用简化的微量方法分析EGF受体基因在培养细胞中的表达

利用放射性同位素标记的基因片段或cDNA探针进行核酸分子杂交是分析基因表达的有效手段。将细胞DNA或RNA样品经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上,然后与放射性探针杂交,即Southern印迹法和Northern印迹法已被普遍采用,为了简化操作,也常使用(Dot Blot)点印迹法。利用上述技术进行基因或基因产物分析时,首先需要从细胞分离、纯化RNA和DNA。如果需     

小片断DNA电泳分离、转移和分子杂交的一个简单有效的方法

Southern DNA转移技术已广泛地应用于分子生物学研究。主要实验步骤如下:藉琼脂糖电泳将不同分子量的DNA片断分开,再将这些DNA片断从琼脂糖胶上原位转移到硝基纤维素滤膜上。在DNA混合物中,特定的     

蛋白质的印迹法

所谓印迹法就是生物样品(如核酸、蛋白质等)先经过凝胶(琼脂、聚丙烯酰胺等)电泳后,载有样品区带或点子的凝胶通过压片扩散或电泳迁移,把凝胶中分离的样品转移到硝酸纤维素滤纸上,并用一定的探针进行检测的方法。     

从Staphylococcus simulans消除含有溶葡球菌酶基因质粒的研究

溶葡球菌酶是Staphylococcus simulans分泌的能分解葡萄球菌的酶,它的基因位于一个约40kb的质粒DNA上。为了探索用高拷贝质粒取代原有的质粒的可能性,本文首先进行了从该菌株中消除含有溶葡球菌酶基因质粒的实验研究,获得了相应的“消除”菌株。根据对目的菌株和原始菌株的比较分析,包括细胞蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Western blot分析,质粒DNA的琼脂糖胶电泳、Southern Blot分析,质粒DNA的限制性内切核酸酶酶切分析以及对溶葡球菌酶作用敏感性的分析,都表明该目的菌株确系Staphylococcus simulans的衍生菌株,只是清除了其中含有溶葡球菌酶基因的质粒。在此基础上,本文也进行了转化实验。     

向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用

目的评价向下转膜法在乙肝病毒(HBV)Southern杂交中的应用效果。方法用带有1.3倍HBV基因的真核表达载体转染HepG2细胞,使其产生瞬时HBV表达,72小时收集细胞并提取细胞总DNA,琼脂糖凝胶电泳后,以向上和向下两种方式转移在尼龙膜上;用化学发光标记和检测试剂盒将乙肝病毒基因片段标记成探针,再与向上和向下转膜后的尼龙膜进行杂交,判断产生明显HBV杂交条带所需的细胞总DNA量,从而验证向下转膜法在乙肝病毒Southern杂交中的应用效果。结果发现向下转膜后,检测HBV表达所需的细胞总DNA量极少,灵敏度高,0.5μg细胞总DNA电泳后转膜,即可检测出HBVDNA的表达,凝胶中仅有8%的DNA残留;而向上转膜所需的总DNA量大,灵敏度低,25μg的细胞总DNA电泳后转膜,仅能检测出弱的条带。结论向下转膜法是一种较好的转膜方式,适于对乙肝病毒的Southern杂交,值得推广应用。     

介绍一种新的半干式免疫转渍法

蛋白质免疫转渍法(Western blotting)是近十年发展起来的一种生化新技术。其原理是用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离待分析的蛋白质样品,然后用转渍装置把蛋白质转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上。再利用免疫检测法检出要分析的蛋白质区带。过去报道的大多是利用液相夹心式电转渍仪完成转渍的,这     

转座子Tn4560在吸水链霉菌应城变种中的转座

Tn4556是在弗氏链霉菌UC8592中发现的一个类似于Tn3的转座子,在它转坐的非必需区中间插入紫霉素抗性基因vph所组成的复合体(Tn4556::vph),称为Tn4560.把Tn4560克隆到一个温敏性质粒pMT660(由PIJ702衍生而来)构建的重组质粒(pMT660::Tn4560)称为pUC1169.pUC1169不能直接转化吸水链霉菌应城变种1O-22,但可以以一定的频率转化其衍生菌株Q105(至少丧失了一个内源质粒的受体菌株.)从转化子中检测DNA,可以观察到完整的PUC1169的存在(仍为高拷贝).将携带了pUC1169的Q105菌株的孢子悬液以一定的稀释度涂布到无抗生素的平板上获得单个分散的菌株,把平板放在39℃下培养,待菌落长出丰满的孢子后,再分别影印到含有紫霉素和硫链丝菌素的培养基平板上,分离紫霉素抗性(vio~r)和硫链丝菌素敏感(thio~s)的菌落,即为pMT660“自杀”,而Tn4560在细胞中发生了转座的个体.从18个这类菌落中提取总DNA,经PvuⅡ酶解后,在琼脂糖凝胶上电泳,把电泳后的DNA转移到硝酸纤维膜上,与非放射性方法标记的pUC1169探针杂交揭示,每一个衍生菌…     

一种具有抑制糜蛋白酶活性的血清DNA结合蛋白质的纯化和理化特性

 本文采用离子交换层析,DNA亲和层析和硫酸铵盐析三步从人血清中分离纯化了一种肿瘤相关DNA结合蛋白质(64DP)。本方法较简便,产率提高。经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫电泳鉴定纯度符合要求。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定分子量为64,000。等电聚焦电泳测得等电点在4.2左右。醋酸纤维膜电泳和转移电泳表明其为一种α_1球蛋白。过碘酸西夫氏糖蛋白染色呈阳性反应。氨基酸分析和酶抑制试验证实64DP与α_1抗縻蛋白酶很相似。     

微生物学

<正> 从聚丙烯酞胺凝胶中有效地电泳转移DNA片段到硝酸纤维素纸上的方法得到发展。此法已用于带有小牛胸腺载体DNA的未经处理的Xl74-RF-DNA和用NaOH处理过的变性DNA。制备好末端标记的限制性片段,进行样品的聚丙烯酸胺凝胶电泳。     

转座子Tn4560在吸水链霉菌应城变种中的转座

Tn4556是在弗氏链霉菌UC8592中发现的一个类似于Tn3的转座子,在它转坐的非必需区中间插入紫霉素抗性基因vph所组成的复合体(Tn4556::vph),称为Tn4560.把Tn4560克隆到一个温敏性质粒pMT660(由PIJ702衍生而来)构建的重组质粒(pMT660::Tn4560)称为pUC1169.pUC1169不能直接转化吸水链霉菌应城变种1O-22,但可以以一定的频率转化其衍生菌株Q105(至少丧失了一个内源质粒的受体菌株.)从转化子中检测DNA,可以观察到完整的PUC1169的存在(仍为高拷贝).将携带了pUC1169的Q105菌株的孢子悬液以一定的稀释度涂布到无抗生素的平板上获得单个分散的菌株,把平板放在39℃下培养,待菌落长出丰满的孢子后,再分别影印到含有紫霉素和硫链丝菌素的培养基平板上,分离紫霉素抗性(vio^r)和硫链丝菌素敏感(thio^s)的菌落,即为pMT660“自杀”,而Tn4560在细胞中发生了转座的个体.从18个这类菌落中提取总DNA,经PvuⅡ酶解后,在琼脂糖凝胶上电泳,把电泳后的DNA转移到硝酸纤维膜上,与非放射性方法标记的pUC1169探针杂交揭示,每一个衍生菌株都丢失了对应于载体PMT660的区域,却在染色体或内源质粒的不同位点上保留了Tn4560.从vio^r thio^s的突变体中已获得了5102-Ⅲ抗生素生物合成的阻断突变株.     

酵母(Sacchar omyces cerevisiae)的PFG电泳核型比较分析

我们用脉冲式梯度电场凝胶电泳技术,对一些啤酒酵母菌进行了电泳核型分析,比较了不同菌的染色体DNA电泳核型的异同。通过用染色体专一探针做Southern杂交,找出第Ⅰ—ⅩⅥ染色体DNA在PFG电泳图谱中的分布规律,并对一些特殊的电泳和分子杂交现象进行了讨论。     

琼脂糖凝胶直接杂交法

DNA印迹(Southern blot)杂交法是研究DNA分子结构,变异及其组成的一种分子生物学技术。自1975年闻世以来,在分子生物学,遗传学及分子病毒学等研究领域得到广泛应用,对这些学科的发展起了重要作用。由于该技术均需要首先将电泳后已变性的DNA从琼脂糖凝胶转移至支持膜上,因此,实验结果的好坏很大程度取决于吸印的效果,同时也受支持物     

单细胞凝胶电泳技术及在土壤生态毒理学中的应用

单细胞凝胶电泳技术又称为彗星实验,是最近几年发展起来的一种快速、简单、灵敏、可靠的检测细胞核DNA损伤的技术。总结了近几年来单细胞凝胶电泳技术的发展、原理、方法及其应用,并指出其下一步的发展趋势。彗星实验中,镶嵌于琼脂糖中的细胞核在电场中向正极移动,因细胞核与DNA片段迁移速率不同,而形成类似“彗星”的图像。目前采用的彗星实验有多种,可以检测诸如DNA双链断裂、单链断裂、碱不稳定位点等多种类型的DNA损伤。碱性彗星实验因其高灵敏度而被广泛采用。彗星实验的主要步骤包括细胞核悬浮液的获得、彗星电泳胶板制备、细胞裂解、DNA变性解旋、电泳、中和、染色和观察等。目前彗星实验广泛应用于各个研究领域,近年来开始用于环境污染的基因毒性研究和生物监测,并取得了迅速发展。     

实验6 核酸的印迹法杂交

一、印迹法转移核酸 1.瑟慎印迹转移(Southern Blot) (1)按实验要求用某一限制性内切酶消化DNA样品。一般情况下,每微克DNA用3—10单位酶(质粒,噬菌体DNA等每微克3个单位酶,哺乳类DNA每微克8—10单位),37℃下保温5小时或过夜即可完全消化。     

在烟草中酵母脯氨酸基因B的转化(英文)

重组质粒PYP22带有一从酵母基因文库分离到的4.6 kb DNA片段,此片段含有脯氨酸(Pro)合成途径必须的基因B(ProB)。用BamHⅠ酶解PYP22,回收ProB基因,重组入pGA471的Bg Ⅲ切口,形成含有ProB的双质粒载体PBYU4。pBYU4含有能在植物中表达的新霉素磷酸转移酶基因Ⅱ(NPT—Ⅱ),可做转基因植株的筛选标记。借助于辅助质粒pRK2013,pBYU4经过三亲结合转移到农杆菌LAB4404,在含有四环素12.5μg/ml、链霉素100μg/ml和利福平50μ/ml加的AB培养基上筛选出转接合子。提取筛选得到的农杆菌总DNA,用ECoR 1酶解,1％琼脂糖电泳,Southern转移DNA到硝酸纤维素膜上。用α—~(32)P-dCTP标记的ProB片段,与转移好的硝酸纤维素进行Southern杂交。Southern杂交证明含有ProB基因的农杆菌,在加有乙酸丁香酮(acetosyringone)125μg/ml和章鱼碱(octopine)125μg/ml的MS液体培养基中,诱导过夜。用叶圆片法转化革新1号烟草(Nicotana tabacum var.Gexin No.1),叶片与菌液共培养2～5d。从叶片分化再生出的芽转移到含有卡那霉素(K_m)80μg/ml、6—苄基腺嘌呤(6BA)1μg/ml和头孢氨噻腭钠(Cef)500μg/ml的MS培养基,筛选3周,将绿色的芽转移到含l％NaCl,6BA 1μg/ml和Cef 500μg/ml的MS培养基,进行复筛。测定经过这样筛选的再生芽的NPT—Ⅱ活性。     

人成纤维细胞成纤维蛋白质cDNA片段的分离及亚克隆

我们用噬菌斑原位杂交的方法从人成纤维细胞cDNA基因库(λNMT-pCD-cDNA重组体)中分离到一株成纤维蛋白质cDNA克隆。经限制性内切酶酶切电泳及吸印转移法分析证明这是一个成纤维蛋白质cDNA片段克隆,并进一步将此cDNA片段克隆到pBR322质粒上。     

细胞印迹法

<正> 免疫印迹法即利用免疫学检测混合物中蛋白有效成分的一种技术:经凝胶电泳分离后的蛋白有选择地印迹到NC纸上。该技术已被广泛地应用于现代生物学研究中。相反,细胞印迹法即检测特异蛋白质束缚于专一细胞上的一种方法:经电泳分离后印迹到NC纸上。该法仅在必要时才应用。本文就两种细胞印迹技术及有关操作方法作了介绍,并就这些技术的可能意义进行了讨论。     

对角线电泳的一些应用

作为鉴定物质的一种方法,电泳在生物化学和医学临床等领域有着广泛应用。特别是区带电泳由于设备简单、操作方便等优点,已成为开展生物化学和分子生物学等研究工作的一种不可缺少的工具。在蛋白质的研究中应用最广泛的是聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。由于电泳是生物化学的一项基本技术,对于其基本原理、分类、操作等内容不再赘述。近来由于生命科学各门学科向分子生物学方向的发展,对蛋白质的研究更加深入,而聚丙烯酰胺电泳这一经典技术也有了新的应用,特别是对角线电泳的应用进展更快。对角线电泳是双向电泳的一种特例。双向电泳将蛋白质样…     

葡萄糖氧化酶免疫酶染色检测硝酸纤维膜印染的病毒抗原或抗体

<正>近十年来,由于引进了下列技术,包括聚丙烯酰胺凝胶电泳后免疫沉淀、等电聚焦及将样品转移到支持基质的印染技术,分析复杂抗原混合物和其抗体反应的能力显著地提高了。人们已综述了蛋白质印染的一般技术。研究了影响样品经电泳转移到硝酸纤维素(NC)膜上的许多条件。可用同位素或免疫酶方法检测蛋白质印迹。同位素方法很敏感,但较昂贵而配置有些问题,并且有效使用期短。由于同位素法有上述缺点,导致了免疫酶方法的建立。     

水杨酸作用下东北红豆杉细胞的二维凝胶电泳分析

东北红豆杉悬浮培养体系中加入适量浓度的水杨酸,染色结果表明,水杨酸可以增加细胞膜通透性,并可诱导部分细胞发生核凝集或核碎裂。提取细胞染色体DNA进行琼脂糖凝胶电泳,发现染色体DNA发生了部分降解。应用蛋白质双向凝胶电泳技术,研究了水杨酸处理后东北红豆杉细胞发生应激反应过程中蛋白质的表达情况,分析了处理细胞与正常细胞的蛋白质组差异,发现在水杨酸处理48h后的样品中有7个蛋白质差异点,而且有6个蛋白点仅在对照中检测到。结果表明,外加水杨酸改变了东北红豆杉细胞的基因表达,抑制部分蛋白合成的同时也合成了部分新蛋白质,这些蛋白可能与水杨酸的作用有关。