蛋白(0.776±0.042)相比空载体组mRNA(1.011±0.060)、蛋白(1.034±0.036),t=40.06、8.51,P均0.01下调;STIM1组p21表达mRNA(1.970±0.107)、蛋白(1.315±0.093)相比空载体组mRNA(1.025±0.044)、蛋白(0.998±0.036),t=17.10、9.52,P均0.01上调;STIM1组Bcl-2表达mRNA(0.156±0.025)、蛋白(0.381±0.028)相比空载体组mRNA(1.010±0.072)、蛋白(0.980±0.057),t=15.46、14.63,P均0.01下调;STIM1组survivin表达mRNA(0.188±0.022)、蛋白(0.022±0.019)相比空载体组mRNA(1.016±0.090)、蛋白(0.994±0.047)t=58.08、442.58,P均0.01下调;STMI1组procaspase-3表达蛋白(0.389±0.030)相比空载体组蛋白(1.008±0.040)下调,差异有统计学意义(t=19.22,P0.01)。结论在胰腺癌SW1990细胞中,沉默STM1可阻滞细胞于G2/M期,抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,有望成为胰腺癌治疗的分子靶点。     

ADAR1 shRNA对人胶质瘤U87细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究ADAR1 shRNA对人胶质瘤细胞U87细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过构建ADAR1-shRNA的干扰质粒,经脂质体法转染胶质瘤U87细胞系,通过荧光倒置显微镜观察转染效率,选择转染效率最高的细胞系。取转染48h细胞,采用RT-PCR和Western-blot分别检测ADAR1 mRNA及蛋白的表达,流式细胞仪检测其细胞凋亡率,MTT法检测细胞增殖情况。结果:①经ADAR1-shRNA转染48h后的转染效率最高,此时U87细胞系中ADAR1 mRNA及蛋白的表达均被显著抑制,较阴性对照组及空白组均明显降低(P0.05)。②在转染ADAR1-shRNA后,细胞凋亡率为(28.14%±3.76%),明显高于阴性对照组(3.20%±1.57%)和空白组(2.80%±1.49%),细胞增殖率较阴性对照组及空白组明显下降(P0.05)。结论:通过shRNA抑制ADAR1的表达能明显促进人胶质瘤细胞U87细胞的凋亡和抑制其增殖,ADAR1基因可能成为治疗治疗胶质瘤的新靶点。     

抑制营养缺乏自噬因子1表达对肝癌LM3细胞增殖的影响

目的探讨以透明质酸-聚乙烯亚胺/透明质酸-聚乙二醇(HA-PEI/HA-PEG)作为基因载体传递NAF1-siRNA对人肝细胞LM3进行增殖能力抑制的效果。方法将纳米复合物HA-PEI/HA-PEG与NAF1-siRNA复合,转染LM3细胞建立HNS组,等量NAF1-siRNA转染建立NSI组,另设未转染对照对照组,等量HA-PEI/HA-PEG干预细胞建立HAH组。采用荧光实时定量PCR检测细胞NAF1 mRNA的表达水平,采用Western blotting法检测NAF1、cyclin D1蛋白表达。采用MTT实验和平板克隆形成实验检测细胞增殖抑制效果。4组比较采用单因素方差分析,两两比较采用t检验。结果以对照组NAF1 mRNA的相对表达量为100﹪进行检测。HNS组NAF1 mRNA的相对表达量为(2.12±0.17)﹪,与对照组相比,差异具有统计学意义(t=14.17,P=0.04)。HNS组LM3细胞的NAF1蛋白和Cyclin D1蛋白的相对表达量分别为0.07±0.01、0.06±0.00,而对应蛋白在对照组LM3细胞中的相对表达量分别为0.37±0.08、0.16±0.03,差异具有统计学意义(t=37.72,20.96,P=0.01,0.03)。HNS组细胞测得的细胞增殖抑制率为(73.20±0.43)﹪,与对照组的(0.49±0.02)﹪相比差异具有统计学意义(t=11.92,P=0.01)。HNS组LM3细胞的平板克隆形成率(8.35±0.33)﹪明显低于对照组的(23.61±0.10)﹪(t=17.75,P=0.00,0.02)。结论纳米复合物HA-PEI/HA-PEG可高效递送NAF1-si RNA,对肝癌LM3细胞进行转染,抑制NAF1表达,进而通过降低Cyclin D1表达水平抑制肝癌细胞LM3的增殖。     

慢病毒介导的c-Myc启动子结合蛋白1过表达对结肠癌HCT116细胞增殖与凋亡的影响及其机制研究

目的探讨慢病毒介导的c-Myc启动子结合蛋白1(MBP-1)过表达对结肠癌HCT116细胞增殖和凋亡的影响及其机制。方法将体外培养的HCT116细胞分为以下3组:空白对照组,细胞未做任何处理;空载感染组,空载体对照慢病毒(LV-GFP)感染HCT116细胞;MBP-1过表达慢病毒组(MBP-1组),MBP-1过表达的重组慢病毒(LV-MBP-1-GFP)感染HCT116细胞。RT-PCR检测各组细胞中MBP-1 mRNA的表达,CCK-8实验检测细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞的周期变化,Western blot检测细胞中MBP-1、NF-κB p65、c-Myc、CyclinD1及细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表达。三组间比较采用单因素方差分析,方差齐性采用F检验,若方差齐则组间比较采用LSD检验,若方差不齐则组间比较采用Dunnett检验。结果与空载感染组比较,MBP-1组在MBP-1 mRNA(1.02±0.15比4.56±1.03)、蛋白表达水平(0.18±0.01比0.72±0.10)、S期百分比[(39.12±2.18)﹪比(45.64±3.21)﹪]、G2/M期的百分比[(14.81±1.02)﹪比(23.16±2.12)﹪]、细胞中Bax蛋白(0.55±0.10比0.76±0.11)、cleaved caspase-3蛋白(0.45±0.08比0.81±0.11)表达水平均升高,差异具有统计学意义(P均<0.001),而细胞48 h OD值(0.58±0.08比0.43±0.03)、72 h OD值(1.10±0.13比0.52±0.09)、细胞G0/G1期的百分比[(46.06±1.89)﹪比(31.36±2.02)﹪]、细胞中Bcl-2蛋白(0.52±0.10比0.23±0.02)、NF-κB p65蛋白(0.61±0.13比0.16±0.03)、c-Myc蛋白(0.79±0.15比0.43±0.05)、CyclinD1蛋白(0.62±0.09比0.32±0.01)的表达水平均降低,差异具有统计学意义(P均<0.001);空白对照组和空载感染组之间各指标差异无统计学意义(P>0.05)。结论MBP-1过表达可抑制HCT116细胞增殖及诱导细胞周期阻滞于S期,其作用机制可能与抑制NF-κB信号通路活化有关。     

SHP-2激活突变促进小鼠MEFs细胞粘附迁移及增殖能力

目的探讨SHP-2D61G/＋和SHP-2D61G/D61G激活突变对小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）粘附迁移及增殖能力的影响,并研究其发生的机制。方法雌雄小鼠合笼交配建立SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变的小鼠MEFs细胞,并以SV40T抗原进行永生化;细胞粘附实验检测SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变对MEFs细胞粘附能力的影响;Transwell体外迁移实验检测SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变对MEFs细胞的迁移能力的影响;MTT法检测SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变对MEFs细胞增殖能力的影响;Western Blot法检测p-ERK的表达水平。结果 （1）与对照组相比,SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变组小鼠MEFs细胞粘附的细胞数明显增多,差异具有统计学意义;（2）与对照组相比SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变组MEFs细胞迁移的细胞数增加,差异具有统计学意义;（3）MTT结果显示,SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变的小鼠MEFs细胞增殖能力较对照组强,差异具有统计学意义;（4）Western Blot结果显示与对照组相比,无论是刚刚贴壁还是贴壁后30 min和60 min SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变组其p-ERK的表达水平都增加。结论 SHP-2D61G/＋、SHP-2D61G/D61G激活突变促进小鼠MEFs细胞粘附迁移及增殖能力,其发生机制主要与p-ERK的表达水平增加有关。     

NDRG1基因过表达对胆囊癌GBS-SD细胞增殖及凋亡的影响

为了探讨N-myc下游调节基因1 (NDRG1)过表达对胆囊癌细胞系GBS-SD细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其可能的分子机制,本研究采用脂质体介导的重组真核表达质粒pEGFP-NDRG1-N3瞬时转染人胆囊癌GBS-SD细胞,Western blotting检测NDRG1蛋白的表达;MTT比色法和流式细胞术分别检测细胞增殖和细胞周期;Transwell实验检测细胞侵袭和迁移能力。GBS-SD细胞转染pEGFP-NDRG1-N3重组质粒后经表阿霉素(0.4μg/mL)诱导其凋亡,采用Hoechst 33258染色和流式细胞仪检测细胞凋亡;Western blotingt检测Bcl-2、Cleaved caspase-3和Bid蛋白的表达。MTT检测显示,NDRG1过表达组细胞在48 h和72 h的增殖速度均显著高于空载组和对照组(p0.05)。Transwell检测显示,与对照组和空载组相比,NDRG1过表达组细胞的侵袭和迁移能力明显增强。Hoechst 33258染色和流式细胞仪检测显示,经表阿霉素诱导细胞凋亡后,空载组细胞的凋亡率最高,NDRG1过表达组细胞的凋亡率低于空载组,但显著高于对照组。Western blotting检测显示,与对照组和空载组相比,NDRG1过表达组细胞中Bcl-2的表达明显上调,而Cleaved caspase-3和Bid的表达明显下调。本研究表明NDRG1基因过表达可显著促进胆囊癌细胞增殖、迁移、侵袭并抑制其凋亡,其分子机制可能是上调的NDRG1基因能有效调节与细胞凋亡相关基因的表达,从而发挥其介导作用。因此,NDRG1基因可能成为胆囊癌研究中一个新的治疗靶点。     

CircRALB对宫颈癌细胞株Hela细胞生物学行为影响的研究

探讨circRALB对宫颈癌细胞株Hela细胞生物学行为的影响。化学合成circRALB干扰序列si_RALB以及无关序列si_nc,瞬时转染Hela细胞。荧光定量PCR法检测干扰序列si_RALB对Hela细胞中circRALB表达的影响;细胞计数、MTS法、流式细胞术、细胞划痕实验和Transwell实验检测circRALB对Hela细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。结果显示,瞬时转染效率为(89.67±3.1)%。干扰序列si_RALB转染Hela细胞,circRALB表达量为si_nc组的(47.3±1.5)%,差异有统计学意义;si_RALB转染组细胞增殖活性明显低于si_nc对照组,差异有统计学意义;si_RALB转染组细胞凋亡率为(9.17±1.17)%,si_nc对照组细胞凋亡率为(7.2±0.32)%,空白对照组细胞凋亡率(5.63±0.31)%,尽管si_RALB细胞凋亡率大于si_nc对照组细胞凋亡率,但差异无统计学意义;si_RALB转染组与si_nc转染组相比,划痕间距缩小不明显;si_RALB转染组Hela细胞穿膜数为(21.33±2.19)个,显著低于si_nc组(45.33±1.76)个和空白对照组(52±1.53)个。化学合成的circRALB干扰序列转染Hela细胞后,能显著降低细胞中circRALB的表达量。CircRALB表达下调可显著抑制宫颈癌细胞系Hela细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但对其凋亡无明显影响。结果提示CircRALB的表达与宫颈癌细胞的生物学行为有关,可能成为有效的宫颈癌治疗靶标。     

EphA2对神经胶质瘤细胞系U251的凋亡﹑增殖﹑迁移和侵袭的研究

为了研究EphA2对神经胶质瘤细胞系U251在增殖、凋亡、迁移和侵袭方面所起的作用,用RT-PCR方法检测正常脑组织标本与两种恶性胶质瘤细胞系中EphA2 mRNA表达水平,然后用化学合成的针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA)下调该基因的表达,以检测其在U251中的生物学功能．证实了EphA2基因在正常脑组织标本中的表达水平远低于两种恶性胶质瘤细胞系．把体外化学合成针对EphA2基因的小干扰RNA(siRNA- EphA2)转染入U251细胞后,Western blot, 实时定量 RT-PCR检测到U251细胞中EphA2蛋白及mRNA表达水平都明显降低,并且细胞增殖受到显著抑制,同时出现了明显的细胞凋亡．伤口愈合实验(检测细胞迁移能力),Transwell小室实验(检测细胞侵袭能力)均表明,下调EphA2的表达后,细胞的迁移和侵袭能力较阴性对照组显著减弱．上述结果表明,在神经胶质瘤U251细胞中,EphA2与其恶性增殖及高度侵染性相关,可作为分子治疗的有效靶点．     

重组人MG53蛋白对人脐带间充质干细胞氧化损伤的保护作用

目的建立人脐带间充质干细胞(h UC-MSCs)的H_2O_2氧化损伤模型,探讨重组人MG53蛋白(rh MG53)对h UC-MSCs氧化损伤的保护作用。方法使用组织块培养法从健康人脐带沃顿胶组织中分离培养h UC-MSCs,流式细胞仪检测细胞表型;CCK-8法检测h UC-MSCs的增殖和H_2O_2损伤程度。实验分为正常对照组(NC组)、rh MG53组、H_2O_2组和H_2O_2+rh MG53组。分别采用CCK-8法、Transwell小室、流式细胞术和β-半乳糖苷酶染色检测rh MG53蛋白对h UC-MSCs增殖、迁移、周期凋亡和衰老的影响。各组、各个时间点的吸光值采用析因设计的方差分析,组间比较采用单因素方差分析。结果 h UC-MSCs贴壁呈梭型生长,高表达间充质干细胞标志CD44、CD133、HLA-ABC,低表达CD34、CD45;H_2O_2对h UC-MSCs具有浓度和时间依赖性的损伤作用,确定200μmol/L的H_2O_2处理16 h为h UC-MSCs氧化损伤的最适条件。与NC组相比,H_2O_2组细胞增殖(0.994±0.011 vs 1.331±0.014)、迁移率(8.15﹪±2.47﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)和S期细胞比例(29.67﹪±3.69﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)显著降低,细胞衰老(44.07﹪±5.26﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(52.63﹪±5.76﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著增加,差异具有统计学意义(均P0.05);rh MG53组细胞增殖(1.509±0.086 vs 1.331±0.014)和迁移率(52.13﹪±5.46﹪vs 33.34﹪±3.62﹪)显著提高,S期比例(35.27﹪±4.79﹪vs 34.33﹪±4.25﹪)变化差异无统计学意义(P0.05),细胞衰老(3.92﹪±1.31﹪vs 5.7﹪±1.42﹪)和凋亡比例(3.96﹪±1.06﹪vs 4.65﹪±1.23﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。与H_2O_2组相比,H_2O_2+rhMG53组细胞增殖(1.252±0.056 vs 0.994±0.011)、迁移率(18.93﹪±3.12﹪vs8.15﹪±2.47﹪)和S期比例(34.84﹪±3.45﹪vs 29.67﹪±3.69﹪)显著提高,细胞衰老(17.89﹪±2.64﹪vs 44.07﹪±5.26﹪)和凋亡比例(4.65﹪±1.23﹪vs 17.63﹪±2.56﹪)显著降低,差异具有统计学意义(均P0.05)。结论 rhMG53对H_2O_2造成的h UC-MSCs氧化损伤有保护作用。     

RNA干扰技术下调营养缺乏自噬因子1表达对肝癌细胞侵袭转移能力的影响

目的采用RNA干扰手段抑制营养缺乏自噬因子1(NAF1)在肝细胞癌MHCC-97H细胞中的表达,观察其对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。方法采用NAF1-si RNA和空白对照NC-si RNA转染肝细胞癌MHCC-97H细胞,设为NAF组和NC组,同时设立未转染空白对照组(Blank组)。荧光实时定量PCR法检测MHCC-97H细胞NAF1m RNA表达。Western blotting法检测MHCC-97H细胞NAF蛋白和基质金属蛋白酶9(MMP9)蛋白表达。细胞划痕实验检测MHCC-97H细胞迁移能力。Transwell实验检测MHCC-97H细胞侵袭能力。荧光素酶报告基因实验检测MHCC-97H细胞核因子κB(NF-κB)信号通路的相对活性。多组间数据的比较用单因素方差分析,两组之间数据的比较采用t检验。结果 NAF组MHCC-97H细胞NAF1-m RNA的相对表达量为(6.50±0.23)﹪,低于Blank组的(100.80±0.60)﹪,且差异具有统计学意义(t=14.17,P=0.02)。NAF组MHCC-97H细胞NAF1蛋白和MMP9蛋白的相对表达量分别为0.12±0.01、0.07±0.01,均低于Blank组的0.79±0.05、0.81±0.02,且差异均有统计学意义(t=5.21、7.45,P=0.00、0.02)。NAF组MHCC-97H细胞的迁移距离明显小于Blank组。NAF组穿膜细胞的数量为(11.28±1.56)个/视野,少于Blank组的(197.87±3.18)个/视野,且差异有统计学意义(t=7.97,P=0.00),NAF组NF-κB信号通路的相对活性值3.25±0.53明显低于Blank组的26.69±7.41,差异具有统计学意义(t=13.33,P=0.01)。结论采用RNA干扰手段抑制NAF1的表达可能成为抑制肝细胞癌侵袭转移的有效手段。     

肿瘤坏死因子-α促进乳腺癌转移的分子机制研究

目的探究肿瘤坏死因子-α(TNF-α)促进乳腺癌转移的分子机制。方法采集病理学确诊为乳腺癌的患者血液标本53例,首先把MDA-MB-231乳腺癌细胞分为对照组、TNF-α诱导组,再把乳腺癌细胞分为空载对照组(转染空载体)、Arf6-T27N组(转染Arf6-T27N)、空载转染+TNF-α组(转染空载体后加500 ng/ml TNF-α)、Arf6-T27N+TNF-α组(转染Arf6-T27N后加500 ng/ml TNF-α)。采用酶联免疫检测法(ELISA)对乳腺癌患者血浆中TNF-α含量进行检测,采用划痕实验检测细胞的迁移能力,采用小G蛋白活化实验(GLISA)筛选并检测对照组和TNF-α诱导组的小G蛋白及其诱导效应。两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD检验;采用χ2检验或Fisher确切概率法分析TNF-α表达高低与临床病理参数的关系。结果与未发生淋巴结转移的乳腺癌患者比较,已发生淋巴结转移的患者血浆中TNF-α的含量(391.24±307.35比709.58±277.51)升高,差异具有统计学意义(P<0.001);与对照组比较,TNF-α诱导组乳腺癌细胞相对愈合面积(1.00±0.04比2.34±0.25)增大,细胞小G蛋白Arf6活性(1.00±0.02比3.11±0.14)升高,差异有统计学意义(P均<0.001);与空载转染+TNF-α组比较,Arf6-T27N+TNF-α组乳腺癌细胞的迁移能力(2.33±0.14比1.83±0.15)降低,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论本研究阐明TNF-α通过激活Arf6促进乳腺癌细胞迁移,提示TNF-α/Arf6可作为控制乳腺癌转移的新靶点。     

过表达CDX1蛋白对直肠癌细胞增殖及能量代谢的影响及机制研究

目的:探讨过表达尾侧同源盒转录因子1(CDX1)蛋白对直肠癌细胞增殖及能量代谢的影响。方法:以直肠癌细胞SW117为研究对象,细胞转染pIRES(空载体组)、pIRES-CDX1(过表达组),同时设置对照组(只加入转染试剂)。培养48 h后,Western blot检测细胞中CDX1、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达水平,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,试剂盒检测细胞中三磷酸腺苷(ATP)含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量。结果:空载体组细胞中CDX1、Cleaved Caspase-3、Akt、p-Akt表达水平及细胞存活率、凋亡率、ATP含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量与对照组相比均没有明显差异。过表达组细胞存活率、p-Akt水平、ATP含量、丙酮酸激酶活性、己糖激酶活性及培养液上清中乳酸含量与对组相比均明显下降,凋亡率及细胞中Cleaved Caspase-3表达水平均明显高于对照组。结论:过表达CDX1蛋白能够促进直肠癌细胞凋亡,抑制直肠癌细胞增殖,影响直肠癌细胞能量代谢,作用机制可能与p-Akt水平有关。     

干扰FSCN1基因表达对前列腺癌细胞凋亡、活性氧水平影响的研究

目的探讨干扰FSCN1基因表达对前列腺癌细胞凋亡、活性氧(ROS)水平影响及机制。方法以正常前列腺上皮细胞RWPE-1为对照细胞,通过RT-PCR及Western blot检测前列腺癌LNCaP、DU145和PC-3细胞中FSCN1 mRNA及蛋白表达;以LipofectamineTM 2000为载体,DU145细胞分为si-FSCN1组(靶向抑制FSCN1的小干扰RNAs转染DU145细胞)、阴性对照组(随机序列转染DU145细胞)及空白对照组(未转染的细胞),siRNA转染48 h,Western blot检测FSCN1、PCNA、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKKα和p-IKKα的蛋白表达。CCK8检测细胞活力,流式细胞术检测细胞凋亡率及ROS水平。多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。结果与RWPE-1细胞比较,LNCaP、DU145和PC-3细胞中FSCN1 mRNA(1比2.561±0.189、7.183±0.882、4.796±0.567、4.796±0.567)及蛋白表达(0.053±0.007比0.217±0.013、0.654±0.058、0.316±0.035)均升高,差异具有统计学意义(P均<0.05)。与阴性对照组比较,si-FSCN1组FSCN1表达(0.473±0.052比0.086±0.010)降低,差异具有统计学意义(P均<0.05)。与si-FSCN1组比较,空白对照组、阴性对照组细胞活力(0.302±0.033比0.787±0.069、0.764±0.063)均升高,凋亡率(24.54﹪±1.47﹪比3.04﹪±0.36﹪、3.28﹪±0.40﹪)和ROS相对荧光强度(90.04±5.73比47.88±3.62、49.62±4.11)均降低,差异具有统计学意义(P均<0.05)。与si-FSCN1组比较,空白对照组、阴性对照组PCNA(0.255±0.032比0.654±0.062、0.631±0.058)、NF-κB p65(0.092±0.011比0.296±0.032、0.318±0.037)、p-NF-κB p65(0.042±0.008比0.155±0.018、0.151±0.016)、IKKα(0.112±0.01比0.172±0.020、0.192±0.023)和p-IKKα的蛋白表达(0.051±0.005比0.102±0.011、0.091±0.009)均升高,Cleaved caspase3蛋白表达(0.206±0.018比0.074±0.009、0.085±0.010)均降低,差异具有统计学意义(P均<0.05)。阴性对照组与空白对照组细胞活力、凋亡率、ROS水平及FSCN1、PCNA、Cleaved caspase3、NF-κB p65、p-NF-κB p65、IKKα和p-IKKα的蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。结论干扰FSCN1基因表达可降低前列腺癌细胞活力及诱导凋亡,机制可能与ROS水平升高及NF-κB信号下调有关。     

外泌体MicroRNA-1246促进星形胶质瘤细胞增殖与侵袭的研究

目的探讨星形胶质瘤细胞来源的外泌体中microRNA-1246（miRNA-1246）是否作用于星形胶质瘤细胞,促进其增殖与侵袭。 方法实验分为对照组、miRNA-1246抑制剂组与miRNA-1246模拟物组,各组设6个复孔。首先从患者血液中分离外泌体并鉴定其成分。通过基质胶包被的Transwell小室实验检测星形胶质瘤细胞在miRNA-1246作用下侵袭能力的变化,CCK-8实验检测细胞增殖能力。利用荧光素酶报告基因验证miRNA-1246是否靶向细胞黏附分子1（CADM1）基因。最后通过Western Blot实验与RT-qPCR实验检测癌症组织中CADM1蛋白水平的含量并分析其与胶质瘤的关系。采用方差分析和t检验进行统计学分析。 结果恶性胶质瘤患者血液循环外泌体中miRNA-1246的含量为2.83±1.70,高于对照组1.00±0.50,差异具有统计学意义（t?=?6.044,P?=?0.026）。转染miRNA-1246抑制剂后细胞CADM1蛋白水平为1.79±0.17,高于对照组1.00±0.09（t?=?4.576,P?=?0.017）,细胞侵袭数量为（48.40±5.90）个,低于对照组96.50±6.70,而转染miRNA-1246模拟物后细胞侵袭数量为（123.20±9.80）个,高于对照组（96.50±6.70）个（t?=?5.258,P?=?0.002）。CCK-8实验中转染miRNA-1246抑制剂组A450值为0.49±0.08,低于对照组0.76±0.06,而转染miRNA-1246模拟物组A450值为1.03±0.09,显著升高（F?=?33.82,P?=?0.005）。荧光素酶报告实验表明细胞转染miR-?1246模拟物后荧光强度为4.98±1.86,低于对照组10.34±2.60（t?=?7.235,P?=?0.006）,而CADM1-Mut组内之间比较差异无统计学意义。 结论胶质瘤细胞外泌体中的miRNA-1246可通过靶向CADM1基因抑制蛋白表达,促进胶质瘤细胞的增殖与转移,提示循环外泌体中的miRNA-1246可作为恶性胶质瘤诊断与治疗的潜在靶点。     

染料木素抑制人胰腺癌细胞株PANC-1细胞增殖机制的研究

目的探讨不同浓度染料木素对胰腺癌细胞作用及其抑癌基因表达的研究。方法本实验共分实验组(80,120,160,200μmol/L)的染料木素、空白对照组(PBS)和标准对照(吉西他滨)。各组培养基处理细胞12,24,36,48,60 h后,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测人胰腺癌细胞株PANC-1在染料木素作用下的增殖活性;流式细胞术检测人胰腺癌细胞株PANC-1在染料木素木素作用下的凋亡细胞百分率;用逆转录-聚合酶连反应(RTPCR)方法测定P53及P21抑癌基因的表达;Western-blot法检测抑癌基因P53和P21的蛋白表达水平。细胞凋亡与细胞基因mRNA采用的是LSD法,细胞增殖数据采用的是配对t检验。结果流式细胞术显示,人胰腺癌细胞株PANC-1处理后60 h时在不同浓度(80,120,160,200μmol/L)的染料木素作用下细胞凋亡率分别为(3.72±1.58)﹪、(35.98±3.76)﹪、(51.36±4.32)﹪和(64.10±2.09)﹪。吉西他滨(gemcitabine,GEM)组为(43.45±5.28)﹪,不同浓度染料木素组与标准对照组间比较差异有统计学意义(均P<0.01);细胞增殖效果:160μmol/L与200μmol/L、120μmol/L与200μmol/L、200μmol/L与吉西他滨组之间比较,均有统计学意义(P<0.01),而160μmol/L与吉西他滨组比较无统计学意义(P>0.05);Western-blot检测蛋白水平显示160μmol/L和200μmol/L染料木素相对于空白对照能够明显的增强抑癌基因P21和P53的蛋白水平的表达,相对于标准组没有明显的差异。结论染料木素可以抑制人胰腺癌细胞株PANC-1增殖,并且初步探索了这种抑制作用表现出浓度及时间依赖性。     

CD47-siRNA通过调控ROS诱导食管癌细胞SEG-1凋亡

目的:探讨CD47-siRNA对食管癌细胞SEG-1凋亡的影响及其机制研究。方法:Western blot法检测食管癌细胞SEG-1中CD47蛋白、促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达;CCK-8法检测食管癌细胞SEG-1细胞活力;DCFDA细胞ROS检测试剂盒检测食管癌细胞SEG-1中ROS水平。结果:CD47-siRNA转染组食管癌细胞SEG-1中CD47蛋白明显低于空载对照组(P0.05);CD47-siRNA转染组食管癌细胞SEG-1细胞活力显著低于空载对照组(P0.05);CD47-siRNA转染组食管癌细胞SEG-1中促凋亡蛋白Bax表达显著高于空载对照组(P0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表达低于空载对照组(P0.05);CD47-siRNA转染食管癌细胞SEG-1组ROS水平明显高于空载对照组(P0.05);与CD47-siRNA转染组比较,CAT (ROS抑制剂,5 m M/L, 6 h)预处理增加了细胞活力;与CD47-siRNA转染组比较,CAT (ROS抑制剂,5 m M/L, 6 h)预处理显著降低食管癌细胞SEG-1中Bax蛋白表达以及增加抗凋亡蛋白Bcl-2表达。结论:CD47-siRNA转染通过上调食管癌细胞SEG-1内ROS水平促进食管癌细胞SEG-1凋亡。     

miR-184通过抑制EPB41L5调控大鼠肾癌细胞增殖及迁移

为了探讨miR-184对肾癌细胞的影响及机制,本研究选取肾癌细胞株786-0细胞,随机分为对照组、空白转染组和miR-184转染组,其中miR-184转染组转染miR-184 mimic,空白转染组转染空白mimic,采用CCK-8细胞增殖实验检测各组细胞增殖,流式细胞仪检测各组细胞凋亡,划痕实验检测各组细胞迁移,Western blotting检测各组EPB41L5蛋白表达。研究结果表明miR-184转染组培养48 h和培养72 h时OD值分别为(0.964±0.103)和(1.011±0.121),明显低于对照组和空白转染组(p<0.05);miR-184转染组培养72 h后细胞凋亡率为(18.22±2.26)%,明显高于对照组和空白转染组(p<0.05);miR-184转染组培养24 h后细胞迁移数为(17.21±3.06)个,明显低于对照组和空白转染组(p<0.05);miR-184转染组细胞EPB41L5蛋白相对表达量为(0.241±0.061),明显低于对照组和空白转染组(p<0.05)。本研究初步表明:miR-184可抑制肾癌786-0细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡,其可能与其抑制EPB41L5蛋白表达有关。     

miR-30a-5p对人肝癌干细胞增殖和凋亡的影响

目的采用mi R-30a-5p模拟物转染CD133~+MHCC97L肝癌干细胞,观察增殖和凋亡能力的变化,明确mi R-30a-5p对肝癌干细胞的基因治疗效果。方法采用免疫磁珠分选法分选CD133~+MHCC97L肝癌干细胞并采用流式细胞术检测分选效果。分别采用mi R-30a-5p模拟物或抑制物转染肝癌干细胞设为30 a M组或30 a I组,并设立空白对照NC组。采用RT-PCR法检测细胞mi R-30a-5p表达水平。采用CCK-8法检测细胞增殖能力。采用琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力。采用流式细胞术检测细胞凋亡率。肝癌干细胞分选效率、mi R-30a-5p表达水平、CCK-8实验测得A值、克隆形成数量和细胞凋亡率实验数据的比较采用单因素方差分析和t检验。结果未进行磁珠分选的MHCC97L肝癌细胞CD133阳性率为(1.42±0.26)﹪,低于分选后的MHCC97L细胞中CD133的阳性率(94.48±2.32)﹪,差异具有统计学意义(t=-6.78,P=0.04)。RT-PCR实验结果显示,30a M组CD133~+MHCC97L肝癌干细胞中mi R-30a-5p的相对表达水平(20.21±1.92)较NC组(1.03±0.02)明显上调;30 a I组的相对表达水平(0.13±0.01)较NC组明显下调,差异均具有统计学意义(t=20.96,-6.22;P=0.01,0.03)。CCK-8实验结果显示,30 a M组细胞于24 h、48 h和72 h测得的A值分别为(0.40±0.00,0.68±0.03,0.75±0.02),明显低于NC组的(0.83±0.01,1.34±0.03,2.47±0.12),差异具有统计学意义(t=-12.15,-15.66,-6.42;P=0.01,0.02,0.01);30a I组细胞测得的A值分别为(0.95±0.05,1.64±0.03,3.28±0.07),明显高于NC组,差异具有统计学意义(t=9.45,18.97,7.58;P=0.00,0.01,0.03)。软琼脂克隆形成实验结果显示,30 a M组细胞的克隆形成数量为(61.81±1.76)个/孔,低于NC组的(131.96±8.15)个/孔,差异具有统计学意义(t=-8.31,P=0.00);30 a I组的克隆形成数量为(195.75±6.16)个/孔,高于与NC组,差异具有统计学意义(t=15.61,P=0.01)。流式细胞术结果显示,30 a M组的细胞凋亡率为(19.67±0.06)﹪,高于NC组的(10.65±0.12)﹪,差异具有统计学意义(t=15.90,P=0.02);30 a I组的细胞凋亡率为(4.85±0.03)﹪,低于NC组,差异具有统计学意义(t=-6.96,P=0.00)。结论 mi R-30a-5p对CD133~+MHCC97L肝癌干细胞的增殖具有明显的抑制效果,有望成为针对肝癌的有效靶向性治疗手段。     

丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者乳酸清除率及免疫T细胞的影响分析

目的探讨丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者乳酸清除率及免疫T细胞的影响。方法选自第三军医大学第一附属医院2014年6月至2016年6月期间收治的急性重度一氧化碳中毒患者94例,依据随机数字表法分为观察组47例与对照组47例。对照组给予神经节苷脂治疗,观察组在对照组基础上结合丁苯酞治疗。两组疗程均为4周。比较两组治疗疗效、24 h血乳酸清除率、一氧化碳中毒后迟发性脑病(DEACMP)发生率,治疗前后GCS评分和免疫功能指标变化。组间和组内计量资料两两比较采用t检验,等级计数资料的比较采用卡方检验。结果观察组治疗总有效率(93.62﹪)高于对照组(74.47﹪)(c~2=6.425,P0.05);两组患者治疗后GCS评分增加(P0.05);观察组患者治疗后GCS评分(14.23±1.69)分高于对照组(11.35±1.45)分,差异具有统计学意义(t=8.867,P0.05);观察组24 h血乳酸清除率(65.98±4.52)﹪高于对照组(41.39±3.67)﹪,差异具有统计学意义(t=28.954,P0.05);两组治疗后CD3~+、CD4~+、CD4(+CD8~+)增加,而CD8~+降低(P0.05);观察组治疗后CD3~+(62.30±4.19)﹪、CD4~+(62.30±4.19)﹪、CD4~+(CD8~+)(1.64±0.31)﹪高于对照组CD3~+(57.12±3.76)﹪、CD4~+(38.91±3.10)﹪、CD4~+(CD8~+)(1.34±0.24)﹪,而CD8~+(25.78±2.18)﹪低于对照组(29.08±2.31)﹪,差异具有统计学意义(t=6.308、4.755、5.246、7.123,P0.05);观察组DEACMP发生率(4.26﹪)低于对照组(23.40﹪),差异具有统计学意义(c~2=7.231,P0.05)。结论丁苯酞联合神经节苷脂对急性重度一氧化碳中毒患者疗效明显,可提高乳酸清除率,改善患者免疫功能,具有重要研究意义。