BiP表达下调改善双载体转断裂FⅧ基因的功效

双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因可作为一种转基因策略克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但重链分泌的低效性影响转基因功效.为提高重链分泌,本文用RNA干扰技术下调内质网内蛋白伴侣分子免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)的表达,观察对HEK293细胞双载体共转FⅧ基因分泌重链和生物活性的影响.结果显示,RNA干扰可明显下调BiP表达,但不影响细胞生长;ELISA检测BiP下调细胞单独转重链基因时的重链分泌量为98±38 ng/mL,与轻链共转基因时显著升高到157±32 ng/mL,明显高于对照细胞单独转重链基因和共转重链和轻链基因的重链分泌量(分别为29±8 ng/mL和79±19 ng/mL);Cotest法检测显示,BiP下调细胞共转重链和轻链基因细胞分泌的凝血生物活性为0.73±0.23 IU/mL,明显高于对照细胞共转重链和轻链基因(0.39±0.07 IU/mL).结果表明,BiP表达下调通过促进重链分泌,可提高双载体共转FⅧ基因的功效,为进一步动物体内双AAV载体转FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了实验依据.     

双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FⅧ基因

用双载体转运凝血Ⅷ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该文用双载体转B结构域大部缺失型FⅧ(BDD-FVⅢ)的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为(125±29)ng/mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的(75±23)ng/mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为(0.78±0.29)U/mL,也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞(0.34±0.12)U/mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FⅧ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。     

双载体转重链Tyr664Cys和轻链Thr1286Cys突变体BDD-FVⅢ基因

摘要用双载体转运凝血VⅢ因子基因在甲型血友病基因治疗研究中可克服AAV毒载体容量限制,但存在重链分泌低效和链不均衡性问题。为探索重、轻链间二硫键形成对重链分泌的促进作用,该丈用双载体转B结构域大部缺失型FVⅢ（BDD-FVⅢ）的重链和轻链基因,将重链的Tyr664和轻链Thr1826突变为Cys,研究了HEK293细胞共转基因后的基因表达、分泌至培养上清的重链量和凝血生物活性。用Western blot检测细胞裂解液结果显示,非还原条件下有明显的二硫键交联的重、轻链蛋白;链特异性ELISA定量检测细胞分泌的重链为（125＋29）ng／mL,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞的（75＋23）ng／mL;Coatest法显示细胞分泌的凝血活性为（0．784±0．29）U／mL．也明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞（0．34＋0．12）U／mL。结果表明,重、轻链间的二硫键形成可提高双载体转FVⅢ基因的功效,为进一步在动物体内转基因提供了实验依据。     

二硫键形成促进双载体转断裂B区缺失型凝血因子Ⅷ基因

双载体共转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因是克服腺相关病毒载体(AAV)容量限制的一种策略, 但重链分泌的低效性产生链不均衡性,影响转基因的功效．假设重、轻链链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,本文将BDD-FⅧ的重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys．双载体培养的COS-7细胞共转染突变重链和轻链基因,Western blot显示细胞内二硫键交联的重、轻链蛋白形成,ELISA和Coatest分析细胞培养上清的BDD-FⅧ重链分泌量和生物活性,分别为(109 ± 13) μg/L和(0.65 ± 0.12) U/ml,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞((71 ± 11) μg/L和(0.35 ± 0.05) U/ml)．结果表明,链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,为进一步动物体内运用双AAV载体转BDD-FⅧ基因提供了实验依据．     

前肽缺失体vWF改善FVIII基因断裂转移 细胞的重链和活性分泌

通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-ΔPro)基因,探讨了vWF-ΔPro对双载体转凝血VⅢ因子(FVⅢ)基因的影响。将vWF-ΔPro基因和B-区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29)ng/ml,明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(87±15)ng/ml;未转vWF-ΔPro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-ΔPro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-ΔPro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-ΔPro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-ΔPro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml)。另外,转vWF-ΔPro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FVIII凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-ΔPro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体。表明转vWF-ΔPro基因可促进双链转FVⅢ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础。     

前肽缺失体vWF改善FⅧ基因断裂转移细胞的重链和活性分泌

通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-△Pro)基因,探讨了vWF-△Pro对双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因的影响.将vWF-△Pro基因和B-区缺失型FⅧ( BDD-FⅧ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29) ng/ml,明显高于未转vWF-△Pro基因细胞(87±15) ng/ml;未转vWF-△Pro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-△Pro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-△Pro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-△Pro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-△Pro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml).另外,转vWF-△Pro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FⅧ凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-△Pro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体.表明转vWF-△Pro基因可促进双链转FⅧ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础.     

基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ因子基因转移

以intein的蛋白反式剪接为工具,研究了运用双载体的真核细胞凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因转移,通过翻译后剪接得到完整的功能性FⅧ蛋白.将B结构域大部分缺失（Δ761~1639）的人功能性FⅧ（BDD-FⅧ）cDNA于剪接所需保守残基Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与106和48个氨基酸的mini Ssp DnaB intein的N端（IntN）和C端（IntC）编码序列融合,构建一对在质粒pcDNA3.1的强启动子CMV驱动下的真核表达载体.用脂质体共转染至293细胞和COS-7细胞,培养48h后,收集细胞上清,用ELISA检测培养上清中剪接形成的BDD-FⅧ蛋白水平,用Coatest法检测上清的功能性FⅧ生物活性,并用Western blot观察细胞内的BDD-FⅧ蛋白质剪接.结果显示,两种细胞培养上清中有较高水平的剪接BDD-FⅧ蛋白形成,分别达到（137±23）和（109±22）ng/mL,由细胞内和细胞外（培养上清）的剪接共同组成 并检测到培养上清中较高水平的FⅧ生物活性,分别为（1.05±0.16）和（0.79±0.23）IU/mL,包括细胞内、外剪接产物BDD-FⅧ共同形成 细胞总蛋白的Western blot进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-FⅧ蛋白.表明intein可用于双载体系统真核细胞FⅧ基因转移,并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高FⅧ生物活性的BDD-FⅧ蛋白,为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体（AAV）转运FⅧ基因,克服AAV载体的容量限制提供了依据.     

vWF-ΔPro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FVIII基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除．前肽缺失突变体vWF (vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白．为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合Ssp DnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性．结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21 ng/mL,活性为1.78±0.18 IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12 ng/mL和1.05±0.13 IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19 ng/mL和1.95±0.22 IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性．为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据．     

转甲状腺素蛋白基因在酵母中的表达

用限制酶BamHI将含人TTR基因的DNA片段(约493bp)从质粒 pSK-TTR上切下后并插入到分泌型载体pHIL-SI的BamHI位点上,经酶切鉴定重组质粒pHIL-SI-TTR上的TTR基因插入方向正确。将pHIL-SI-TTRDNA用BglII酶切后,转入真核表达系统——毕赤氏酵母。得到的转化子经摇瓶发酵,上清液用15%SDSPAGE检测,有TTRF的表达。经DEAESepheroseF.F离子交换柱和SephacrylS200分子筛层析,得到纯化的TTRF。体外实验表明TTRF对肝癌细胞有抑制作用。     

CMO,BADH双基因植物表达载体的构建

以pC1303质粒和pC1391质粒为基础,利用载体pBIUC和pBIB构建了分别有Ubi启动子、35S启动子调控的带有控制甜菜碱合成的CMO和BADH的植物表达载体pC1303-Ubi-CMO-35S-BADH,为进一步开展提高植物抗逆性基因工程提供了基础.     

亮氨酸拉链提高小鼠血浆中剪接的凝血因子Ⅷ凝血活性

培养细胞实验表明,亮氨酸拉链通过改善内含肽(intein)的蛋白质剪接效率,提高双载体转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)基因细胞剪接FⅧ蛋白的分泌量和活性.本文从C57BL/6小鼠门静脉注射含亮氨酸拉链和Ssp DnaB内含肽融合的BDD-FⅧ的重链和轻链基因双表达载体,48 h后,检测到血浆的重链分泌量和FⅧ活性分别为(298±67)μg/L和(1.15±0.29)U/mL,明显高于不含亮氨酸拉链的双载体转BDD-FⅧ基因对照小鼠((179±59)μg/L和(0.58±0.19)U/mL).结果表明,亮氨酸拉链通过改善蛋白质反式剪接,提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因小鼠血浆的凝血活性,为进一步双腺相关病毒(AAV)载体转BDD-FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了依据.     

双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体的构建与鉴定

利用大肠杆菌质粒pSP72和枯草杆菌质粒pUB18共整合得到双功能克隆载体pSB。在pSB多克隆位点依次引入枯草杆菌果聚糖蔗糖酶基因启动子-信号肽序列sacBp.s.、地衣芽孢杆菌淀粉酶基因终止子序列α-amyT和短小芽孢杆菌增强子基因degQ,最终构建了双功能枯草杆菌诱导型高效表达分泌载体pSBPTQ。将VasostatinⅠ基因作为靶基因检测sacBp.s.、α-amyT和degQ在pSBPTQ进行外源基因表达时的功能,结果表明,在蔗糖诱导下,sacB启动子有效启动了Vasostatin I基因的表达和分泌,α-amy T提高了VasostatinⅠ基因的转录效率,而degQ明显增强了VasostatinⅠ基因的表达水平。VasostatinⅠ基因在蔗糖诱导下成功表达并分泌到枯草杆菌细胞外,蛋白质分泌效率达到90%左右。质粒稳定性试验结果表明,经过40个世代之后,质粒pSBPTQ在枯草杆菌DB1342中仍旧保持在83%以上。     

GST-His双标签原核表达载体的构建及应用

目的：在原有带有GST标签的pGEX-KG载体上添加His标签,构建双标签原核表达载体,以提高纯化后的融合蛋白的纯度。方法：双酶切pGEX-KG载体,将同样带有双酶切位点编码His标签的DNA序列酶切后与其连接、转化大肠杆菌DH5α、鉴定阳性克隆并测序,并将编码雌激素受体B（ERβ）的片段构建到该载体上,分别利用GST标签和His标签对ERβ蛋白进行2次纯化。结果：构建了GST-His双标签原核表达载体,将ERβ编码片段克隆入该载体中,在原核生物中得到表达;分别用GST和His抗体进行Westernblot分析,均可检测到GST-His-ERβ融合蛋白的表达;利用此双标签载体纯化得到了纯度较高的ERβ蛋白。结论：GST-His双标签原核表达载体的构建对提高目的蛋白纯度具有重要意义。     

人抑癌基因PTEN的原核表达载体的构建及融合表达

为研究抑癌因子PTEN蛋白的抑癌机理,掏建了PTEN cDNA的原核表达载体并进行融合表达。将含有PTEN cDNA的质粒pMD-PTEN经EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切,回收PTEN基因片段与经相同酶切的高效原核表达载体pET-44a连接,经序列测定,证实融合型表达载体pET-Nus-PTEN构建成功。转化表达宿主BL21(DE3)后,IPTG诱导表达。经12％SDS-PAGE凝胶电泳,获得118kD的特异蛋白条带。目的蛋白占细菌总蛋白的17％。结果表明：PTEN基因和Nus基因融合表达成功,获得可溶性Nus-PTEN蛋白。该研究为PTEN蛋白的抑癌机理和基因工程药物的研究打下了基础,这是国内PTEN蛋白在原核细胞中成功表达的首次报道。     

转双抗虫基因烟草的研究

用改造的雪花莲凝集素基因GNAmm与合成的苏云金芽孢杆菌(Bt)毒蛋白cry1Ac基因构建了带有双价基因的植物表达载体,在该表达载体中这两个基因的转录分别受笋瓜PP2启动子(SPP2P)和CaMV 35S启动子的调控。通过根癌土壤杆菌介导转化法,获得了一批抗卡那霉素的转化再生烟草植株。PCR检测及基因组DNA Southern blot\,Slot blot杂交分析的结果表明Gna基因和Bt基因已整合到烟草总DNA中。用Bt毒蛋白抗血清进行Western blot分析,转基因植株均有Bt杀虫蛋白的不同程度的表达。对转化再生烟草的虫试结果表明,在所受试的19株烟草中60%的植株上的棉铃虫在5天内死亡率达到100%,而且存活幼虫的生长发育受到明显抑制;蚜虫抑制生长试验表明,多数转化再生植株具有较强的抗蚜活性,平均能够抑制桃蚜50%～60%的蚜口密度,有的高达80%以上。以上结果表明利用这两个改造过的抗虫基因可以获得既抗虫又耐蚜的转双抗虫转基因植物。     

几丁质酶基因与抗真菌蛋白基因、葡聚糖酶基因双价表达载体的构建及农杆菌工程菌株的重组

几丁质酶（Chitinase,Chi.)、β-1,3－葡聚糖酶（β－1,3－Glucanase,Glu.)和萝卜抗真菌蛋白（Rs-AFP2)是植物体内正常的表达产物,它们对防御植物的真菌病害具有重要的作用。基于它们在功能上具有协同作用,本研究利用基因工程技术构建了几丁质酶和抗真菌蛋白、几丁质酶和葡聚糖酶双价表达载体,通过农杆菌直接转化技术将双价表达载体转入农杆菌EHA105,最后采用PCR、DNA dot blotting技术对所获得的农杆菌工程菌株进行了鉴定分析。     

含融合杀虫基因和VHb基因双价表达载体的构建

目的：探索分子育种的新途径,获得高产多抗虫谱的转基因植物。方法：将密码子优化后的透明颤菌血红蛋白（vgbM）基因与融合杀虫基因（GFMcryIA＋CPTI）构建成双价基因植物高效表达载体pGBI4ABCVHB,基因表达盒中含2个增强子、35S启动子、Ω前导序列、Kozak序列、多联终止密码子及Nos终止子以及正确切割、加工序列、Poly（A）信号序列。结果：通过根癌农杆菌介导转化烟草,获得了转基因植株,结论：vgbM基因在转基因烟草中有效表达;融合杀虫基因也表达出活性毒蛋白。     

一种双顺反子表达载体的构建及应用的研究

将表达载体pEC34中的一段寡核苷酸序列,其中包括翻译增强子序列、SD序列、终止码、起始码及两端的限制性内切酶位点,插入GST基因后,构建成双顺反子的表达载体．利用此载体表达了非融合的人骨形成蛋白2A(hBMP2A)和人骨形成蛋白3(hBMP3)C端肽段,将第一顺反子基因（GST基因）切小到原来的1／3时,则位于下游的第二顺反子基因编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达量增加一倍。     

转植酸酶基因家蚕的制作及表达检测

家蚕Bombyx mori丝腺具有高效合成蛋白质的特性,开发在丝腺特异表达外源蛋白质的生物反应器具有重要的意义。本研究利用piggyBac来源的两种载体pPIGA3GFP和pBac{3×P3-EGFPaf},建立了稳定的家蚕转基因技术体系; 然后,利用一株黑曲霉来源的植酸酶基因,构建了在家蚕后部丝腺特异表达的融合表达载体pBac [3×P3-EGFP+ FibLphyADsRed],注射蚕卵后,在53个G1蛾区中检测到3个有荧光蚕的蛾区。经Southern blot和反向PCR验证,转基因表达盒整合到家蚕染色体上。RT-PCR结果显示,植酸酶基因特异性地在后部丝腺表达,其表达模式与家蚕轻链丝素基因一致。结果表明我们成功获得了在后部丝腺特异表达植酸酶融合蛋白的转基因蚕,这为进一步开发家蚕生物反应器,利用转基因蚕生产各种重组蛋白具有积极的促进作用。