中国香菇种质资源中两种主要病毒的携带情况检测

香菇病毒病通常具有潜隐性特征,携带病毒的香菇菌株往往并不表现出明显症状,但一旦爆发常造成较大经济损失。本文采用RT-PCR检测技术,系统分析了中国香菇野生种质及栽培种质中两种主要病毒Lentinula edodes mycovirus HKB（LeV-HKB）和L. edodes partitivirus 1（LePV1）的携带情况。对来源于中国主要栽培省（市）的90个香菇栽培菌株的检测结果表明,有67.8%（61/90）的供试菌株单独或复合感染有LeV-HKB和LePV1中的1种或2种,LeV-HKB病毒携带率56.7%（51/90）,明显高于LePV1 35.6%（32/90）;栽培菌株两种病毒的复合感染率为24.4%（22/90）。对地理来源几乎覆盖整个中国的125个野生菌株的检测结果表明,有75.2%（94/125）的供试菌株至少感染了LeV-HKB和LePV1中的1种,8.8%（11/125）野生菌株同时感染了两种病毒,且野生菌株中LePV1病毒携带率70.4%（88/125）明显高于LeV-HKB 13.6%（17/125）。栽培菌株和野生菌株中LeV-HKB和LePV1病毒的存在与否与菌株地理来源没有明显相关性,显示香菇病毒极可能通过担孢子在自然界广泛传播。本研究为开展香菇菌种病毒病快速检测,从源头控制香菇病毒病传播,追踪病毒病的发生流行规律奠定了基础。     

中国香菇核心种质真菌病毒多样性检测及其携带特点分析

【背景】香菇病毒通常具有潜隐性特征,携带病毒的香菇菌株往往并不表现出明显症状,然而一旦发生常造成较大的经济损失。【目的】解析中国香菇核心种质中真菌病毒多样性特点。【方法】以56个中国香菇核心种质为试验材料,采用RT-PCR和RT-qPCR检测技术对34种香菇病毒携带情况进行检测和分析。【结果】研究结果表明,分别有14种和5种香菇病毒的目标基因在绝大多数阳性菌株中扩增出较亮和较暗的条带,RT-qPCR结果也表明阳性带毒香菇菌株中病毒目标基因的扩增结果与病毒含量呈正相关,即病毒在阳性菌株中的含量越高则病毒扩增条带越亮;被检测的34种香菇病毒中,LeFV5和LeMV1检测率为100%;21个栽培种质和35个野生种质中分别有8种和6种香菇病毒检测率为80%以上,而且其中4种病毒相同(LeDFV2、LeFV2、LeSV和LeHV2);栽培菌株和野生菌株携带病毒数分别为8-21种和9-23种,平均每个菌株携带16.4种和16.7种。【结论】香菇种质资源中普遍携带复杂的多种真菌病毒,被检测的病毒在阳性菌株中扩增亮度不同,而且存在明显遗传差异的香菇菌株中携带的一些高检测率病毒相似,暗示这些病毒在香菇进...     

高效草菇分子标记辅助杂交育种方法的建立与应用

【目的】建立一种高效草菇分子标记辅助杂交育种方法,并将其应用于选育低温高产草菇的单孢杂交中。【方法】通过出菇试验筛选获得高产草菇菌株,与低温出菇菌株VH3一同作为杂交亲本;采用交配型基因分子标记区分草菇单孢子的交配型,并完成杂交配对工作;最后结合快速筛选耐低温草菇菌种技术与杂交子真实性的鉴定方法,在栽培出菇试验前剔除部分不耐低温的草菇杂交子。【结果】出菇试验表明,屏优1号的生物转化率最高,用作杂交育种的高产亲本菌株。单孢杂交配对后,最初的496株草菇可能杂交菌株经初筛后,只剩余172株较耐低温的杂交菌株,使后期出菇试验的工作量减少了65%;杂交子出菇试验表明,在28 °C出菇温度下,VV093杂交菌株的生物转化率显著高于两个亲本菌株,且农艺性状较好。【结论】建立了一种高效草菇分子标记辅助杂交育种的方法,包括亲本菌株的筛选、单孢交配型的区分、单孢杂交、杂交子的鉴定和筛选等,并在低温高产草菇单孢杂交育种中成功应用。     

利用SSR标记鉴定香菇单核体及杂交后代

【目的】研究简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)分子标记方法用于香菇原生质体单核体、孢子单核体及其杂交后代的分离和鉴定。【方法】利用基于香菇全基因组序列信息开发的SSR标记,分析由香菇品种"L808"双核菌丝制备的原生质体单核体、孢子单核体及其杂交后代的SSR指纹。【结果】对制备的原生质体单核体的鉴定中,在不经过杂交配对的情况下,鉴定出"L808"的两种不同极性的原生质体单核体,其分离比例为191:1,该鉴定结果得到SSR标记、随机扩增多态性DNA(Random amplified polymorphismic DNA,RAPD)标记及传统方法的验证。另外,开发的香菇SSR标记还能以多位点组合的方式,用于对孢子单核体及其杂交后代的鉴定。【结论】应用SSR标记可加快香菇单核体的制备进程,并提高鉴定单核体及相关杂交菌株的准确性,促进香菇遗传育种研究。     

利用地域野生资源创制地方适栽的优质香菇新品种

香菇是我国深受欢迎的食药用菌,产量居食用菌产业之首。为拓宽栽培香菇菌株的遗传背景,解决现有主栽香菇菌株种性退化的问题,本研究以香菇‘808’菌株与3个香菇野生资源、3个栽培菌株（辽抚4号、BY1和荷香）开展单-双杂交育种,开发适合当地栽培环境的主栽品种。研究结果显示：在270对单-双杂交组合中,通过锁状联合观察和与亲本的拮抗试验,鉴定出89个杂交子,进一步通过栽培试验筛选出10个性状相对优良的候选菌株;最终通过农艺性状对比试验,筛选出ZJXG 5和ZJXG 8两个优良杂交菌株,这两个菌株均以当地长白山野生资源S1和本地主栽菌株BY1为双核杂交亲本选育而来,表现出超亲显著、菇形圆整、颜色呈浅褐色的特性,前4潮生物学效率在86%-88%之间。本研究结果揭示,在香菇杂交育种中,当亲本菌株来源地域与杂交后代菌株筛选地域相近时,单双杂交亲和率、杂交菌株的出菇率和丰产性指标较高,这提示我们,利用当地野生香菇资源更有利于创制适合当地自然环境的地方品种。     

有性杂交选育银耳优良菌株的初步研究

为了解决银耳栽培生产中存在菌株优良性状单一,生产效率较低等问题,采用银科1#和Tr21两个不同品种菌株为亲本菌株,通过单孢子分离选取50个有性孢子单核体、两两配对有性杂交试验,显微观察镜检鉴定,统计杂交成功率为36%、杂交菌株与亲本的拮抗试验选育出7株杂交株,栽培对比农艺性状评价选育出1株(GT3)比亲本菌株生长快,生物转化率较高的菌株。试验结果表明有性杂交育种可作为一种行之有效的筛选银耳优良菌株的方法。     

中国香菇种质资源中主要真菌病毒的多重RT-PCR检测技术

【背景】病毒是食用菌生产上较重要的一类潜在隐患。我们在前期的研究中发现,中国香菇(Lentinula edodes)种质资源中最常见的病毒有2种,分别为L. edodes partitivirus 1 (LePV1)和L. edodes mycovirus HKB (LeV-HKB)病毒,这2种病毒能单一或复合感染香菇。【目的】建立香菇种质主要病毒的快速检测技术,提高香菇病毒检测效率,降低检测成本。【方法】依据香菇β-actin基因及病毒LePV1和LeV-HKB编码依赖RNA的RNA复制酶(RdRp)基因序列分别设计引物,以复合感染了这2种香菇病毒的菌丝体为材料,对影响RT-PCR反应的主要因素模板浓度、引物浓度、dNTPs浓度、退火温度和循环次数等进行优化筛选,建立同时检测LeV-HKB病毒(LeV-HKB相关病毒)和LePV1病毒的多重RT-PCR检测技术。【结果】模板浓度、退火温度和循环次数对多重RT-PCR检测结果均有较大影响,而引物浓度和dNTPs浓度对检测结果的影响较小。所建立的多重RT-PCR技术在香菇核心种质病毒检测中表现为扩增目标条带清晰分明,检测结果与单重RT-PCR检测结果一致。对两种病毒的多重RT-PCR产物进行了序列测序,结果表明扩增片段序列与目标基因序列相似性在99%以上。【结论】所建立的多重RT-PCR检测体系具有较好的特异性与适用性,为室内和田间香菇病毒早期检测、病害流行的监测提供了技术储备。     

利用酯酶同工酶技术检测香菇双单杂交后代

选用香菇的野生株Ｑ 与栽培株苏香的四种孢子单核体进行完全亲和双单杂交,运用拮抗试验并辅以液体出菇试验初步鉴定出１２ 个杂交后代,且对杂交后代酯酶同工酶进行了检测,并以聚类分析方法分析了菌株间酯酶同工酶酶谱的结果,较直观本质地反映了杂交后代及其与亲本之间的遗传差异,表明１ —１２ 号菌株是真正的双单杂交后代,认为菌株间酯酶同工酶酶相似系数值可以作为香菇遗传育种选择亲本的辅助的遗传标记     

香菇交配型因子次级重组体的鉴定

对13个香菇菌株的担孢子后代进行了交配型分析,其中8个菌株非亲和反应与亲和反应之比与预期的3∶1的比例无显著差异。另外5个菌株非亲和反应与亲和反应之比不符合3∶1,其中4个菌株在0.05显著水平的X2值仅略高于理论值,而另一菌株HL01具有特殊的表现,其单核体132个随机配对的非亲和反应与亲和反应之比为82∶50,X2值显著偏离3∶1的临界值。用4个标准测试菌株鉴定了来自HL01同一子实体的189个孢子单核体的交配型,在189个单核体中,161个单核体归于4种正常交配型(A1B1,A2B2,A1B2,A2B1)之一。而另外28个可能源于次级重组的单核体可分成另外4个类群。通过以所有可能的组合进行配对杂交,进一步分析了28个单核体的交配型。结果表明,次级重组同时在A因子和B因子中发生,重组值分别为8.5%和11.6%。A因子至少由2个亚基组成而B因子可能由不止2个亚基组成。随后的出菇试验表明,至少含有1个重组体的所有可亲和配对均具有结实能力。     

香菇自然群体中个体间的空间分布及其遗传联系

应用体细胞不亲和性反应、交配型因子分析和基因组DNA的RAPD分析,研究了一个分布于方圆约1km的6根倒木上的18个香菇野生菌株间的遗传差异。结果表明,该群体大多数菌株间配对（80．4％）体细胞不亲和,而同一倒木菌株间配对的体细胞亲和率达62．5％。不同倒木菌株间未发现体细胞亲和的配对。该群体存在11个特异的A因子和7个特异的B因子。同一倒木的菌株有的交配型因子相同,有的则不同。不同倒木的菌株大多数交配型因子不同,未发现交配型因子完全相同的菌株。RAPD分析显示,体细胞亲和的菌株,交配型因子完全相同的菌株,在基于DNA相似系数的遗传相关聚类中,首先聚为小类。总起来看,在自然群体中,香菇个体间的遗传差异与其空间分布之间存在一定的联系,随着空间距离的增大,菌株间的异质性相应增高。     

香菇杂交子农艺性状与差异基因表达类型的相关性研究

以香菇(Lentinula edodes)4个菌株为亲本组成3个杂交组合,采用单孢菌株配对获得杂交子,观察锁状联合鉴别出真正的杂交子,测定杂交子及其亲本的农艺性状。在每个杂交组合中分别各选取3个杂交子,研究杂交子和亲本在子实体发育阶段差异基因表达情况。结果表明:杂交子共有4种基因表达类型:双亲沉默型(W1型),单亲沉默型(W2型),杂交子特异表达型(W3型),单亲表达型(W4型)。香菇杂交子农艺性状与基因差异表达类型的相关性分析表明:菌盖厚与双亲沉默型(W1型)呈极显著负相关,而菌柄长与单亲沉默型(W2型)呈显著负相关。     

利用原生质体紫外诱变技术选育耐高温香菇菌株

【目的】运用原生质体紫外诱变技术选育香菇耐高温新菌株。【方法】以香菇菌株18为出发菌株,紫外诱变处理其原生质体,通过47°C热激3 h后菌丝恢复生长的情况来筛选获得耐高温诱变株,测定18及其所有诱变株在木屑培养基中的恒温长速、高温长速以及恢复长速,并进行高温出菇试验。【结果】筛选得到57株耐高温诱变株,其中诱变株N6、N44和N24的综合性状较好。恒温长速、高温长速以及恢复长速与出菇性状具有相关性,恢复长速与出菇产量、单菇性状、耐高温能力呈正相关,可初步作为预测耐高温菌株综合性状的指标。【结论】利用原生质体紫外诱变技术,可初步选育出耐高温香菇新菌株。     

复合酶法水解香菇工艺的研究

【目的】高效提取香菇中的功能性成分,进一步开发利用香菇的食用价值。【方法】以香菇为原料,在单因素试验和正交试验的基础上,研究了复合酶法(纤维素酶、木瓜蛋白酶和5-磷酸二酯酶)水解香菇的工艺条件。【结果】第一步为纤维素酶和木瓜蛋白酶共同水解,加酶量分别为0.2%和0.4%,水解温度55°C,水解时间3 h,初始pH 5.5;第二步为5-磷酸二酯酶水解,加酶量为0.2%,水解温度70°C,水解时间2 h,初始pH 7.0。用此法得到的香菇水解液水解度为39.48%,游离氨基酸得率10.25%,5-核苷酸得率0.768%,多糖得率8.67%。【结论】此香菇水解液富含呈鲜味物质和其它营养物质,可进一步深加工为香菇调味品。     

Strain typing of Lentinula edodes by random amplified polymorphic DNA assay

Abstract Single 10-base primers were used to generate randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers in the shiitake mushroom, Lentinula edodes . Seven primers produced polymorphisms in all 15 strains tested, producing 12–19 bands ranging from 0.34 to 2.52 kb. Thirteen of the 15 strains had unique DNA fingerprints, whereas L. edodes ATCC 28759 and ATCC 28760 exhibited identical RAPD profiles for all the primers. Molecular-genetic markers obtained with the RAPD assay can be used to differentiate strains of L. edodes and have potential applications in mushroom breeding and strain improvement programs.     

香菇对潮霉素的抗性实验

选用4株不同品系的香菇菌种,比较了香菇在固体、液体2种不同培养条件下,对潮霉素抗性的差异;研究了香菇以原生质体、原生质体再生菌丝、冷藏菌种等3种不同生理状态为实验材料,对潮霉素的抗性特点。试验表明,香菇对潮霉素极为敏感,在固定的条件下,抗性稳定;而当条件改变时,抗性有一定变化。     

香菇酶解物对小鼠免疫及肠道菌群的影响研究

【目的】研究香菇酶解物对小鼠免疫及肠道菌群的影响。【方法】首先采用环磷酰胺(CY)造模法制作小鼠免疫抑制模型,然后对其中两组分别灌胃香菇未酶解物和香菇酶解物,最后观察疗效、测定免疫指标和试验小鼠肠道中细菌总数、大肠杆菌数、乳酸菌数和真菌总数等。【结果】香菇酶解物可使受免疫抑制的小鼠(活跃度、粪便、毛皮、体重)恢复到正常水平,促进免疫器官脾脏及胸腺的发育(P<0.05),增强腹腔巨噬细胞的吞噬活性(P<0.01)。同时提高小鼠肠道中以乳酸菌为主的有益菌数量(P<0.01),抑制大肠杆菌等致病菌的生长(P<0.01)。【结论】香菇酶解物可以提高小鼠的免疫功能,改善肠道菌群环境,对肠道功能有一定的调节作用,有较高的食用和药用价值。     

香菇新菌株选育

采用香菇135双核体秋水仙碱(C22H25NO6)诱变及香菇K303单核体秋水仙碱诱变的菌株388B1与香菇JL-2双核体杂交(单×双)的方法,成功地获得了优良的诱变菌株(编号为K05)和杂交菌株(编号为K48)。经拮抗试验、酯酶同工酶、分子标记等多种方法鉴定和栽培试验证明,诱变、杂交菌株为有别于出发菌株和亲本菌株的新菌株;3年的栽培比较试验结果表明:新菌株比当地主栽香菇135、939高产,K05比135每筒平均增产28.5%,K48比939每筒平均增产10.7%,产量生物学统计显示增产显著;经济性状考评为优质,菌柄短、菇形圆整。该研究成果不仅有望满足菇农对香菇新菌株的需求,而且可为香菇育种提供新的途径。     

香菇品种遗传多样性RAPD分子标记的研究

对32个中国栽培香菇品种和2个野生子实体的遗传多样性进行了RAPD标记研究,9个引物共扩增出113条DNA带,83.19%具有多态性。结果显示,34个香菇菌株间均有遗传上的差异,但遗传相关性极高,表明中国栽培菌株间的遗传背景单一。     

Use of intersimple sequence repeats markers to develop strain-specific SCAR markers for Lentinula edodes

Although Lentinula edodes is the second most important cultivated mushroom worldwide, most industrially cultivated strains have been identified only through traditional phenotypic analysis. Here, we report for the first time the use of sequence characterized amplified region (SCAR) markers for strain differentiation. SCAR markers were created by first generating and sequencing single intersimple sequence repeats fragments, and then designing primers based on these sequences to amplify strain-specific fragments of a certain size. One SCAR primer pair, ISL450F/R7 (amplifying a band of c. 450 bp), was designed to identify one strain of L. edodes (strain No. 7). The SCAR primer pair was then used to correctly amplify the single unique fragment from DNA samples taken from a total of 85 strains representing three separate species. Our data provide the foundation for a precise and rapid PCR-based strain-diagnostic system for L. edodes.