浓香型白酒窖泥微生物群落结构及其选育应用研究进展

窖池发酵是浓香型白酒酿造的工艺特征。窖泥是酒体生香功能微生物的繁殖载体,窖泥微生物对浓香型白酒风味的形成具有重要作用。近年来,我国学者对窖泥微生物展开了一系列理论和实践研究,取得了丰富的研究成果。本文结合文献资料和本课题组研究工作,介绍了窖泥微生物群落结构的多样性及演替、群落结构与窖泥质量的关系、窖泥微生物选育及应用等方面的研究进展,并针对研究存在的问题提出未来研究方向:系统开展窖泥微生物群落结构的差异化研究;进一步发掘窖泥微生物资源,提升功能微生物的应用潜力;深入研究窖泥培养菌剂的作用机理,实现品质控制。     

窖泥群落结构及功能微生物研究进展

窖泥是浓香型白酒的特征发酵载体,包含多种功能微生物,这些功能微生物对浓香型白酒的风格特征和品质有着重要的影响。本文对不同窖龄窖泥、不同浓香型白酒产地的窖泥及不同质量窖泥的窖泥微生物研究进展进行总结分析,并在此基础上对窖泥主体微生物的功能进行阐述。以期为窖泥微生物的研究提供思路,为浓香型白酒的质量和香味成分研究提供思考,促进窖泥微生物的研究,加深对浓香型白酒窖泥的认知。     

基于PCR-DGGE和高通量测序分析白云边酒窖泥细菌群落结构与多样性

【目的】探索白云边酒不同窖龄窖泥细菌群落结构及其多样性,分析窖泥细菌群落特征对兼香型白酒风格形成的影响。【方法】分别提取2年和23年窖泥样品总DNA,采用PCR-DGGE、基因克隆以及高通量测序技术,研究窖泥细菌的分布情况。【结果】白云边窖泥细菌归属于变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)4个菌门。2、23年窖泥共同的优势菌属(≥1.0%)包括棒状杆菌属(Corynebacterium)、香味菌属(Myroides)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium)、乳杆菌属(Lactobacillus)、梭菌属(Clostridium)、醋杆菌属(Acetobacter)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、肠杆菌属(Enterobacter)和不动杆菌属(Acinetobacter)。2年窖泥特有优势菌属为Dysgonomonas、Fluviicola、变形杆菌属(Proteus)和Wohlfahrtiimonas,而23年窖泥特有优势菌属为葡萄球菌属(Staphylococcus)、Hazenella、魏斯氏菌属(Weissella)、葡糖醋杆菌属(Gluconacetobacter)和摩根氏菌属(Morganella)。【结论】2年窖泥细菌群落多样性高于23年窖泥。比较了白云边两种窖龄窖泥主要细菌组成情况,为研究微生物对白云边酒浓酱兼香型独特风味形成的影响提供依据。     

浓香型白酒窖泥中兼性厌氧细菌的分离鉴定

为探讨浓香型白酒窖泥中微生物区系的构成,采用传统微生物分类鉴定法,对泸州老窖不同窖龄窖底和窖壁泥样的可培养兼性厌氧细菌进行了分类计数,并初步鉴定到属。平板涂布法计数得出,老窖底样的菌落总数最多,达3.98×103cfu/g泥,新窖壁样菌落数最少,只有0.24×103cfu/g泥;经生理生化鉴定,参照伯杰氏细菌鉴定手册等将划线单离后的菌株归为8个属,其大部分属于芽孢杆菌属(Bacillus)和芽孢乳杆菌属(Sporolac-tobacillus),也存在假单胞菌属(Pseudomonas)、梭菌属(Clostridium)等。     

浓香型白酒两个产区窖泥微生物群落结构分析

【目的】探索浓香型白酒两个典型产区窖泥微生物群落结构和多样性,分析窖泥微生物群落地域特征及对白酒风格形成的影响。【方法】分别提取四川和安徽两个产区窖泥样品总DNA,应用PCR-ARDRA和16S rRNA基因克隆测序技术对两个产区窖泥细菌和古菌进行研究。【结果】两个浓香型白酒产区窖泥细菌丰富,包括:厚壁菌门(Firmicute)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、互养菌门(Synergistetes)、Armatimonadetes类群和未分类细菌(Unclassified bacteria)。两个产区窖泥绝对优势种群均为厚壁菌门中梭菌纲(Clostridia)细菌,在四川产区窖泥中检出较多的互营单胞菌属(Synthrophomonas)和紫单胞菌属(Petrimonas)。古菌的群落组成较为简单,主要是甲烷囊菌属(Methanoculleus)、甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷鬃菌属(Methanosaeta)和甲烷杆菌属(Methanobacterium)4个产甲烷古菌类群,四川产区窖泥优势古菌为甲烷囊菌和甲烷八叠球菌,安徽产区则为甲烷八叠球菌属和甲烷鬃菌。【结论】四川和安徽两个产区窖泥微生物的16S rRNA基因克隆文库系统地反映了两者微生物群落的相似性和差异性,对揭示浓香型白酒两个产区的酒体风格差异形成有一定的参考价值。     

基于窖泥微生物相对定量与绝对定量联用的窖泥老熟特征分析

[目的] 基于传统的相对定量法,在总DNA提取过程中加入内标菌,探索不同老熟程度下窖泥微生物菌群组成特征。[方法] 通过添加外源菌丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）作为内标菌,利用16S rRNA基因扩增子测序技术,基于相对丰度与绝对丰度解析不同老熟程度窖泥内的菌群结构和理化差异。[结果] 相对定量分析表明,随着窖泥老熟,窖泥微生物群落的多样性增加,己酸菌属（Caproiciproducens）、甲烷杆菌属（Methanobacterium）、甲烷八叠球菌属（Methanosarcina）和互营单胞菌属（Syntrophomonas）等菌的相对丰度显著增高。结合绝对丰度分析,老熟窖泥内的生物量分别是新窖泥与趋老熟窖泥的600倍与28倍。不同于相对定量分析,乳杆菌属（Lactobacillus）的绝对丰度在老熟窖泥内并未降低,为新窖泥的20倍。己酸菌属在老窖泥中的绝对丰度为新窖泥的25000倍;其他功能微生物包括甲烷杆菌属、甲烷八叠球菌属、甲烷短杆菌属（Methanobrevibacter）、互营单胞菌属的绝对丰度也随着窖龄的增加而显著增加。菌群结构的绝对定量动态分析表明,新窖泥转变为老熟窖泥的过程是一个菌群组成多样性不断提高、生物量也逐步增加的过程,老窖泥中己酸菌属、互营单胞菌属、多种甲烷菌等微生物绝对量的增加,推测对降低窖泥内的乳酸含量和形成窖泥稳态环境具有重要作用。[结论] 绝对定量方法的引入,可观测不同窖龄窖泥微生物生物量的差异,解析不同老熟阶段窖泥功能微生物绝对丰度的动态变化,为窖泥菌群结构和代谢功能的定量化和因果关系研究提供了新的策略。     

泸型酒酒醅与窖泥中梭菌群落结构、演替和功能差异

梭菌对泸型酒风味品质的发酵形成具有重要作用,但目前对酒醅和窖泥中梭菌群落的物种组成、发酵演替规律以及代谢功能的差异尚缺少深入认识。采用分子微生态学技术,在种水平上对比了同一窖池的酒醅和窖泥中梭菌纲细菌群落的结构差异和演替规律,并通过纯培养方法分离和评价了梭菌菌株的主要挥发性脂肪酸组成差异。结果表明,窖泥发酵过程中梭菌纲细菌和总细菌的基因拷贝数比值相对稳定(71.5%–91.2%),而酒醅中梭菌的变化则较大(0.9%–36.5%)。酒醅中优势梭菌纲细菌主要是梭菌属(Clostridium,19.9%)、沉积物菌属(Sedimentibacter,8.8%)和氢孢菌属(Hydrogenispora,7.2%),而窖泥中主要为氢孢菌属(57.2%)、沉积物菌属(5.4%)和产己酸菌属(Caproiciproducens,4.9%)。窖泥及酒醅发酵过程中梭菌群落结构差异显著(P=0.001)。分离获得的20株梭菌菌株具有不同的产挥发性脂肪酸能力。结果表明,窖池中梭菌纲细菌群落存在时空异质性,其结构和功能差异对泸型酒风味形成具有影响。     

浓香型白酒窖泥中可培养细菌的分离鉴定及产酸研究

为系统了解浓香型白酒窖泥中可培养细菌的多样性,采用平板稀释涂布法分离筛选窖泥中可培养菌株。扩增纯培养细菌的16SrRNA基因,测序并与EzBioCloud数据库比对,所有序列已在GenBank中注册。结果共从窖泥中筛选出42株差异性较大的菌株,其中5株与模式菌株相似性低于97％,共包括14个属,以Bacillus、Lysinibacillus、Sporosarcina、Staphylococcus四个属为主;高效液相色谱检测各个菌发酵液结果表明,有机酸包括乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、草酸;其中尤以乙酸、乳酸的产量较高。     

浓香型白酒窖泥放线菌的群落结构及其多样性

以泸州老窖1、50、100和400年窖泥为研究对象,采用变性梯度凝胶电泳(DGGE)研究浓香型白酒窖泥放线菌的群落结构及其多样性。DGGE图谱显示,除1年样品外,其余窖底泥多样性指数(H)均低于同窖龄窖壁泥,但均匀度指数(EH)较高。不同窖池相同部位窖泥的群落结构变化趋势为:随窖龄的延长,窖壁泥H值逐渐上升,为1.74—2.28;窖底泥下降,为1.73—2.07。EH值均为波动下降,分别在0.986—0.991和0.971—0.994之间。窖底泥相似性系数(SC)逐渐上升,为0.46—0.82;窖壁泥为0.31—0.62。DGGE条带测序结果显示,窖泥放线菌归于Olsenella、Atopobium、Streptomyces和Corynebacterium 4个属。Olsenella和Atopobium属为共有的优势属,且在窖壁泥中的优势度(di)均随窖龄延长而降低,在窖底泥中升高。实验结果表明,浓香型白酒窖泥蕴藏着丰富的放线菌资源,群落结构和多样性存在差异,菌群演替呈现一定规律性。     

厌氧产酸菌群培养技术在窖泥质量快速检测中的应用

【背景】窖泥质量决定了浓香型白酒品质的高低,窖泥中的产酸功能菌群显著影响着窖泥的质量及对应的浓香型白酒品质,但目前对窖泥质量的评价尚缺乏明确和完善的标准。【目的】建立一种快速、准确评价窖泥质量的方法,解析窖泥中参与己酸合成的重要微生物。【方法】通过窖泥产酸菌群培养和产酸代谢特征研究,构建厌氧产酸菌群发酵体系,根据窖泥中厌氧菌的己酸合成能力来评价相应窖泥的质量;利用高通量测序技术分析可培养发酵体系中产己酸功能微生物的群落组成。【结果】葡萄糖碳源相比乳酸碳源可以更有效地富集窖泥中的产己酸菌群;采用毫升级别发酵体系、对窖底泥进行多点取样,产酸菌群发酵代谢产物稳定期的己酸产量、己酸/丁酸值可较准确地评价不同窖泥的质量。16S rRNA基因测序结果表明,利用产酸菌群培养方法可以有效地富集未培养产己酸细菌(Uncultured bacterium Caproiciproducens)。【结论】基于产酸菌群培养的窖泥微生物发酵体系可用于实际生产中快速、准确地评价窖泥质量,并为窖泥微生物己酸合成代谢机制的研究提供参考。     

浓香型白酒糟醅及窖泥产香功能菌的研究进展

浓香型白酒主要香气物为己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯和丁酸乙酯四大酯类,白酒微生物发酵过程中酯类合成主要是酸与醇在酯化酶的作用下产生,因此产香功能菌包括香气及其前体物产生菌和酯化酶产生菌.本文综述了浓香型白酒糟醅及窖泥主要产香功能菌的来源、组成、鉴定方法、功能特性、相互关系及其在浓香型白酒生产过程中的应用等方面的研究进展,旨为浓香型白酒重要微生物的研究提供思路,为其发酵过程控制提供理论依据.     

泸型酒酒醅中梭菌群落的发酵演替规律和功能预测

【目的】研究泸型酒酒醅中梭菌(Clostridia)群落的演替规律,探讨梭菌群落在酒醅发酵过程中的潜在功能。【方法】利用实时荧光定量PCR技术结合高通量测序技术研究不同发酵时间泸型酒酒醅中梭菌丰度变化;通过梭菌16S r RNA基因序列高通量测序数据分析揭示梭菌群落演替规律,并运用LEf Se分析找出标志性OTU;通过PICRUSt分析对梭菌功能组成进行预测。【结果】泸型酒发酵过程酒醅中梭菌的生物量在发酵14 d上升至最高(3.46×10~7 copies/g),梭菌占总细菌的相对丰度在发酵20 d达到最高(6.67%);对梭菌群落结构的聚类分析结果表明,发酵7 d的酒醅梭菌群落结构显著区别于其他发酵时间,主要体现为存在17个标志性OTU,其中大部分分类学地位尚不明确;PICRUSt分析显示梭菌主要参与氨糖与核糖代谢、磷酸戊糖途径,其次是果糖和甘露糖代谢、TCA循环、糖酵解途径、丙酸及丁酸代谢。【结论】泸型酒酒醅中梭菌的生物量和占细菌的相对丰度在发酵开始后的2-3周内逐渐达到最高,而梭菌群落的结构则在发酵1周内便发生了显著改变,并在发酵2-3周内趋于稳定。在发酵2-3周时有较多与丙酸、丁酸等风味物质代谢相关的基因在酒醅梭菌中被预测到。     

清香型白酒中乳酸菌和酵母菌的相互作用

【目的】探究清香型白酒中不同乳酸菌和酵母菌的相互作用,了解不同菌株的发酵性能,为更深入地认识白酒发酵机理、实现发酵过程优化提供理论基础。【方法】利用程序控温和固态发酵模拟清香型白酒酿造环境,测定纯培养和共培养中菌株的理化指标、活菌数以及主要代谢产物的变化。【结果】Saccharomyces cerevisiae YJ1糖消耗快产乙醇和酯类物质多,Lactobacillus plantarum JMRS4糖消耗快产酸较多。共培养中乳酸菌对Saccharomyces cerevisiae YJ1的生长和产乙醇抑制较大,对Candida aaseri MJ7产乙醇几乎无影响。乳酸菌对Pichia kudriavzevii MJ14的生物量和乙醇代谢抑制作用较小,还对其产己酸乙酯、乙酸乙酯和异戊醇等代谢产物有促进作用;而反过来Pichia kudriavzevii MJ14对3株乳酸菌产乳酸均有抑制作用,对产乙酸则有促进作用。【结论】建立了一种固态培养方法,结合清香型白酒发酵温度变化规律,有效模拟了实际发酵环境。Pichia kudriavzevii MJ14在与乳酸菌共培养中受到的抑制较小并能有效抑制乳酸菌产乳酸,Saccharomyces cerevisiae YJ1能代谢产生多种风味物质,对清香型白酒酿造有重要意义。