重叠延伸PCR法克隆人脂联素基因及其在毕赤酵母中表达

利用重叠延伸PCR法克隆出人脂联素基因, 连接至克隆载体pGEM-T中, 转化大肠杆菌DH5a, 通过测序对其进行序列分析后, 进一步构建毕赤酵母表达载体pPIC3.5K-ADPN, 通过电击法转化毕赤酵母GS115, 转化的重组酵母菌用甲醇诱导外源基因表达。经PCR、Southern blotting鉴定, 获得了重组毕赤酵母菌株; 经甲醇诱导人脂联素基因表达, Western blotting杂交鉴定证明人脂联素基因已经在毕赤酵母中成功表达。结果表明重叠延伸PCR法准确方便克隆出人脂联素基因, 在30oC, 1%甲醇诱导48 h, 人脂联素基因在巴斯德毕赤酵母中的表达最佳。     

钝顶螺旋藻sod基因真核表达载体的构建与表达

目的:在毕赤酵母中表达钝顶螺旋藻超氧化物歧化酶SOD。方法:以质粒p ET30-sod为模板,采用PCR扩增sod基因,并将其与表达载体p PIC9K相连,构建重组表达质粒p PIC9K-sod。将重组质粒p PIC9K-sod用限制性内切酶PmeⅠ线性化,并电转化入毕赤酵母GS115。利用单菌落PCR筛选整合有重组质粒的阳性转化子,用甲醇进行诱导表达,并在5L发酵罐内进行发酵表达目的蛋白。用改进的邻苯三酚自氧化法测定重组SOD的活性。结果:成功构建了钝顶螺旋藻的sod的真核表达载体,并在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的重组蛋白SOD。发酵罐高密度发酵所获目的蛋白的平均浓度为0.36±0.4 mg/m L,比活性为409±17U/mg。结论:在毕赤酵母中表达了分子量为22k Da的钝顶螺旋藻SOD。     

快速筛选高效表达重组蛋白毕赤酵母菌株新方法的建立及评价

毕赤酵母是当前应用最为广泛的重组蛋白表达系统之一,文中建立了一种快速筛选高效表达重组蛋白的毕赤酵母菌株的新方法.首先,对内质网转膜蛋白Sec63融合表达增强型绿色荧光蛋白EGFP的改造菌株GS115-E表达重组蛋白的能力进行检测;之后将携带不同拷贝数的植酸酶phy基因或木聚糖酶xyn基因的质粒转化进入GS115-E中,...     

人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的构建及表达

构建人甲状旁腺激素(1-34)二联体与人血清白蛋白融合蛋白的表达载体,并表达得到该融合蛋白.通过设计强特异性的引物,利用重叠PCR技术,定向定量的拼接得到hPTH(1-34)二联体-HSA融合蛋白的基因;将构建好的融合基因插入表达载体pPIC9K,大量扩增重组质粒,并用Sal I线性化,电击转化毕赤酵母GS115,经组氨酸缺陷和G418抗性双重筛选得到阳性转化子;挑选阳性转化子进行甲醇诱导表达.测序结果表明得到的重组质粒pPIC9K-hPTH(1-34)二联体-HSA与目标设计完全一致;基因组PCR鉴定结果证明成功构建了hPTH(1-34)二联体-HSA融合基因的毕赤酵母(GS115)表达系统;SDS-PAGE电泳表明融合蛋白获得了表达,尿微量白蛋白试剂盒测定甲醇诱导表达3d后融合蛋白的产量为127 mg/L.     

酵母表面展示分选酶底物用于分选酶活性检测

摘要：【目的】以EGFP标签检测分选酶底物QALPETGEE在毕赤酵母表面的表达,然后将酵母表面展示的底物与分选酶相互作用以检测分选酶活性。【方法】以pcDNA-myc-his-EGFP为模板,通过PCR技术将QALPETGEE-linker-EGFP基因连接到穿梭载体pKFS上,构建QALPETGEE-linker-EGFP酵母表面展示载体后转化至毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中。重组菌经培养,利用荧光显微镜检测重组酵母的荧光强度,然后通过荧光分光光度计检测分选酶与底物相互作用后产     

香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中的表达与鉴定

目的通过构建毕赤酵母表达载体将香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中进行表达,同时对表达产物进行鉴定。方法从香菇菌C91-3菌丝体中提取总RNA,根据转录组测序结果,用3＇-Full RACE、5＇-Full RACE方法获得24414基因,并将其克隆到毕赤酵母的表达载体pPIC9K中,构建真核重组表达质粒pPIC9K-24414。用电转化的方法将此质粒转化到毕赤酵母GS115中并进行诱导表达,对表达产物用Westen-blot方法进行鉴定。结果通过菌落PCR和基因序列分析确定插入pPIC9K中的片段为24414基因片段,通过Westen-blot方法确定所表达蛋白为目的蛋白。结论重组质粒pPIC9K-24414成功构建,目的凋亡相关蛋白24414在毕赤酵母GS115中成功表达,为进一步研究香菇菌C91-3凋亡相关蛋白24414的生物学功能奠定了基础。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶基因克隆和真核表达系统的构建

Δ9-脂肪酸去饱和酶是多不饱和脂肪酸合成途径的关键酶之一,可催化脂肪酸链上特定位置形成双键。本研究在已克隆到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Δ9-脂肪酸去饱和酶(Δ9 fatty acyl-Co A desaturase,Δ9-FAD)基因基础上,为进一步了解其功能,根据中华绒螯蟹Δ9-FAD基因c DNA序列(accession number:JQ693685)以及真核表达载体p PIC3.5K,设计引物并在其上下游分别加入Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位点;利用反转录PCR(RT-PCR)技术,克隆其开放阅读框(open reading frame,ORF)片段,构建重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD;利用电穿孔仪将经限制性内切酶SacⅠ线性化后的重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115菌株中。经筛选与PCR验证,得到含有重组质粒p PIC3.5k-Δ9-FAD的毕赤酵母转化株。本实验成功构建了中华绒螯蟹Δ9-脂肪酸去饱和酶的毕赤酵母表达系统,为深入研究Δ9-脂肪酸去饱和酶的功能做了基础性的工作。     

人胸腺素α1基因在毕赤酵母中的分泌表达

根据质粒pPIC9K中信号肽基因和质粒pPIC3.5K/hTα1-RP,构建表达质粒pPIC9K/S-hTα1-RP,通过电激法转化到毕赤酵母GS115菌株中。甲醇诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western blot结果证明,重组基因hTα1-RP在酵母中得到了表达。     

人精氨酸酶在毕赤酵母的高效表达、纯化和活性研究

目的：人精氨酸酶（Arginase, Arg）的基因arg在毕赤酵母高效分泌表达,建立相应纯化工艺路线,研究重组人精氨酸酶的活性。方法：将人精氨酸酶基因arg按正确的阅读框架插入到毕赤酵母表达载体pPIC9α信号肽基因后,构建得到重组毕赤酵母表达质粒。转化毕赤酵母GS115筛选高表达菌株。结果：成功构建了酵母表达载体pPIC-Arg,转化毕赤酵母GS115后筛选到分泌表达目的蛋白Arg的菌株,目标蛋白可以分泌到培养基中。经过膜过滤和凝胶过滤层析对培养基上清进行纯化,即可获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的Arg比活性为310 IU/mg。结论：成功构建了Arg的毕赤酵母高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化工艺。     

两株绿脓杆菌对石油污染土壤的修复作用

本文旨在研究环境条件下微生物对石油污染土壤的修复情况。从矿井周边土样定向筛选出两株绿脓杆菌,摇瓶降解实验发现,两菌混合培养10 d原油降解率达到95.67%,比单菌培养提高至少32%,即两菌对原油降解具有协同作用。根据降解实验结果制备了混合修复菌剂,并且人工构建石油污染场地,展开中试场地修复试验,模拟不同的操作条件下土壤中原油的降解情况。经60 d修复发现,添加了菌剂的场地,石油烃含量下降趋势明显,每克土壤中石油烃含量从初始的0.8%降至0.1%–0.3%,其中额外添加有机肥作为补充碳氮源的场地,总石油烃降解率最高,达到85.28%。而未添加菌剂的对照组石油烃含量仅减少25.85%。     

新型集成干扰素-人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达和纯化

将含编码HSA天然信号肽、HSA和新型集成干扰素(NIFN)的融合基因,插入毕赤酵母表达载体pPIC3.5,转染毕赤酵母GS115,用于分泌表达融合蛋白HSA-NIFN的酵母工程菌。诱导表达后,产物经SDS-PAGE、Western blot和MALDI-TOF-MS分析表明该蛋白分子量为86369Da,且能被抗HSA单抗特异性结合;表达的HSA-NIFN经超滤、Blue亲和层析和CM阳离子交换层析纯化后,HSA-NIFN的纯度大于95%。用细胞病变抑制法测定其比活性为7.75±0.39×106IU/mg。     

表达乙肝病毒包膜中蛋白的嗜甲醇毕赤酵母菌株的构建

巴斯德毕赤酵母是一种很有潜力的真核表达体系。本文报告将已克隆的乙型肝炎病毒ｐｒｅＳ２－Ｓ基因亚克隆于巴斯德毕赤酵母胞内表达质粒ｐＰＩＣ３,构建重组ｐＰＩＣ３／ｐｒｅＳ２－Ｓ质粒,经酶切线性化后,将其用电转化导入酵母细胞内,经ＰＣＲ及ｄｏｔｂｌｏｔ检测,挑选出在染色体上稳定整合了乙肝病毒包膜中蛋白编码基因的嗜甲醇毕赤酵母菌株,为高效表达乙肝病毒包膜中蛋白奠定了基础     

草鱼生长激素基因在毕赤酵母中的表达

将草鱼生长激素基因（cGH）的cDNA亚克隆到酵母表达载体pPIC9K中,经电击转化导入毕赤巴斯德酵母GS115菌株,获得转化子。菌落PCR技术筛选证实cGH已经整合到了酵母染色体上。对重组酵母进行诱导表达,SDS-PAGE和Western印迹分析,结果表明cGH的毕赤巴斯德酵母GS115菌株中获得了高效表达。     

灰葡萄孢菌激发子pebC1在毕赤酵母中的分泌表达及其生物活性分析

为了实现激发子PebC1编码基因在毕赤酵母中的分泌表达,采用PCR方法从灰葡萄孢菌BC-4-2-2-1菌株中扩增获得激发子PebC1的编码序列,将其亚克隆至酵母分泌型表达载体pPIC9K中,以此片段构建了pPIC9K-pebC1重组表达质粒。重组表达质粒经Bgl Ⅱ线性化处理,电击转化至毕赤酵母宿主菌GS115,经MD、G418-YPD平板和PCR法筛选,获得了重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-pebC1。用甲醇诱导重组酵母菌表达目标蛋白,发酵液经SDS-PAGE电泳分析,在约39 kDa处出现特异目标条带。Western blotting检测结果说明,重组表达产物具有良好的抗原性。生物活性检测表明,酵母重组表达蛋白PebC1能够诱导拟南芥和黄瓜幼苗对灰霉病的抗性。     

mMR-1基因的克隆和在毕赤酵母中分泌表达

hMR-1为本实验室首次克隆发现的一个人类新基因 ,是一种和三种肌肉收缩蛋白及多种细胞信号蛋白具有相互作用的膜蛋白。经与鼠基因组数据库进行同源分析后设计合成引物 ,利用RT-PCR技术从小鼠C57BL 6J脾脏T淋巴细胞总RNA中反转录得到鼠源MR-1基因 (mMR-1) ,提交GenBank ,收录号 (AY2 99972 )。序列分析证明其与人源MR-1基因 (hMR-1)同源性为 90.1%。构建表达载体pPIC9 mMR-1电转化PichiapastorisGS115 ,筛选得到整合分泌表达mMR-1蛋白的重组酵母菌株。表达目的蛋白分子量 25kD ,诱导 5d时产量达到 50mg/L ,通过Westernblot验证了表达产物的正确性。本研究为进一步研究新基因MR-1的生物学功能奠定了基础。     

利用双抗生素标记提高血管钠肽在毕赤酵母中的分泌表达

依照血管钠肽氨基酸序列,根据毕赤酵母密码子偏爱性,人工合成了血管钠肽的编码基因,通过PCR技术,扩增出5'端含有组氨酸标签的血管钠肽基因片段,构建的分泌型表达质粒pPIC9K-VNP,pPICZαB -VNP分别经SalⅠ和SacⅠ线性化后,双质粒转化毕赤酵母GS115宿主菌后,G418/Zeocin双抗筛选出整合型His⁺Mut^s表达菌株,Tricine-SDS-PAGE和Western blot分析,证明His-VNP在毕赤酵母中可有效分泌表达,摇瓶产量可达70mg/L左右,双质粒整合较单质粒整合重组子目的多肽表达量提高了75%。生物学活性研究表明,表达产物在体外具有对巨噬细胞iNOS和TNFα mRNA的抑制作用。     

猪囊尾蚴磷蛋白在毕赤酵母中的表达及初步应用

将猪囊虫磷蛋白P2基因克隆到毕赤酵母表达系统分泌性表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-P2。经测序证明基因序列完全正确,从而大量制备重组质粒pPIC9K-P2,并用SalⅠ、BglⅡ 两种内切酶分别线性化,然后分别电转化毕赤酵母菌种GS115,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株,利用MM和MD培养基鉴定重组菌株Mut表型,然后用甲醇进行诱导表达;并对表达产物通过SDS-PAGE、Westernblot和ELISA分析,结果表明,重组菌株成功地分泌表达了分子量大小为12.6kD,表达量占分泌总蛋白的33%,且具有免疫反应活性的重组磷蛋白,从而解决了囊虫病诊断抗原来源问题并为研制新型猪囊虫疫苗奠定了基础。