KRT71决定羊驼毛弯曲度的形成

角蛋白71（Keratins 71,KRT71）属于人类Ⅱ型上皮角蛋白,是毛囊特异性的上皮角蛋白基因。相关研究表明,在其他物种中,KRT71与被毛卷曲相关,KRT71在卷曲的被毛形成过程中起着重要的作用。现眼观羊驼背部、耳部和腿部毛发的弯曲程度不同,但KRT71与其被毛的弯曲度是否相关尚不清楚。本研究利用PCR技术克隆KRT71基因全CDS区。通过实时荧光定量PCR技术检测基因的表达。免疫组化、Western 印迹对KRT71蛋白在羊驼背部、耳部和腿部皮肤组织中的表达量进行分析,以探讨KRT71与羊驼毛发弯曲度的关系。结果显示,羊驼的KRT71基因的CDS区共有1 578 bp,编码525个氨基酸;免疫组化结果显示,KRT71在羊驼的背部、耳部和腿部均有表达,并且主要特异性表达于毛囊的内根鞘;实时荧光定量PCR和Western印迹结果显示,KRT71的mRNA和蛋白量均呈现背部﹥腿部﹥耳部的趋势;相较于耳部,背部和腿部的表达量较高。实验结果提示,KRT71的表达量与毛纤维的弯曲度呈正相关,KRT71可能在羊驼毛纤维的弯曲度形成过程中发挥着一定的作用。     

Lef-1基因在棕色和白色羊驼皮肤差异表达

本实验旨在研究Lef-1在不同毛色羊驼皮肤中的表达和定位,探索其与毛色间的关系.采用实时荧光定量PCR、Western blotting以及免疫组织化学方法,研究白色和棕色羊驼皮肤中的mRNA、蛋白表达水平和定位.实时荧光定量PCR结果显示,Lef-1在棕色羊驼皮肤组织相对基因表达量是3.3727±0.1989,在白色羊驼皮肤组织是1.0003±0.0227; Western blotting结果显示,在羊驼皮肤组织总蛋白中存在分子量约44 KD与兔抗Lef-1多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,棕色羊驼平均蛋白表达量显著高于白色羊驼;免疫组织化学结果显示,在棕色羊驼皮肤组织中多表达在毛球部、表皮也有分布,在白色羊驼皮肤组织中多表达在表皮,在棕色和白色羊驼皮肤组织中外根鞘都有较强表达.结果显示Lef-1在棕色和白色羊驼皮肤的定位和含量存在差异,提示Lef-1可能影响了羊驼被毛颜色的形成.     

EDAR参与绵羊毛发性状与生长的调节

绵羊的背部、耳部和腹股沟部的毛发性状、生长速度存在差异,背部毛发弯曲、细长、密度高、生长速度快,耳部、腹股沟部毛发粗直、密度低、生长速度慢。研究表明,EDA/EDAR、IGFBP5/Krox 20、WNT等介导的信号通路及毛发角蛋白基因对毛发纤维弯曲的形成有重要的影响。本研究利用实时荧光定量PCR、原位杂交技术、Western 印迹和免疫组织化学等技术,对外异蛋白受体（ectodysplasin A receptor,EDAR）在绵羊背部、耳部和腹股沟皮肤中的mRNA、蛋白质表达水平和定位进行研究,以探讨EDAR与绵羊毛发的生长和性状的关系。实时荧光定量PCR结果显示,EDAR在绵羊背部皮肤中相对基因表达量是绵羊腹股沟皮肤的4.9倍(P＜ 0.01),耳部是腹股沟部的1.4倍（P＜0.05）,背部是耳部的3.4倍（P＜0.05）;原位杂交和免疫组化结果表明,EDAR基因mRNA和蛋白质在背部、耳部和腹股沟部毛囊均有表达。根据光密度值可知,背部表达量最高,耳部次之,而腹股沟部最低;Western 印迹结果显示,绵羊皮肤组织蛋白质提取物中存在与兔抗EDAR多克隆抗体发生免疫阳性反应的蛋白条带,绵羊皮肤背部平均蛋白质表达量最高,耳部次之,而腹股沟部最低,差异极显著(P ＜ 0.01)。研究结果提示,EDAR可能参与绵羊毛发卷曲的形成和调控,对毛发密度、生长速度等可能也有影响。     

青年羊驼耳部和背部皮肤组织中miRNA差异表达研究

羊驼是毛用型经济动物,其耳部和背部的毛发品质和生长速度存在差异.MicroRNA(miRNA)是新发现的一类在转录后水平调控基因表达的非编码RNA分子,为比较miRNA在羊驼耳部和背部皮肤的表达差异,从而探讨miRNA在羊驼皮肤和毛囊发育过程中的调控作用,本实验提取羊驼皮肤总RNA,制备了羊驼皮肤miRNA芯片,通过与Affymetrix多物种miRNA芯片跨物种杂交对耳部和背部皮肤的miRNA进行筛选,并通过实时荧光定量PCR进行了验证,同时利用在线生物信息软件预测miRNA靶基因.结果显示,羊驼耳部和背部皮肤中高表达差异2倍以上的miRNA有39个,实时荧光定量PCR检测let-7b和miR-24在2个部位皮肤中的差异表达量与miRNA基因芯片结果一致;预测到let-7b和miR-24的靶基因中包含有与毛囊生长发育和毛发品质相关的基因,提示这些miRNA可能参与羊驼皮肤和毛囊的生长发育、更新以及毛发品质的调控.     

酪氨酸酶与羊驼毛色相关性的研究

为揭示羊驼毛色形成机理以及毛用性状改良奠定基础,选用羊驼作为试验动物群体,以酪氨酸酶作为影响羊驼毛色性状的候选基因,采用荧光定量PCR技术、免疫组织化学、免疫印迹等生物学方法从基因与蛋白方面分析了羊驼酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)在不同毛色个体的表达量.荧光定量PCR结果显示TYR基因在棕色个体中的mRNA表...     

FLT4 调控羊驼黑色素细胞中黑色素生成

血管内皮素生长因子受体3（vascular endothelial growth factor receptor 3,VEGFR-3/FLT4）与黑色素瘤细胞的生长有关,其可能对毛色及黑色素生成有一定的调控作用。为探讨FLT4基因对羊驼毛色及黑色素生成的影响,本文采用免疫组织化学、qRT-PCR、Western印迹对FLT4在不同毛色羊驼皮肤毛囊中的表达进行了研究。结果显示,FLT4在不同毛色毛囊中外根鞘及毛乳头阳性表达不同,且棕色皮肤比白色皮肤阳性信号强;FLT4 mRNA在棕色羊驼皮肤的表达量明显高于白色羊驼皮肤 (P<0.01);FLT4蛋白在棕色皮肤中的表达量明显高于白色皮肤(P<0.01);为进一步研究FLT4对黑色素生成的影响;通过对体外培养的羊驼皮肤黑色素细胞中添加不同浓度的FLT4蛋白（0, 1, 10, 50, 100 ng/mL）,与对照组相比,添加FLT4蛋白后酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸相关蛋白-1(TYRP1)、受体酪氨酸激酶 c-KIT、小眼畸形相关转录因子(MITF)的 mRNA和蛋白质表达明显增加, 10 ng/mL组表达量最高(P<0.01);黑色素含量测定结果表明,不同浓度的FLT4蛋白处理的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素含量比对照组明显升高,添加FLT4蛋白10 ng/mL表达量最高(P<0.01)。由此可知,FLT4可以通过调节毛色相关基因的表达进而引起黑色素细胞中黑色素含量的变化。     

羊驼皮肤Scf基因的分子克隆、表达分析及组织学分布（英文）

干细胞因子(SCF)是一种生长因子,在黑素细胞迁移、细胞增殖和分化中发挥重要的调节作用。为了探讨SCF的分子特性及其在不同毛色羊驼皮肤中的表达模式,本研究通过PCR克隆羊驼Scf基因的全长编码区(CDS),并运用生物信息学预测其编码蛋白质特征;采用实时定量PCR (qRT-PCR)、Western印迹和免疫荧光分析SCF的表达模式和组织分布。结果表明,Scf编码区核苷酸为740 bp,编码1个246个氨基酸的前体蛋白质。该蛋白质包含1个跨膜区和1个信号肽,其二级结构核心是4个α-螺旋(αA,αB,αC和αD)和2条反平行的β-折叠链;序列比对和系统发育分析显示,羊驼SCF序列与猪、牛、羊同属于一个分支;棕色羊驼皮肤SCF表达显著高于白色羊驼,SCF蛋白主要位于毛囊基质与毛根鞘中,且Fontana-Masson染色显示,棕色羊驼皮肤中含有更多的黑色素颗粒。以上研究结果证实,在棕色羊驼毛皮肤中SCF的表达量和黑色素含量均高于白色羊驼毛皮肤,且SCF的高级结构与毛色形成密切相关。     

不同毛色绵羊皮肤中MC1R的差异表达及定位

MC1R基因与黑色素细胞的功能、皮肤的色素沉着和皮肤癌风险相关。本研究MC1R基因在不同毛色绵羊皮肤组织中的差异表达及定位,以探索MC1R基因对皮肤色素生成方面的重要作用,确定其与毛色形成的相关性。采用荧光定量PCR方法和免疫印迹方法分别检测不同毛色绵羊皮肤中MC1R基因m RNA水平和蛋白水平的表达差异;运用免疫组织化学法对不同毛色绵羊皮肤组织中的MC1R基因进行定位。荧光定量PCR结果显示MC1R m RNA在所有绵羊皮肤组织中都表达,在全黑绵羊皮肤中的相对表达量为537.91±150.36**,在花黑和花白绵羊皮肤中的相对表达量分别为27.95±9.3**和4.19±0.57**,而在全白绵羊皮肤中的相对表达量为1.03±0.27;免疫印迹结果显示所有绵羊皮肤组织蛋白中均存在与MC1R反应的阳性条带,MC1R在全黑绵羊皮肤组织中的相对蛋白含量为6.3±0.21**,在花黑和花白绵羊皮肤组织中的相对蛋白含量分别为2.74±0.24**和1.55±0.1**,而在全白绵羊皮肤组织中的相对蛋白含量为1±0.15;免疫组织化学结果显示MC1R蛋白主要表达部位为绵羊皮肤组织毛囊的基质、根鞘等区域。试验表明不同毛色绵羊皮肤组织均正常表达MC1R基因,但其表达水平存在差异,全黑绵羊皮肤中MC1R m RNA和蛋白的表达量显著高于其它三种毛色绵羊,综上可知MC1R基因影响绵羊黑白花毛色的形成,而且真黑素的合成依赖于MC1R的表达水平。     

显性白毛调控基因在不同毛色羊驼皮肤中表达差异的研究

为了研究KIT基因对羊驼毛色的影响及在不同毛色羊驼皮肤中的表达差异,实验在分析羊驼KIT基因结构的基础上,自行设计表达引物,将羊驼KIT基因exon10-exon14成功定向克隆入原核表达载体pET-32a( )中,构建了KIT基因的重组表达质粒pET-32a( )-KIT.同时进行诱导表达,并以纯化的重组蛋白为免疫原,采喟长程免疫程序免疫兔子,成功制备兔抗羊驼多克隆抗体,从而进行免疫组化分析.结果表明:(1)羊驼KIT基因exon10-exon14编码含138个氨基酸残基的蛋白;(2)SDS-PAGE电泳结果显示重组表达质粒pET-32a( )-KIT诱导下,表达的KIT蛋白为可溶性蛋白;(3)免疫组化研究表明,白毛色羊驼皮肤毛囊内根鞘周围组织有KIT蛋白的表达,外根鞘和结缔组织也有少量表达,而黄色羊驼皮肤毛囊周围即内外根鞘则不表达KIT蛋白.     

硬化蛋白基因在淇河鲫成鱼不同肌间骨相邻肌组织的表达差异分析

为探究硬化蛋白(sclerostin, SOST)基因在淇河鲫肌间骨不同分布位置中的作用,以淇河鲫成鱼为研究对象,对其肌间骨的形态与分布进行了统计,并在此基础上利用qRT-PCR技术检测SOST基因在淇河鲫背部和尾部肌肉中的mRNA表达,通过Western印迹和免疫组织化学技术检测SOST蛋白的表达定位情况。结果显示：淇河鲫肌间骨包括髓弓小骨和脉弓小骨,髓弓小骨为56～58根,位于淇河鲫背部肌肉的肌隔中,脉弓小骨27～28根,分布于泄殖孔之后的肌隔中。背部肌肉SOST的mRNA表达水平显著高于尾部肌肉（P < 0.05）。与mRNA表达水平相比,背部肌肉和尾部肌肉中SOST蛋白呈现相同表达趋势。免疫组织化学结果显示SOST在肌隔组织中特异性表达,并且在背部肌肉中的表达强烈,尾部肌肉中没有阳性反应。上述结果表明,SOST在淇河鲫肌间骨的背部和尾部肌肉中存在差异性表达,从而影响肌隔组织中肌间骨的骨化,对背部和尾部肌间骨形态发生产生影响。     

褪黑素对绒山羊皮肤FGF5等绒毛生长相关基因的影响

目的:旨在分析埋植褪黑素后对绒山羊皮肤绒毛生长相关基因表达的影响,进而探讨褪黑素促绒毛生长的机理。方法:以内蒙古白绒山羊为研究对象,选取体况相近的4月龄母羔羊10只,按试验要求随机分为2组,处理组按照2mg/kg BW(体重)的剂量每两个月耳后皮下埋植褪黑素,对照组不埋植,试验时间为1年。实验开始后每月采集绒山羊体侧皮肤和毛样,利用荧光定量PCR技术检测9个绒毛生长相关基因的表达变化。结果:(1)埋植褪黑素后各个基因的平均表达水平都有所上调,其中显著上调FGF5(P<0.0001),而对β-catenin、MSX-2、Wnt10b、BMP2、BMPRIB、NTRK3、Delta1、hairless等无显著影响(P>0.05);(2)埋植褪黑素明显提高了FGF5与hairless的相关性,并且使FGF5与β-catenin、NTRK3的相关性由负相关变成正相关,与Wnt10b的相关性降低,FGF5与其余4个基因的相关性变化不大。结论:结果提示,褪黑素上调绒山羊皮肤FGF的表达,影响FGF5与hairless、β-catenin、NTRK3之间的相关性;山羊中FGF5基因对被毛表型的作用与其他动物不同;褪黑素对复杂组织和单个细胞的作用不同;MAPK信号通路是受褪黑素影响最大的一个信号途径。推测褪黑素可能通过调节绒山羊皮肤中RORα来发挥作用,影响FGF5与hairless、β-catenin、NTRK3和Wnt10b等的相关性,同时抑制MSX2和BMP2的功能,进而促进绒毛的生长。     

FGF信号通路在内耳发育调控和毛细胞再生中的作用

内耳是感受听觉和平衡觉的复杂器官。在内耳发育过程中,成纤维生长因子(fibroblast growth factor, FGF)信号通路参与了听基板的诱导、螺旋神经节(statoacoustic ganglion, SAG)的发育以及Corti器感觉上皮的分化。FGF信号开启了内耳早期发育的基因调控网络,诱导前基板区域以及听基板的形成。正常表达的FGF信号分子可促进听囊腹侧成神经细胞的特化,但成熟SAG神经元释放的过量FGF5可抑制此过程,形成负反馈环路使SAG在稳定状态下发育。FGF20在Notch信号通路的调控下参与了前感觉上皮区域向毛细胞和支持细胞的分化过程,而内毛细胞分泌的FGF8可调控局部支持细胞分化为柱细胞。人类FGF信号通路异常可导致多种耳聋相关遗传病。此外,FGF信号通路在低等脊椎动物毛细胞自发再生以及干细胞向内耳毛细胞诱导过程中都起到了关键作用。本文综述了FGF信号通路在内耳发育调控以及毛细胞再生中的作用及其相关研究进展,以期为毛细胞再生中FGF信号通路调控机制的阐明奠定理论基础。     

Four independent mutations in the feline fibroblast growth factor 5 gene determine the long-haired phenotype in domestic cats

To determine the genetic regulation of "hair length" in the domestic cat, a whole-genome scan was performed in a multigenerational pedigree in which the "long-haired" phenotype was segregating. The 2 markers that demonstrated the greatest linkage to the long-haired trait (log of the odds > or = 6) flanked an estimated 10-Mb region on cat chromosome B1 containing the Fibroblast Growth Factor 5 (FGF5) gene, a candidate gene implicated in regulating hair follicle growth cycle in other species. Sequence analyses of FGF5 in 26 cat breeds and 2 pedigrees of nonbreed cats revealed 4 separate mutations predicted to disrupt the biological activity of the FGF5 protein. Pedigree analyses demonstrated that different combinations of paired mutant FGF5 alleles segregated with the long-haired phenotype in an autosomal recessive manner. Association analyses of more than 380 genotyped breed and nonbreed cats were consistent with mutations in the FGF5 gene causing the long-haired phenotype in an autosomal recessive manner. In combination, these genomic approaches demonstrated that FGF5 is the major genetic determinant of hair length in the domestic cat.     

miRNA-338-3p通过靶向抑制MC1R基因表达抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成

黑色素皮质素1受体MC1R）是在黑色素细胞内表达的G蛋白耦合受体（G protein coupled receptor, GPCR）家族成员,参与黑色素细胞中黑色素的生成。微RNAs（miRNAs）是一类非编码RNA,通过与靶基因3′-UTR结合抑制基因表达。已有研究证明,miR-338-3p 在多种人类肿瘤细胞中（过）表达,可通过下调靶基因表达抑制肿瘤细胞的侵袭迁移能力。然而,有关miR-338-3p对羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素合成影响却罕见报道。本研究证明,miRNA-338-3p通过靶向抑制MC1R基因表达,抑制羊驼黑色素细胞黑色素的生成。采用生物信息学预测MC1R基因是miRNA-338-3p的靶基因,其基因表达抑制羊驼黑色素细胞黑色素合成。随后构建miR-338-3p真核表达载体。其基因转染结合qPT-PCR和Western印迹结果揭示,与对照细胞比较,过表达miRNA-338-3p的羊驼黑色素细胞的MC1R基因,及其下游与黑色素生成相关的小眼相关性转录因子（MITF)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相关蛋白1（TYRP1）、酪氨酸酶相关蛋白2（TYRP2）编码基因mRNA及蛋白质表达水平明显下调。酶联免疫吸附分析显示,过表达miRNA-338-3p的羊驼皮肤黑色素细胞的黑色素产量,较对照细胞显著下降（P＜0.01）。综上结果,miR-338-3p可通过抑制靶基因MC1R表达,下调其下游基因MITF、TYR、TYRP1和TYRP2基因的表达,从而抑制羊驼皮肤黑色素细胞黑色素的合成。miRNA-338-3p在羊驼生长发育过程中,是否参与调控体内皮肤黑色素细胞的黑色素生成尚待进一步研究。