一种适用于植物居群遗传分析的组织干燥与保存方法

DNA的有效提取是分子生物研究工作的前提,野外采集时大多采用将新鲜叶片用变色硅胶快速干燥,防止细胞死亡过程中次生物质释放和DNA降解.我们在野外采样时,将新鲜材料压制成干标本,成功地应用于芨芨草居群的RAPD分析.这种植物组织干燥与保存的方法比硅胶快速干燥法更简单、方便,非常适用于采集地点多,相距远,野外采集时间长,所采样品的种类和数目又多的遗传多样性研究.     

琼脂固体培养基培养蜜环菌菌索总DNA的提取

野外采集的蜜环菌[Armillaria mellea(Vahl.ex Fr.)Quel]在提取DNA前需要分离获得纯化的菌丝体。常规液体培养获得菌丝团的方法感杂率较高,采集固体培养基表面cellophane膜上形成的菌丝则难以获得足量的DNA提取材料。蜜环菌细胞内含有大量多醣类物质,也使得蜜环菌高质量DNA的提取存在一定的困难。本研究通过改进试验,提供一个直接从琼脂固体培养基培养的蜜环菌菌索中提取高质量DNA的方法。其中样品的预先冻融处理方法可以促使蜜环菌菌索与琼脂分离;而在裂解提取缓冲液裂解材料细胞后加入1.25 mol/L KAc溶液,则有利于除去蜜环菌细胞内的多醣类物质以及残留的少量琼脂。通过琼脂糖电泳、紫外分光光度计对DNA浓度及OD值的测定、ISSR引物的PCR扩增以及酶切产物的PCR扩增等方法的检测,结果均表明该方法提取的DNA质量较好,符合进一步进行分子生物学研究的要求。     

不同保存方法对柽柳基因组总DNA产量和质量的影响

通过比较不同保存方法对柽柳(Tamarix chinensis)基因组总DNA提取效果的影响,确定合适的野外采集植物样品的保存方法。采用改良CTAB法提取了室温风干、4℃、-20℃、-80℃和硅胶干燥5种保存方法分别保存24 h、1周和1月后的柽柳基因组总DNA,结果表明:4℃保存1月后DNA产量最低,为60.35μg/g,-80℃条件下保存24 h的材料中提取的DNA产量最高,为246.92μg/g,保存效果最好。但在野外仪器条件不具备的情况下,柽柳可采用室温风干或硅胶干燥保存的方法,1月内材料中DNA降解程度较轻,可以扩增出所需目的片段。     

一种提取动物基因组总DNA的野外样品保存方法

为了确定一种方便的野外动物样品保存方法,以新鲜材料作对照,从-20℃冰箱、70%乙醇、含50mmol/L EDTA的70%乙醇、95%乙醇、液氮处理的高原鼠肌肉和肝脏组织中提取基因组总DNA。通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对提取的基因组总DNA质量进行检测。结果显示:相同处理的肝脏DNA产量大,肌肉组织提取的DNA质量好;各种保存方法提取的DNA降解程度依次为,-20℃冰箱、70%乙醇>含50mmol/L EDTA的70%乙醇、95%乙醇>液氮>新鲜。选择新鲜肌肉和95%酒精处理的肌肉样品提取的总DNA作模板,进行微卫星PCR扩增,均可获得清晰的电泳带。将该方法用于高原鼢鼠,进行线粒体12S rRNA、Cytb和D-loop区测序,结果显示该方法保存的样品与新鲜样品没有差别。因此,在野外用95%乙醇固定肌肉样品是一种可行的样品保存方法。     

高温烹饪对动物肌肉组织DNA降解的影响

目的 探索高温烹饪对肌肉组织DNA降解程度的影响.方法 对牛肉、猪肉和鸡肉样本分别进行以下处理:不同温度烘烤0.5h;100℃沸水中加热不同时间;分别用水煮、油煎、红烧、烘烤烹饪肌肉至熟.分别提取DNA,PCR扩增线粒体DNA上的12S rRNA基因片段,电泳检测PCR产物的变化,并进行DNA序列测定.结果 样品经过不同温度处理均能扩增到目的条带,但条带从140℃开始显著减弱;沸水持续加热20 min、40 min后,3种肉的PCR产物量无显著影响,但加热80 min后,猪肉和鸡肉的PCR扩增产物条带明显减弱;红烧后的肌肉PCR扩增产物量显著减少.结论 温度、烹饪时间及烹饪方式对模板DNA的降解和后续PCR扩增有一定影响,但不影响肌肉组织的DNA可检测性.     

药用植物艾纳香基因组DNA提取方法研究

以药用植物艾纳香为研究对象,以-20℃保存、4℃保存、室温自然干燥和硅胶干燥四种样品保存方式,并采用SDS法、CTAB法、SDS-CTAB法和改良CTAB法4种不同的基因组DNA提取方法进行了对比试验,以期建立艾纳香的较好的样品保存方法和基因组DNA提取方法。结果表明,-20℃保存是艾纳香的较理想的样品保存方式;改良CTAB法是艾纳香基因组DNA提取较适宜的方法,该方法提取的DNA经紫外检测,其A_(260)/A_(280)为1.8左右,明显优于SDS法(1.1～1.5)、CTAB法(1.2～1.5)和SDS-CTAB法(1.4～1.6),琼脂糖凝胶电泳、酶切检测和PCR扩增也得出了同样的结论。     

鲜叶保存方法对茶树基因组DNA提取效果的影响

探讨一种简便有效的鲜叶保存方法,对克服茶树DNA研究中远距离采样的困难具有重要意义．为此,以槠叶齐品种的鲜梢为材料,分别采用-20℃、-70℃、硅胶脱水干燥3种方法保存样品,采用改进的CTAB法与SDS法分别对3种方法保存的样品及对照样(鲜叶)进行基因组DNA的提取与纯化,对所得DNA的质量进行多重检测的结果表明,硅胶脱水干燥法保存的样品与其他几种方法保存的样品一样,都提取获得了高质量的DNA,因此,硅胶脱水干燥法可作为远距离采样制备茶树DNA的一种较好的鲜叶保存方法,具有操作简单、经济实用、不受时空等条件限制的特点,该方法同样适用于其他植物．     

两种外周血 DNA 提取方法的比较

目的:外周血DNA的提取是研究乙型肝炎病毒相关临床疾病的基础,所提取DNA的质与量直接关乎下游研究的成败,经济、高效、便捷的外周血DNA提取方法对于疾病分子水平的研究尤为重要,本实验旨在比较两种外周血DNA提取方法,从而为临床研究提供有力的参考。方法:以外周抗凝血为试验样本,分别采用改良盐析法和DNA提取试剂盒法(硅胶柱纯化)进行基因组DNA的提取,通过分光光度仪测量DNA浓度和纯度,并进行PCR扩增及电泳实验。比较改良盐析法与试剂盒提取法(硅胶柱纯化)的效果。结果:试剂盒提取法(硅胶柱纯化)标本用量甚微,省时,提取DNA纯度高,步骤繁琐,PCR条带单一、亮度差;改良盐析法操作步骤少,提取DNA浓度高,PCR条带亮度佳、杂带多,耗时长。结论:两组方法各有优缺点,试剂盒提取法(硅胶柱纯化)可靠、快速,但所获DNA量少、极易降解,改良盐析法耗时,但所获DNA浓度高、量多,可根据实验时间与经费,实验所需的DNA纯度与浓度,提供的样本体积等不同的临床研究需求及条件来综合选择适宜的提取方法。     

单粒干燥大豆种子基因组DNA提取的有效方法

大豆基因组DNA的提取是进行大豆分子生物学研究的基础.以大豆干燥的种子为材料,将SDS法和CTAB法结合在一起并进行了一定的改进,有效的提取了基因组DNA.通过电泳、紫外分光光度计检测和ISSR标记分析验证这种方法是提取大豆干种子基因组DNA的有效方法.     

AM真菌DNA的提取与PCR-DGGE分析

分别从丛枝菌根(AM)真菌的单孢、宿主植物根系及土壤样品中提取DNA,对AM真菌的18SrDNA中NS31/Glol区进行Nested PCR特异性扩增,表明Nested PCR能很好地以微量DNA为模板扩增出目标产物;对扩增产物进行DGGE电泳,3种样品表现出不同的DGGE指纹图谱特征。本文认为,将Nested PCR与DGGE技术相结合,可以成为AM真菌分子生态学研究的有效途径。     

优化反应体系提升Phanta DNA聚合酶对非处理标本的检测性能

在食品检测、法医鉴定、分子诊断等领域经常需要对未提纯DNA的非规范处理标本进行聚合酶链式反应(PCR)扩增。然而,由于非处理标本中存在多种抑制成分,常见的DNA聚合酶并不能满足非处理标本的检测需求。本研究通过调节添加剂、Mg~(2+)浓度以及酶量,对Phanta DNA聚合酶进行反应条件优化,提升Phanta DNA聚合酶突变体的扩增性能,并考察该聚合酶在优化条件下对血液、植物和食品等非处理标本的检测性能。结果表明:在反应缓冲溶液SF Buffer中加入质量分数5%二甲基亚砜(DMSO)和3 mmol/L Mg~(2+),以及50μL反应体系中使用1U酶时,Phanta DNA聚合酶突变体具有最强的扩增性能,可对低至0.05 ng基因组、植物叶片粗提液、高达40%全血浓度及食品粗提液进行有效检测,性能优于普通Taq DNA聚合酶及未进行反应条件优化的Phanta DNA聚合酶。本研究在食品检测、法医鉴定、分子诊断等应用中非处理标本的检测具有极大应用价值。     

一种快速提取肠道微生物总DNA的方法

采集的兔肠道内容物及其粪便样品,通过分散浸泡、震荡洗涤、分级离心、滤器过滤、DNA提取试剂盒提取纯化,可以获得纯度很高的DNA样品。经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计测定,样品A260/A280的比值为1.72±0.02。分别以提取的DNA样品为模板,通过设计的细菌特异引物,对其16S rDNA基因进行PCR扩增,获得了1.6 kb大小特异性很好的预期条带。这为肠道微生物群落的分子生态学研究提供了一种简便、可靠的DNA提取方法。     

基于SYBR Green I的双链DNA定量方法

摘要 基于SYBR Green I荧光染料与双链DNA（dsDNA）结合产生荧光的原理,建立一种高精度、高通量的双链DNA 定量方法。将梯度稀释后的基因组DNA及已知浓度的?DNA与等体积的SYBR Green I（4×）充分混合后,利用荧光定量PCR仪采集荧光信号,以ROX（1×）作为校正染料进行定量分析;同时利用紫外分光光度计对样品进行平行测定,比较该方法与紫外分光光度法的检测限与准确度。紫外分光光度法的检测限为2 ng/?l,而SYBR Green I荧光定量法的检测限可达到0.015 ng/?l,并且在0.015~2 ng/?l范围内,SYBR Green I荧光强度与?DNA浓度呈线性关系（R2=0.9999）,比紫外分光光度法灵敏100倍以上,并可准确定量低纯度的DNA样品。此方法具有重复性好、高通量的特点,仅需少量的生物样本即可满足定量要求,为分子生物学研究及临床检验等多个领域提供了一种可靠的dsDNA定量方法。     

两种方法制备模板DNA在PCR-SSCP中的应用研究

目的:比较两种方法(DNA试剂盒提取法和FTA卡法)提取的DNA在PCR-SSCP反中的可靠性.方法:用DNA试剂盒从全血中提取DNA和用NaOH方法从FTA卡中提取DNA后,用分光光度计检测两种方法提取DNA的浓度及纯度,进行PCR反应之后,用2％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量,接着进行SSCP检测,观测其效果.两种方法提取的样品相同,进行PCR反应和SSCP检测的条件完全一致.结果:用DNA试剂盒提取法和FTA卡法提取的DNA纯度分别为OD260/280=1.817,OD260/280=1.806.48份贵州荷斯坦奶牛DNA后续PCR反应和SSCP的检测结果表明,两种方法提取的DNA用于PCR反应和SSCP检测其效果没有明显差别,成功率为100％.结论:FTA卡结合DNA较稳定,用NaOH法提取DNA效果可靠且比试剂盒方法简便、快捷、经济,值得推广.     

鸢尾属药用植物总DNA提取方法的比较研究

以鸢尾属（Iris L．）药用植物鸢尾Iris tectorum Maxim．叶片为材料,分别采用CTAB法、高盐低pH法、SDS法和试剂盒法四种方法提取植物总DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度计、ISSR和RAPD四种方法对所提取的DNA样品进行检测。结果表明,用SDS—I法提取的植物总DNA纯度、浓度和完整性都很高,从经济角度考虑优于用试剂盒提取,从提取效果考虑不亚于用CTAB法和高盐低pH法提取,是比较适合鸢尾属植物总DNA提取的方法。     

适合于胞质基因组扩增的红麻成熟叶片DNA提取改良方法

为了从成熟红麻叶片中提取高质量、高产量的基因组DNA,针对红麻成熟叶片中多糖、多酚含量较高的特性,利用改良CTAB法及改良SDS法分别提取红麻品种福红952成熟叶基因组DNA,并通过琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计测定进行DNA质量检测。结果表明:改良CTAB法提取的基因组DNA电泳时点样孔干净,条带整齐无拖带,OD260/OD280为1.9左右,产率可达1.84μg/g,其质量、产量都高于改良SDS法,所提取的DNA可用于红麻RAPD分子标记、线粒体DNA、叶绿体DNA通用引物PCR扩增。改良CTAB法是提取成熟红麻叶片DNA的有效方法,并且可用于红麻分子标记及胞质基因组学研究。     

玉米基因组DNA提取及浓度测定方法评价

以非转基因玉米种子为材料,比较了常用的3种植物基因组DNA提取试剂盒及改良的CTAB法,通过琼脂糖凝胶电泳、紫外分光光度及实时荧光PCR扩增检测,对提取得到的基因组DNA的纯度、得率及4种提取方法的重复性、提取时间进行分析;比较紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法,以实时荧光定量PCR检测结果为参照,对3种DNA浓度测定方法的准确性进行分析.结果显示,磁珠法(Promega)最适合应用于快速、简便、高效检测中的植物基因组DNA提取,能有效获得纯度高、完整性好的基因组DNA,并且磁珠法提取效率高,重复性好,提取时间短;在基因组DNA浓度测定中,紫外分光光度法、Qubit荧光法、Pico Green荧光分光光度法的相对误差分别为99.8％、49.8％和28.9％,表明Pico Green荧光分光光度法测定DNA浓度的准确度最高.     

黑麂粪便DNA提取及其PCR检测

采集了黑麂(Muntiacus crinifrons)的新鲜粪便以及在野外自然条件下保存较长时间的粪便样品,晾干后带回实验室,提取其DNA;同时提取黑麂肌肉、皮张样品的DNA,用以对比粪便样品的提取效果。电泳检测结果显示,此方法使用实验室中常用的分子生物学试剂,可以从黑麂粪便样品中抽提到高质量的粪便DNA并克服分子粪便学研究中常见的PCR反应抑制物的影响。为其它濒危鹿科动物的非损伤性取样提供了的新途径,为其遗传结构、遗传多样性现状等研究提供了更加广阔的取材空间。     

保存方式和回软温度对蜜蜂标本DNA提取的影响北大核心CSCD

旨在探寻保存方式及制作干标本前回软温度对蜜蜂不同部位DNA的影响。采用酚-氯仿法对不同方式保存的蜜蜂以及不同温度回软后的蜜蜂干标本的总DNA进行提取,通过琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对DNA的提取结果进行鉴定。电泳结果显示,从新鲜标本、无水乙醇泡制或自然干燥保存半年的标本中均可提取到较高质量的总DNA,尤以头部与足部提取效果最佳。经不同水浴温度回软后保存半年的蜜蜂干标本总DNA提取结果显示,回软温度为65℃时对蜜蜂DNA的破坏性最小,DNA提取的最佳部位为蜜蜂足部。正交试验结果显示,55℃回软后的足部为蜜蜂干标本DNA提取的最优组合。PCR扩增结果显示,本实验提取的总DNA能成功地应用于蜜蜂线粒体基因16S rRNA和COI的扩增。从保存方式、提取部位和回软操作3个因素对蜜蜂标本DNA的提取进行了研究,提供了较好的选择方案。     

保存方式和回软温度对蜜蜂标本DNA提取的影响

旨在探寻保存方式及制作干标本前回软温度对蜜蜂不同部位DNA的影响。采用酚-氯仿法对不同方式保存的蜜蜂以及不同温度回软后的蜜蜂干标本的总DNA进行提取,通过琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增对DNA的提取结果进行鉴定。电泳结果显示,从新鲜标本、无水乙醇泡制或自然干燥保存半年的标本中均可提取到较高质量的总DNA,尤以头部与足部提取效果最佳。经不同水浴温度回软后保存半年的蜜蜂干标本总DNA提取结果显示,回软温度为65℃时对蜜蜂DNA的破坏性最小,DNA提取的最佳部位为蜜蜂足部。正交试验结果显示,55℃回软后的足部为蜜蜂干标本DNA提取的最优组合。PCR扩增结果显示,本实验提取的总DNA能成功地应用于蜜蜂线粒体基因16S rRNA和COI的扩增。从保存方式、提取部位和回软操作3个因素对蜜蜂标本DNA的提取进行了研究,提供了较好的选择方案。