5-氟尿嘧啶敏感与非敏感的人胃癌BGC-823细胞基因表达谱差异分析

利用化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)对胃癌细胞株进行筛选和诱导,建立具有耐药性的胃癌细胞株.与亲代细胞株对比生长特性及基因表达谱,初步探讨胃癌细胞的耐药机制.采用四唑盐比色法(MTT)测定5-Fu对胃癌细胞株BGC-823的半数抑制浓度(IC50);根据IC50设计5-Fu剂量,用大剂量的5-Fu逐渐递增间歇给药的方法,反复筛选,获得5株胃癌耐药细胞株.比较耐药细胞株和亲本细胞株的形态和生长特性,继而再用人类肿瘤基因芯片(human cancer arrays)比较测试亲本与耐药细胞株的基因表达谱差异;对其中189个上调基因和133个下调基因采用Gene Ontology中的BP(Biological Process)分析这些基因相关的功能,并用MAS2.0分析这些基因可能涉及的信号通路.结果提示,胃癌细胞株耐药(5-Fu)相关基因可能与转录因子信号转导、TNF受体介导的细胞凋亡和抗凋亡、细胞周期调节、细胞粘附及MAP激酶类的功能相关.对细胞周期、信号转导相关的6个基因采用定量PCR验证,结果与基因表达芯片结果一致.上述结果有利于进一步发现胃癌细胞的耐药基因和相关信号通路,探索抗胃癌治疗的耐药机制.     

益生元对人胃癌细胞株BGC-823细胞抑制作用的研究

目的 探讨益生元对胃癌细胞的作用效果,为开发安全、有效的预防和辅助治疗胃癌的药物奠定基础,并为益生元的有效应用打开新思路.方法 用MTT法研究不同浓度大豆低聚糖、低聚木糖、低聚果糖和低聚甘露糖在不同时间对BGC-823细胞的抑制作用.结果 大豆低聚糖、低聚木糖、低聚果糖和低聚甘露糖4种益生元对BGC-823细胞均有一定程度的抑制作用(P<0.05),抑制效果基本呈浓度时间依赖关系,但大豆低聚糖、低聚果糖的作用在48h和72h差别不大.在这4种益生元中,大豆低聚糖的抑制效果最强,低聚木糖次之,低聚果糖、低聚甘露糖的抑制效果较弱.作用48h、72h达到对BGC-823细胞半数抑制率的大豆低聚糖的浓度是100ms/ml左右;作用72h时达到对BGC-823细胞半数抑制率的低聚木糖浓度在100～125mg/ml;而125mg/ml低聚果糖和低聚甘露糖处理胃癌BGC-823细胞72h,均未达到50%的抑制率.结论 大豆低聚糖、低聚木糖、低聚果糖和低聚甘露糖对人胃癌细胞株BGC-823细胞有一定程度的抑制作用.     

大豆低聚糖对人胃癌细胞株BGC-823细胞的细胞凋亡和细胞周期的影响

目的通过观察大豆低聚糖对胃癌癌细胞株BGC-823细胞的细胞周期和细胞凋亡的影响,探索乳酸杆菌发酵滤液对胃癌细胞作用的可能机制。方法用光镜和流式细胞仪分析不同浓度大豆低聚糖对BGC-823细胞的凋亡诱导效果;用流式细胞仪分析不同浓度大豆低聚糖对BGC-823细胞细胞周期的影响。结果大豆低聚糖可以诱导BGC-823细胞的凋亡。形态学观察处理后的BGC-823细胞,可见细胞变形,细胞皱缩,体积变小,细胞间隙增大,细胞核固缩。流式细胞仪分析50 mg/ml和100 mg/ml大豆低聚糖作用48 h和72 h BGC-823细胞的凋亡比例,分别为6.76%和7.93%。50 mg/ml大豆低聚糖作用48 h,引起BGC-823细胞G1期阻滞,100 mg/ml大豆低聚糖作用48 h,引起BGC-823细胞出现S期阻滞。结论大豆低聚糖可诱导部分BGC-823细胞凋亡。大豆低聚糖对BGC-823细胞的生长抑制作用在低浓度时可能通过G1期阻滞实现,在高浓度时可能通过S期阻滞实现。     

稀土化合物氯化亚鈰对人肺癌细胞PG、人胃癌细胞BGC-823的作用

 以人肺癌细胞 Ｐ Ｇ 和人胃癌细胞 Ｂ Ｇ Ｃ ８２３ 作为研究对象,利用 Ｍ Ｔ Ｔ 测定、３ Ｈ Ｔｄ Ｒ 参入、流式细胞术、软琼脂培养、 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ、 Ｗ ｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 等实验方法,观察了稀土化合物氯化亚鈰（ Ｃｅ Ｃｌ３）抑癌作用．结果表明, Ｃｅ Ｃｌ３ 浓度为 ００５ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ,０１ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ,０５ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ和 １ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ可抑制 Ｐ Ｇ 细胞的增殖;浓度为 ０５ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ和 １ ｍ ｍ ｏｌ／ Ｌ可抑制 Ｐ Ｇ 细胞 Ｄ Ｎ Ａ 的合成,其 Ｇ１ 期细胞比例增加而 Ｓ期细胞比例减少,在软琼脂中的生长能力降低,原癌基因 ｃ ｍ ｙｃ 和 ｃ ｒａｓ 表达降低,ｐ１６ 蛋白质表达降低．而同样浓度的 Ｃｅ Ｃｌ３ 对 Ｂ Ｇ Ｃ ８２３ 细胞和正常细胞 ２ Ｂ Ｓ未见影响．提示：稀土化合物抑制肺癌细胞 Ｐ Ｇ 的增殖以及降低其恶性度的作用机制可能与一些增殖相关的原癌基因的表达和细胞周期的调控有关,其确切的机理还需进一步的研究．     

人胃癌BGC-823细胞中去甲斑蝥素抑癌作用机理的蛋白质组学研究

去甲斑蝥素是我国自行研制的抗肿瘤药物,在临床上主要用于消化道肿瘤的治疗．实验表明,去甲斑蝥素可引起人胃癌BGC-823细胞发生 M期阻滞及细胞凋亡．进一步利用双向电泳和质谱技术,筛选出了去甲斑蝥素抑癌作用相关蛋白．研究显示,线粒体热休克蛋白CH60、线粒体ATP合酶d亚单位、内质网葡萄糖调节蛋白GRP78、线粒体Hsp70的辅助因子GRPE1、SH3L3以及染色质组装因子1小亚基RBBP4参与了去甲斑蝥素的抑癌作用．研究提示,去甲斑蝥素可能通过促进线粒体热休克蛋白及p53的表达进而激活caspase-3依赖的凋亡通路,并且去甲斑蝥素在引发内质网协迫之后,可通过抑制胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase, ERK)的活性促进肿瘤细胞的凋亡．进一步分析了去甲斑蝥素与线粒体ATP合酶抑制剂寡霉素A的联合用药对人胃癌细胞生长的影响,结果表明,联合用药的抑瘤效果比单独用药的抑瘤效果显著,提示去甲斑蝥素可能通过抑制线粒体ATP合酶功能抑制BGC-823生长．上述结果为优化去甲斑蝥素的联合用药方案提供了新线索．     

蛹虫草对人胃癌细胞BGC-823生长抑制与诱导凋亡作用研究

目的研究蛹虫草水提物（the aqueous extract of Cordycep Militaris,AEoCM）对人胃癌细胞（BGC-823）生长抑制与凋亡诱导作用。方法采用不同浓度的AEoCM分别作用于胃癌BGC-823细胞,24、48和72h后,应用倒置相差显微镜观察胃癌细胞的形态变化,四氮甲基唑蓝（MTT）测定细胞生长抑制效应,流式细胞仪（FCM）检测细胞周期变化及凋亡率,免疫组化方法测定NK-k BP65的表达。结果AEoCM能显著抑制BGC-823细胞增殖,且在一定的浓度范围内呈时问和浓度依赖性。形态学观察发现,细胞变暗、皱缩,形状不规则;FCM检测结果显示,G2期的细胞于作用72h后分布显著增加,使细胞阻滞于G2期。0．5g／L AEoCM在24、48和72h凋亡率分别为4．655％、11．039％和19．368％,其凋亡程度与时间呈正相关,免疫组化方法测定NK-k BP65的表达下调。结论AEoCM能明显抑制BGC-823细胞的生长,诱导其细胞凋亡,其诱导细胞凋亡的机制可能与下调NK—k BP65的表达有关。     

红车轴草提取物对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响

探讨红车轴草(TrifoliumpratenseL)提取物对胃癌细胞株BGC-823的抑制增殖效应及诱导凋亡作用.我们采用不同浓度(50、100、250、500、1000mg/L)红车轴草提取物处理BGC-823细胞,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测药物对细胞的抑制作用,倒置显微镜观察细胞的形态学改变;AO/EB染色,荧光显微镜观察细胞凋亡形态;采用DNALadder观察DNA的降解;应用流式细胞仪观察细胞凋亡过程中的细胞周期的变化和细胞凋亡.结果显示在红车轴草提取物的作用下,BGC-823细胞呈凋亡改变,DNA琼脂糖凝胶电泳呈典型的凋亡特征.细胞凋亡的同时,细胞周期阻滞于G2/M期.实验结果表明红车轴草提取物能抑制胃癌BGC-823细胞增殖,能诱导胃癌细胞凋亡.     

无花果枝提取物体外诱导胃癌BGC-823细胞凋亡的研究

为探讨新鲜无花果枝提取物(FBE)对体外培养的人胃癌细胞株BGC-823增殖和凋亡的影响,用不同浓度FBE处理胃癌BGC-823细胞,采用细胞形态学观察,细胞活力测定(MTY法)及免疫组织化学法检测增殖细胞核抗原(PCNA)表达情况来评价FBE对BGC-823细胞体外增殖的影响,应用流式细胞术的膜联蛋白V/碘化丙啶技术(Annexin V/PI法)检测FBE诱导BGC-823细胞体外凋亡的情况.形态学观察发现中高剂量(＞0.5mg/mL)组处理4 h细胞出现明显凋亡,24 h检测到中高剂量(＞0.5 mg/mE)组细胞增殖活力和增殖细胞核抗原表达显著降低(P＜0.05),流式细胞仪检测到FBE处理4 h所有剂量组细胞平均凋亡率(9.76%,10.87%,14.29%,49.67%,71.37%)均高于对照组(6.1%)(P＜0.05或P＜0.01),以上作用效果呈现剂量依赖性.以上结果说明无花果枝提取物能够通过诱导胃癌BGC-823细胞凋亡从而抑制其体外的生长与增殖.     

层粘连蛋白对晚G1期人胃癌BGC-823细胞生长的促进作用

为研究层粘连蛋白（laminin,LN）促进肿瘤细胞生长作用,采用脉冲标记计数有丝分裂百分率(percentage labeling mitosis,PLM)法测得体外培养人胃癌 (BGC 823) 细胞周期时间为41 h,其中G1期时间为24.5 h. 分裂细胞脱离法获取分裂期细胞,继续培养23 h,在细胞运行进入G1晚期时,将其置于LN 0、0.11、0.55、1.10 μmol/L基质上孵育4 h; 细胞荧光光度计检测晚G1期细胞内Ca2+浓度、钙调蛋白、DNA含量. 结果显示,LN与其膜上受体结合后引起细胞内Ca2+浓度、钙调蛋白、DNA含量增加,尤以在0.55 μmol/L LN作用显著（P<0. 001）.蛋白质免疫印迹分析证明,cPKC α呈现表达,提示 LN与其受体结合可增强其细胞cPKC-α的活性;分析G1期细胞周期蛋白E(cyclinE)、细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2表达水平,呈现逐渐增强的趋势; LN可诱导c-Myc蛋白呈现高表达,提示 LN与其受体结合增强与细胞增殖密切相关的基因表达;在LN作用前后的BGC 823细胞均未检测到Bax蛋白表达.结果提示,在人胃癌 (BGC 823)细胞G1/S期交界处,层粘连蛋白与其膜上受体结合引起细胞内Ca2+浓度升高,诱导钙调蛋白的释放,其含量增加,增强蛋白激酶C的活化,导致细胞内DNA含量增加、G1/S期细胞周期蛋白与CDK表达增强、诱导原癌基因c-Myc呈持续表达状态,而凋亡基因Bax不表达.     

H.pylori-L型对胃癌BGC-823细胞侵袭力影响的研究

目的研究幽门螺杆菌L型(Helicobacter pyloriL-form,H.pylori-L型)感染对胃癌BGC-823细胞侵袭力影响,探讨H.pylori-L型在胃癌发展中的作用和可能机制。方法将胃癌BGC-823细胞与H.pylori-L型按1:50、1:200和1:500的不同比例共培养24 h,进行以下实验:(1)应用具有聚碳酸酯和重建基底膜的Transwell小室细胞侵袭模型,观察与H.pylori-L型作用后胃癌BGC-823细胞的侵袭能力;(2)应用Western-blotting实验测定胃癌BGC-823细胞OPN和MMP2蛋白表达量的变化。结果 (1)Transwell侵袭实验发现随着胃癌BGC-823细胞与H.pylo-ri-L型细菌的浓度比例增大,胃癌BGC-823细胞穿透重建基底膜的数量逐渐增多,穿透重建基底膜的胃癌细胞数量在不同实验组之间的差异有统计学意义(F=24.78,P0.01);(2)Western-blotting实验发现,随着胃癌BGC-823细胞与H.pylori-L型比例增大,胃癌BGC-823细胞中OPN和MMP2的表达量逐渐增加,呈细菌浓度依赖性。结论 H.pylori-L型感染增强胃癌细胞的侵袭能力,具有细菌浓度依赖效应,其机制可能与其上调了胃癌细胞OPN、MMP2表达有关。     

人PAK1重组蛋白质的表达及在人胃癌BGC-823细胞内定位

为检测人PAK1在原核细胞中的表达情况及在真核细胞中的定位,利用RT-PCR技术获得PAK1目的基因,构建GST融合蛋白原核表达载体pGEX-5X-1/PAK1,IPTG诱导后进行SDS-PAGE及Western印迹检测,并用体外激酶实验测定其生物学活性;同时,构建带绿色荧光蛋白(GFP)标签的真核表达载体pEGFP/PAK1,利用脂质体法转入人胃癌BGC-823细胞系中,在共焦激光扫描显微镜下观察癌细胞中绿色荧光蛋白的表达。结果表明,pGEX-5X-1/PAK1载体能在大肠杆菌BL-21中正确表达GST-PAK1融合蛋白,大小约为94kDa,具有生物活性;PAK1绿色荧光蛋白定位于细胞浆。上述研究为进一步探索PAK1的生物学特性及信号转导通路打下了基础。     

人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化细胞基因组文库的构建及其转化基因的克隆

以人胃癌细胞株BGC-823 DNA二轮转化的鼠成纤维细胞为材料,用λ噬菌体EMBL_3,作克隆载体,构建了转化细胞的基因组文库。用~(32)P标记的人Alu重复顺序和原癌基因c-Ha-ras为探针,对100万基因文库噬斑进行原位杂交筛选,找出了两个可以同时与上述探针杂交的阳性克隆。经对两个阳性克隆DNA进行分子杂交表明,它们均含有来自人胃癌细胞株BGC-823的转化基因Ha-ras,进一步运用质粒载体pBR322对这一转化基因进行次级克隆,并进行了限制性内切酶图谱的初探,从而为研究胃癌转化基因的结构、DNA序列及与原癌基因的异同奠定了基础。     

靶向survivin的siRNA对胃癌BGC-823细胞增殖的影响

目的探讨干扰RNA沉默生存素（survivin）基因表达对人胃癌BGC-823细胞增殖和凋亡的影响。方法设计并合成3条靶向survivin的小分子干扰RNA（siRNA）,构建表达性干扰RNA质粒（shRNA）——shRNA-survivin-1、shRNA-survivin-2和shRNA-survivin-3,分别转染胃癌BGC-823细胞,实时定量PCR检测干扰RNA沉默survivin mRNA表达效果,Westernblot观察对胃癌BGC-823细胞survivin蛋白质表达的抑制,MTT（四甲基偶氮唑盐）比色法分析检测细胞生长抑制率,流式细胞计数检测各组细胞周期和凋亡率,探讨干扰RNA对胃癌BGC-823细胞生长的影响。结果在体外,shRNA-survivin-1有效沉默人胃癌BGC-823细胞survivin mRNA的表达,使sur-vivin mRNA相对水平明显降低（P〈0.05）,survivin蛋白质表达抑制,72h细胞生长抑制率达74.92%（P〈0.05）,shRNA-survivin-1使G2/M期细胞百分比明显增加,凋亡率显著增加（P〈0.05）。结论 shRNA-survivin-1可以沉默survivin基因的表达,可以显著抑制胃癌BGC-823细胞的增殖,在一定程度上诱导其自发凋亡。本研究为靶向sur-vivin的RNA干扰在胃癌的基因治疗提供了有力的理论依据和技术储备。     

毛喉萜抑制人胃癌细胞BGC－823增殖与ras基因表达相关性研究

毛喉萜（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）对人胄癌细胞ＢＧＣ－８２３增殖有明显抑制作用,具药物剂量和作用时间之依赖性。剂量为２×１０~（－５）ｍｏｌ／Ｌ之毛喉萜使胃癌细胞在软琼脂中形成集落的能力显著降低;癌基因ｃ－Ｈａ－ｒａｓ之表达明显被抑制,细胞核中与ｒａｓ基因上游调控区２．５ｋｂ片段结合的三种蛋白结合能力下降。联系到以同样浓度药物处理胃癌细胞７２ｈ,细胞质、膜与细胞核中蛋白激酶Ｃ（ＰＫＣ）活性均下降的现象,可能ＰＫＣ活性下降与Ｈａ－ｒａｓ基因上游片段２．５ｋｂ结合蛋白之结合能力下降存在相关性,ＰＫＣ可能通过影响ＤＮＡ结合蛋白的磷酸化作用,导致了Ｈａ－ｒａｓ基因表达之被阻抑。而ｒａｓ基因表达下降可能是毛喉萜抑制胃癌细胞增殖的一个重要分子事件。     

温热合并吐温80对BGC-823细胞EPM的影响

温热化学疗法在临床肿瘤治疗中取得了较好疗效,但目前采用的温热与抗癌药物合并疗法,治疗较复杂,副作用较多。需进一步探索疗效好、副作用小的合并药物。本实验用临床上常用、安全、低毒的吐温80作合并药物,测定BGC-823细胞经温热合并吐温80作用后的细胞电泳率的变化,以观察其共同作用效果,并探讨其作用机理。     

大肠杆菌F18菌株敏感和抵抗基因型仔猪十二指肠基因表达谱差异分析

文章运用Agilent 双标记表达谱芯片, 基于已建立的苏太猪大肠杆菌F18菌株敏感性和抗性型全同胞配对个体, 分析十二指肠组织基因表达谱差异, 旨在筛选导致仔猪断奶后腹泻和水肿病发生的大肠杆菌F18菌株受体相关基因, 探讨造成大肠杆菌病抗性和敏感性资源家系抗性差异的分子生物学机理。研究结果显示, 以Fold change绝对值大于2倍进行筛选, 在敏感型(GG基因型)对抗性型(AA基因型)配对组中, 差异基因共13个, 其中上调6个, 下调7个, 在以敏感型(AG基因型)对抗性型(AA基因型)配对组中, 共筛选出差异基因6个, 其中上调4个, 下调2个。经GO分析发现差异基因的生物学过程主要涉及免疫应答、胞外区修饰(如糖基化)、细胞黏附、信号转导等。通路发现大肠杆菌F18菌株抵抗性和敏感性差异基因主要涉及糖脂合成代谢以及炎症免疫相关通路, 经芯片筛选出的相关基因的功能还需进一步的研究验证。     

吐温80合并温热(39°-43℃)对BGC-823人胃癌细胞膜流动性及EPM的影响

BGC-823人胃癌细胞经叶温80合并温热(39℃—43℃)处理后,用DPH作荧光分子探针观察细胞膜流动性的变化,并通过测定细胞电泳率(EPM)观察细胞膜表面电荷的改变,正常人红细胞及包皮成纤维细胞作为正常细胞对照。实验结果表明:常温下肿瘤细胞膜流动性及EPM明显高于正常细胞,吐温80和温热对肿瘤细胞及正常细胞均有促进膜流动性及降低细胞电泳率作用。吐温80合并温热时这种作用显著增加,合并作用41℃60分左右的效应已达到温热43℃100分作用水平,有明显时间效应。冷却后各组有不同程度恢复,但合并作用41℃100分以上各组恢复较慢。正常细胞对温热和吐温80作用的反应明显低于肿瘤细胞。     

胃癌823细胞cDNA文库的建立

随着DNA重组技术的发展,某些与细胞癌变有关的基因的分离与克隆越来越受到人们的重视。要达到分离和纯化癌基因及其产物的目的,一个较为有效的方法就是构建cDNA文库。最近我们建立了胃癌823细胞(BGC-823)的cDNA文库,希望能从文库中分离到与胃癌