西瓜食酸菌RND蛋白家族外排转运体cusB基因抗铜功能研究

【目的】研究RND外排泵中cus B基因突变对西瓜食酸菌抗铜性的影响。【方法】采用Tn5转座子随机插入基因组制备筛选得到突变体,通过双亲杂交的方法构建功能互补菌株,并从西瓜食酸菌抗铜性、胞外纤维素酶和胞外蛋白酶分泌、胞外多糖产生、生物膜形成、致病性及过敏性反应等方面阐明RND外排泵中MFP蛋白亚基对西瓜食酸菌的影响。【结果】突变体Δcus B在含有1.25 mmol/L或2.5 mmol/L Cu SO4的KMB平板上不能生长,cus B基因的突变导致西瓜食酸菌的胞外多糖分泌和生物膜形成与野生型有差异,但不影响胞外纤维素酶、胞外蛋白酶、致病性及过敏性反应。【结论】RND外排泵相关基因cus B的突变会影响西瓜食酸菌的某些生物学特性,并导致病菌对铜十分敏感。研究以RND外排泵转运重金属为导向初步解析了西瓜食酸菌的抗铜机制。     

西瓜食酸菌与黄瓜互作转录组分析

【背景】细菌性果斑病是一种严重的种传细菌病害,其病原菌为西瓜食酸菌。截至目前对该病病原菌与寄主的互作机制认识极为有限。葫芦科的模式植物黄瓜易被西瓜食酸菌侵染发病,对西瓜食酸菌-黄瓜互作体系进行转录组分析,可以为探究西瓜食酸菌与寄主互作机制奠定重要基础。【目的】解析西瓜食酸菌-黄瓜互作时的相互响应规律。【方法】以细菌悬液注射接种6d黄瓜子叶,处理48 h的子叶作为转录组测序样本。利用RNA-Seq技术分析西瓜食酸菌FC440菌株与黄瓜9930品种互作时基因的表达特征。【结果】测序数据质量分析发现,各样品不同重复间相关性较强,与参考基因组比对率达95%以上,聚类分析发现对照组与处理组表达模式相反,样品处理达到一定效果,表明数据整体质量较高。选取6个差异表达基因进行RT-qPCR验证,结果显示6个基因的表达模式与转录组结果基本一致,表明转录组测序结果比较可靠。西瓜食酸菌和黄瓜互作48 h后,在转录组水平分别检测到1 618个和8 698个差异表达基因。Gene Ontology (GO)功能注释显示,细菌的差异基因显著富集在细胞组分中的细胞膜(37.5%)和膜部分(27.0%),生物过程中的氧化还原过程(66.7%)以及分子功能中的水解酶活性(66.5%);黄瓜的差异基因显著富集在细胞组分中的质体(22.2%)和叶绿体(21.3%),分子功能中的催化活性(70.0%)以及生物过程中的碳水化合物衍生物代谢(32.2%)。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)分析显示,细菌中致病相关基因显著富集在群体感应及细菌趋化性途径,而且群体感应系统基因下调更显著。黄瓜中调控钙依赖蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinase,CDPK)、钙调素和类钙调素(Calmodulin and Calmodulin-Like,CaMCML)及呼吸氧暴发激酶(Respiratory Burst Oxidase Homologne,Rboh)的基因总体上调,调控苯丙氨酸裂解酶(Phenylalanine Ammonia-Lyase,PAL)的基因和谷胱甘肽S-转移酶(Glutathione S-Transferase,GST)的基因在相应代谢途径中数量最多且上调程度明显。【结论】获得较高质量的西瓜食酸菌与黄瓜互作的转录组测序结果。群体感应与西瓜食酸菌FC440菌株致病力密切相关;寄主黄瓜应对西瓜食酸菌侵染以Ca~(2+)信号激活的防御反应为主。PAL和GST在黄瓜抵抗西瓜食酸菌侵染中发挥重要作用。本研究为进一步深入解析西瓜食酸菌与寄主互作的机制奠定了基础。     

PA2580基因与铜绿假单胞菌环境压力耐受性相关

【目的】研究铜绿假单胞菌PAO1 PA2580基因的功能。【方法】构建了PA2580的敲除突变体及突变体互补体,通过最小抑制浓度测定、基因启动子活性检测、蛋白体外表达纯化等方法,对PA2580基因的功能进行了深入的研究。【结果】PA2580突变体对羧苄青霉素、氯霉素、环丙沙星的敏感性增强。PA2580基因的表达还受到不同种类的低于抑制浓度的抗生素的调节。PA2580蛋白产物以NADPH为电子供体,能够高效还原多种醌类物质。此外,PA2580突变体对过氧化氢敏感性增加,过氧化氢酶编码基因在PA2580突变体中的表达降低,表明PA2580与铜绿假单胞菌氧化压力耐受性相关。【结论】PA2580产物是NADPH-醌类的还原酶,其功能与铜绿假单胞菌对环境压力的耐受密切相关。     

西瓜食酸菌Ⅲ型效应蛋白AopBF1的鉴定与功能分析

【背景】细菌性果斑病（bacterial fruit blotch,BFB）是一种发生在葫芦科作物上的检疫性病害,其病原菌为西瓜食酸菌（Acidovorax citrulli）,西瓜食酸菌通过Ⅲ型分泌系统（type Ⅲ secretion system,T3SS）将重要的致病因子Ⅲ型效应蛋白（type Ⅲ effector,T3E）转运到植物体内,从而致病。目前,对于T3E致病机制的认识非常有限。课题组前期已鉴定到西瓜食酸菌FC440菌株中的一些候选T3E。【目的】明确西瓜食酸菌FC440菌株候选T3E中AopBF1的序列特征、转运特性及其在病原菌致病过程中的作用,可以为深入解析病原菌致病机制奠定理论基础。【方法】利用生物信息学手段,预测分析AopBF1的T3E序列特征;通过RT-qPCR、无毒蛋白报告系统检测AopBF1所受调控及其转运特性;观察aopBF1突变体（插入突变）及过表达时西瓜食酸菌的致病力表型,分析AopBF1对西瓜食酸菌致病性的贡献。【结果】AopBF1具有T3E的序列特征、不含保守结构域,具有蛋白激酶序列特征;AopBF1在T3SS核心调控基因hrpX、hrpG突变株中的表达量显著降低;当aopBF1基因与AvrBs1功能区（59-445 aa）片段同时于avrBs1突变株中表达时,能够诱发含Bs1蛋白的ECW-10R辣椒叶片发生过敏性坏死反应;aopBF1突变株对寄主黄瓜的致病力显著减弱,而同时黄瓜组织中过氧化氢、超氧阴离子自由基及胼胝质的积累量表现为显著增加;AopBF1过表达菌株对寄主的致病力显著增强,其在诱导本氏烟的hypersensitive response （HR）反应发生上表现延迟;AopBF1瞬时表达时,显示定位于本氏烟细胞的细胞质、细胞核和细胞膜,可诱发本氏烟发生HR反应,促进PAMP-triggered immunity （PTI）及激素通路相关基因的表达。【结论】AopBF1是西瓜食酸菌的一个具有蛋白激酶特征的T3E,抑制寄主活性氧和胼胝质积累等PTI免疫反应以促进西瓜食酸菌的致病,激发含R抗性蛋白的本氏烟的PTI和激素相关抗病免疫反应。     

西瓜食酸菌Ⅲ型分泌效应物基因aopW功能初步分析

【背景】细菌性果斑病(bacterial fruit blotch,BFB)是葫芦科植物上一种严重的检疫性病害,其病原菌为西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli)。目前已知Ⅲ型分泌效应物(typeⅢsecreted effectors,T3SEs)是该病菌的关键致病因子,但对其效应物功能和作用机制的认识非常有限。【目的】鉴定西瓜食酸菌Ⅲ型分泌效应物基因aopW,分析其编码蛋白质影响植物免疫的方式,为更深入地认识该基因在西瓜食酸菌致病机制中的作用奠定基础。【方法】利用生物信息学分析其序列特征;借助荧光定量PCR技术分析aopW的表达调控及其与抗病相关基因表达间的关系;利用基因突变及基因功能互补手段,通过分析致病性、寄主活性氧积累量等解析基因功能;采用瞬时表达技术了解AopW诱导非寄主hypersensitive response (HR)能力及其亚细胞定位情况。【结果】aopW基因启动子区存在Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)核心基因结合位点,其编码的蛋白不存在信号肽和跨膜螺旋区,与Ⅲ型分泌效应物harpin蛋白同源;T3SS核心基因hr...     

谷胱甘肽对铜绿假单胞菌exoS 和exoY基因的影响

摘要: 【目的】研究谷胱甘肽对铜绿假单胞菌exoS和exoY基因表达的影响。【方法】利用丁硫氨酸亚砜胺和马来酸二乙酯同时耗竭细胞内的谷胱甘肽,并构建包含被lacZGm破坏的谷胱甘肽合成酶基因的突变体。通过分别连有exoS 和exoY基因启动子的pMS402质粒上Lux报道子发光值大小检测exoS 和exoY基因表达变化情况。【结果】exoS和exoY基因的表达在用化学药品耗竭的细胞中或是在谷胱甘肽合成酶突变体中都降低。【结论】铜绿假单胞菌细胞内的谷胱甘肽可以促进exoS和exoY的表达。这将为进一步研究铜绿假单胞菌的感染以及致病性机理提供一定的理论基础。     

铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学分析

【背景】铜绿假单胞菌为革兰氏阴性杆菌,是医院感染的常见条件致病菌之一。广泛存在于细菌中的第二信使分子环鸟苷二磷酸(cyclic-di-guanosine monophosphate,c-di-GMP)对细菌生理生化功能具有重要的调节作用。铜绿假单胞菌PAO1中存在参与c-di-GMP代谢的基因PA2072。【目的】探讨铜绿假单胞菌PAO1中c-di-GMP代谢相关基因PA2072的生物学功能。【方法】运用PCR及分子克隆技术构建PA2072基因及各结构域的自杀载体,运用基因敲除方法获取PA2072基因的3个突变株;利用泳动性(swimming)、蜂群运动(swarming)、蹭行运动(twitching)和生物膜定量实验对细菌进行初步的表型分析,进一步通过刚果红染色法对菌株进行分析。【结果】成功构建PA2072基因敲除突变菌株及回补菌株;生物膜定量结果发现基因PA2072的敲除会影响细菌生物膜的形成,PA2072蛋白的不同结构域对生物膜的合成也起到了重要作用;细菌运动能力检测中发现PA2072相关基因的敲除对细菌运动能力也有一定影响。刚果红平板检测结果显示,与野生型PAO1菌株相比,P...     

异油酸含量对铜绿假单胞菌群集运动能力的影响

摘要:【目的】研究铜绿假单胞菌的脂肪酸组成对群集运动(swarming)的影响及可能的原因。【方法】通过双交换原理敲除铜绿假单胞菌PAO1脂肪酸合成的一个重要基因fabF,构建fabF缺失突变体;构建pUCP18Gm-fabF质粒大量表达FabF,对缺失体进行回补。比较野生型、缺失体和回补后菌株的swarming能力。利用气相色谱分析野生型、缺失体和回补后菌株的脂肪酸组成变化,以揭示FabF表达影响swarming能力的可能原因。【结果】获得了假单胞菌的fabF缺失突变体YFF-1,证实了fabF敲除后假单胞菌的 swarming能力消失,fabF回补后细菌的swarming能力得以恢复。气相色谱结果显示,突变后脂肪酸组成发生明显变化,异油酸(C18:1 Δ11)含量由33.6%急剧下降至8.9%,不饱和脂肪酸:饱和脂肪酸(USA:SFA)也由0.96下降至0.74;fabF回补后,异油酸含量恢复至20.9%,USA:SFA也上升至1.09。【结论】铜绿假单胞菌fabF基因的表达水平对细菌的swarming能力具有重要影响,突变体中异油酸含量的下降及脂肪酸不饱和程度的降低(尤其是异油酸含量的急剧下降),可能是YFF-1 swarming能力消失的重要原因。     

群体感应淬灭酶克隆表达及其对铜绿假单胞菌的影响

【背景】由于抗生素的大量使用,导致细菌耐药性越来越强,寻找新的抗细菌感染药物成为研究热点。【目的】克隆表达群体感应淬灭酶,探究其对铜绿假单胞菌毒力及致病性的影响。【方法】利用PCR技术从产群体感应淬灭酶的芽孢杆菌QSI-1基因组DNA中克隆出aiiA基因,将其克隆到表达载体pET30a并导入大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达,通过镍柱亲和层析获得纯化的N-酰基高丝氨酸内酯酶。用不同浓度的淬灭酶作用于铜绿假单胞菌,检测其对铜绿假单胞菌毒力因子产生以及生物膜形成能力的影响;以秀丽隐杆线虫为模型,考察其对线虫感染铜绿假单胞菌存活率的影响。【结果】克隆表达出群体感应淬灭酶,该酶能显著抑制铜绿假单胞菌毒力因子产生和生物膜的形成,并能降低铜绿假单胞菌对感染线虫的致死率。【结论】群体感应淬灭酶可作为一种能高效抑制细菌致病性的物质,为临床治疗细菌性感染提供新的策略。     

对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响及其相关机制

【目的】研究对硝基苯酚(PNP)对大肠杆菌和铜绿假单胞菌产生持留菌的影响,并对转录组进行分析,阐明对硝基苯酚影响持留菌形成的相关机制。【方法】采用氧氟沙星抗生素探究对硝基苯酚对细菌产生持留菌的影响,并通过检测细菌自溶情况和呼吸抑制剂羰酰氰氯苯腙(CCCP)对持留菌比例的影响,然后通过转录组分析其相关基因的表达,最后通过实时荧光定量PCR和反义核酸进行相关功能基因的验证。【结果】PNP可以通过抑制大肠杆菌和铜绿假单胞菌的呼吸作用使其产生持留菌的比例增加,PNP不同浓度、作用不同时间和作用不同生长时期的菌体都会影响细菌产生持留菌的比例。PNP和呼吸抑制剂CCCP均能够抑制2个菌体的自溶情况,包括溶解氧含量的变化、蛋白质降解情况、细胞尺寸的变化和RNA完整性。转录组分析和实时荧光定量PCR实验结果表明加入PNP后,cyo A、app C两个基因在大肠杆菌和铜绿假单胞菌中的表达量均显著下降,再通过反义核酸抑制cyo A、app C的表达发现持留菌的比例和原始菌株相比均有所增加。【结论】PNP可以通过抑制细胞呼吸作用来增加细菌产生持留菌的比例。     

pagP基因对禽致病性大肠杆菌抗菌肽抗性和致病性的影响

【目的】禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)不仅严重影响全球的养禽业,对人类公共健康也造成巨大的潜在威胁。pag P基因在细菌的抗菌肽抗性和致病性方面发挥重要作用,但关于pag P基因在APEC中的功能尚不清楚。本文构建禽致病性大肠杆菌pag P基因缺失株,对缺失株的抗菌肽抗性和致病性进行研究。【方法】利用Red重组系统构建APEC的pag P基因缺失株,然后利用回复质粒构建回复株。研究pag P基因对细胞黏附与入侵、生物被膜形成能力、外膜渗透性、抗菌肽敏感性、致病性等方面的影响。【结果】成功构建pag P基因缺失株和回复株,抗菌肽抗性试验发现pag P基因缺失株对多粘菌素B、鸡β-防御素2(AVBD2)的敏感性显著增加(P0.01),致病性试验结果表明pag P基因缺失株的毒力显著降低(P0.01)。【结论】APEC的pag P基因对AVBD2的敏感性和APEC的致病性密切相关,为深入研究pag P基因的功能及调控作用奠定了基础。     

瓜类细菌性果斑病菌组氨酸营养缺陷型与致病性相关

摘要: 瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli,Ac)是近年来发生在西瓜、甜瓜等葫芦科植物上的一种重要病原细菌。它主要危害西瓜、甜瓜,引起叶斑或叶枯,造成果实腐烂,严重时导致绝产。【目的】验证组氨酸的合成缺陷与Ac 的致病性之间的关系。【方法】采用Mini-Tn5 转座子随机插入方法,从瓜类细菌性果斑病菌xjl12 突变体文库中筛选突变体,并通过亚克隆技术对基因进行鉴定。【结果】筛选到一株在烟草上失去过敏反应且致病性降低的突变体。鉴定其为hisC(histidinol-phosphate aminotransferase) 基因的突变体。同时也对Ac 中组氨酸合成过程中的另外3 个酶(hisA、hisB 和hisD 基因) 进行了研究。这些基因突变后均丧失了激发烟草过敏性反应的能力,致病性明显下降,发病时间比野生型延迟了约48 h,通过外源添加组氨酸可恢复其突变特征。【结论】这些基因的突变所致性状改变与组氨酸的合成缺陷直接相关。     

The independent cue and cus systems confer copper tolerance during aerobic and anaerobic growth in Escherichia coli

Copper is essential but can be toxic even at low concentrations. Coping with this duality requires multiple pathways to control intracellular copper availability. Three copper-inducible promoters, controlling expression of six copper tolerance genes, were recently identified in Escherichia coli. The cue system employs an inner membrane copper transporter, whereas the cus system includes a tripartite transporter spanning the entire cell envelope. Although cus is not essential for aerobic copper tolerance, we show here that a copper-sensitive phenotype can be observed when cus is inactivated in a cueR background. Furthermore, a clear copper-sensitive phenotype for the cus system is revealed in the absence of O(2). These results indicate that the cue pathway, which includes a copper exporter, CopA, and a periplasmic oxidase, CueO, is the primary aerobic system for copper tolerance. During anaerobic growth, however, copper toxicity increases, and the independent cus copper exporter is also necessary for full copper tolerance. We conclude that the cytosolic (CueR) and periplasmic (CusRS) sensor systems differentially regulate copper export systems in response to changes in copper and oxygen availability. These results underscore the increased toxicity of copper under anaerobic conditions and the complex adaptation of copper export in E. coli.     

Transcriptional activation of an Escherichia coli copper efflux regulon by the chromosomal MerR homologue, cueR

Because copper ions are both essential cofactors and cytotoxic agents, the net accumulation of this element in a cell must be carefully balanced. Depending upon the cellular copper status, copper ions must either be imported or ejected. CopA, the principal copper efflux ATPase in Escherichia coli, is induced by elevated copper in the medium, but the copper-sensing regulatory factor is unknown. Inspection of the copA promoter reveals signature elements of promoters controlled by metalloregulatory proteins in the MerR family. These same elements are also present upstream of yacK, which encodes a putative multi-copper oxidase. Homologues of YacK are found in copper resistance determinants that facilitate copper efflux. Here we show by targeted gene deletion and promoter fusion assays that both copA and yacK are regulated in a copper-responsive manner by the MerR homologue, ybbI. We have designated ybbI as cueR for the Cu efflux regulator. This represents the first example of a copper-responsive regulon on the E. coli chromosome and further extends the roles of MerR family members in prokaryotic stress response.     

Acidovorax citrulli: generating basic and applied knowledge to tackle a global threat to the cucurbit industry

Acidovorax citrulli is the causal agent of bacterial fruit blotch (BFB) of cucurbit plants. In recent years, the disease has spread to many parts of the world, mainly via the inadvertent distribution of contaminated commercial seeds. Because of the costly lawsuits filed by growers against seed companies and the lack of efficient management methods, BFB represents a serious threat to the cucurbit industry, and primarily to watermelons and melons. Despite the economic importance of the disease, little is known about the basic aspects of A.?citrulli pathogenesis. Nevertheless, the release of the genome of one A.?citrulli strain, as well as the optimization of molecular manipulation and inoculation methods, has prompted basic studies and allowed advances towards an understanding of A.?citrulli pathogenicity. In this article, we summarize the current knowledge about this important pathogen, with emphasis on its epidemiology and the factors involved in its pathogenicity and virulence. TAXONOMY: Bacteria; Betaproteobacteria; order Burkholderiales; family C omamonadaceae; genus Acidovorax; species citrulli. MICROBIOLOGICAL PROPERTIES: Gram-negative, strictly aerobic, rod-shaped; average dimensions of 0.5?μm × 1.7?μm; motile by means of an ～5.0-μm-long polar flagellum; colonies on King's medium B are round, smooth, transparent and nonpigmented; optimal temperatures for growth around 27-30?°C; induces a hypersensitive response on nonhost tobacco and tomato leaves. HOST RANGE: Acidovorax citrulli strains are pathogenic to various species of the Cucurbitaceae family, including watermelon, melon, squash, pumpkin and cucumber. Significant economic losses have been reported in watermelon and melon. DISEASE SYMPTOMS: Watermelon and melon seedlings and fruits are highly susceptible to A. citrulli. Typical seedling symptoms include water-soaked lesions on cotyledons that are often adjacent to the veins and later become necrotic, lesions on the hypocotyl, and seedling collapse and death. On watermelon fruits, symptoms begin as small, irregular, water-soaked lesions which later extend through the rind, turn brown and crack. On melon fruits, symptoms are characterized by small, often sunken rind lesions and internal fruit decay. Symptoms on the leaves of mature plants are difficult to diagnose because they are often inconspicuous or similar to those caused by other biotic or abiotic stresses. When they occur, leaf lesions can spread along the midrib and main veins. Lesions appear dark-brown to black on watermelon and light to reddish-brown on melon. USEFUL WEBSITES: Bacterial fruit blotch of cucurbits at APSnet, http://www.apsnet.org/edcenter/intropp/lessons/prokaryotes/Pages/BacterialBlotch.aspx; bacterial fruit blotch guide from ASTA, http://www.amseed.com/pdfs/DiseaseGuide-BFB-English.pdf; Acidovorax citrulli AAC00-1 genome at JGI, http://genome.jgi-psf.org/aciav/aciav.info.html.