极小胚胎样干细胞的生物学特性

近年来,研究者从小鼠骨髓和其他组织脏器中分离并纯化了一类数量极其稀少的极小胚胎样干细胞（very small embryonic—like stem cells,VSELs）。VSELs不仅表达多能干细胞的表面分子标记,并能向3个胚层方向分化。有学者推测,VSELs可能是在哺乳动物组织／器官的发育早期迁移并定居下来的,且能在特定情况下向组织特异的单潜能干细胞方向分化。据此,VSELs可能在成体组织的更新和损伤组织的再生修复过程中发挥重要作用。     

影响鸡原始生殖细胞分离克隆因素的研究（简报）

具有多向分化潜能的胚胎干细胞有两种来源：一是来自于早期胚胎内细胞团的胚胎干细胞(Em．bryonic Stem Cells,ESCs),另一种是来自于胚胎生殖腺原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)的胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells,EGCs)。     

鸡类囊胚获得及其生物学特性研究

鸡胚是研究胚胎发育、组织分化、基因表达与调控良好的实验模型, 是动物功能基因组学研究的重要材料. 实验选取白来航蛋鸡所产新鲜种蛋, 采用纸环法收集胚盘, 机械打碎后进行悬浮培养, 获得了哺乳动物囊胚样结构, 命名为类囊胚. 体外培养12~24 h是类囊胚发育的高峰期, 其直径显著增加近1倍. FBS可促进类囊胚的发育, 而卵黄在12 h前对类囊胚发育没有明显影响, 但到24 h时可促进类囊胚的贴壁生长. 经碱性磷酸酶(AKP)染色初步显示类囊胚中含有大量碱性磷酸酶活性的胚胎干细胞, 胚胎干细胞特异性表面标志SSEA-1免疫荧光染色后呈阳性, 进一步肯定了类囊胚中ES细胞的存在, 最终从贴壁类囊胚中分化出神经样和成纤维样等多种类型细胞. 由此可以得出: 悬浮培养鸡胚盘细胞可以形成含有胚胎干细胞的、类似哺乳动物囊胚样的结构, 并能保持其内胚胎干细胞的特性和分化潜能.     

用BRL-3A条件培养基培养鸡胚胎干细胞的初步研究

以CEF细胞、MEF细胞和STO细胞为饲养层,用:BRL-3A条件培养基培养寿光鸡X期胚盘细胞,并对获得的细胞克隆进行了鉴定,证明其具有ES细胞的克隆形态、PAS染色阳性、AKP染色阳性、能分化为多种类型的细胞、能参与受体胚胎的发育并形成羽色嵌合体.实验结果表明:BRL-3A条件培养基能促进鸡ES细胞克隆的形成,用饲养层比不用饲养层更有利于克隆的形成,且STO细胞和MEF细胞饲养层的培养效果要好于CEF细胞饲养层(P<0.05);挑克隆传代法比全消化法更有利于克隆的形成和未分化状态的维持(JP<0.05).     

从原始生殖细胞分离克隆鸡胚胎生殖细胞的研究

从孵化 5 5天的鸡胚生殖腺中分离得到大量原始生殖细胞 (PGCs)集落 ,这些集落的细胞经多次克隆传代具有胚胎生殖细胞 (EG)的诸多特征 ,如有连续传代的能力 (传至第 9代 ) ,细胞集落有典型鸟巢状结构 ,PAS染色阳性 ,AKP染色阳性 ,在无饲养层无分化抑制因子LIF时可以自发分化成几种细胞类型 ,包括成纤维细胞、神经细胞、自律细胞等 ,悬浮培养时具有形成类胚体的能力。上述发现表明该细胞具EG细胞的诸多特性 ,为类EG细胞     

鸡胚ESC和SSCs特定基因表达差异的研究

目的:探讨鸡胚胎干细胞(ESC)和精原干细胞(SSCs)在基因表达水平上的差异.方法:传至二代的ESC和SSCs,采用免疫荧光和碱性磷酸酶检测法联合鉴定其干细胞特性,RT-PCR方法检测两者相关基因的表达差异.结果:两种处于未分化状态时的干细胞基因表达存在差异:未分化的ESC表达基因GDF3基因和Nanog基因;SSCs表达特定基因c-kit、Cvh和Stra8基因.结论:两种干细胞在基因表达水平上有差异,为ESC与SSCs在基因水平上的鉴定提供参考依据.     

鸡胚原始生殖细胞的分离和鸡鸭嵌和体的制备

探索了鸡胚12～17期血液中的原始生殖细胞(PGCs)迁移数量变化规律,将其在液氮中冷冻保存.并以Ficoll密度梯度离心、MiniMACS磁气分离、滤膜三种方法对PGCs进行分离,结果发现12～17期血液中均有PGCs存在,13期达到高峰约47.1±10.5个/μl,在血液中比例为0.0126%.冷冻保存3个月后解冻成活率达80%以上.三种分离方法所得的分离效果分别为95.7%、39.2%、63.0%,纯度为27.5%、8.4%、3.1%.将分离的原始生殖细胞以微注射法转移至14～15期麻鸭胚胎中制备了鸡鸭种间嵌和体,获得8只雏鸭(8/110).以鸡W染色体探针原位杂交法在早期鸭胚性腺中检测到鸡原始生殖细胞,嵌和率达84.2%(16/19).表明鸡原始生殖细胞能够迁移定居到鸭胚性腺中,并有可能增殖分化成有功能的配子.     

鸡胚胎原始生殖细胞的培养和传代

本文旨在探索鸡胚胎原始生殖细胞(Primordialgermcells,PGCs)培养、传代以及各种因素对PGCs培养的影响。实验结果表明,在添加10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ巯基乙醇、10μl/ml非必需氨基酸、以及5ng/ml人干细胞生长因子(Humanstemcellfactor,hSCF)、10U/ml鼠白血病抑制因子(Mouseleukemiainhibitoryfactor,mLIF)、10ng/ml碱性成纤维生长因子(Fibroblastgrowthfactorbasic,bFGF)、0.04ng/ml人白细胞介素11(Humaninterleukin11,hIL11),10ng/ml胰岛素样生长因子(Humaninsulinlikegrowthfactor,hIGF)的高糖DMEM培养体系中,以多次离散法进行传代获得5-6代鸡胚胎PGCs,有效地维持了PGCs的未分化状态和正常二倍体核型,同时能够定向地诱导分化为神经细胞,具有作为多能性胚胎干细胞的特征     

转基因鸡生产的理论和实践

近年来,已成功地将外源基因导入许多动物体内,在提高动物生产率和在免疫学、肿瘤学研究方面做出了巨大贡献,第一个转基因动物是由Ｇｏｒｄｏｎ等于１９８０年培育出的转基因小鼠,转基因动物一词是由Ｇｏｒｄｏｎ和Ｒｕｄｄｌｅ在１９８３年提出的。转基因动物就是指被通过添加或删除一个特殊的ＤＮＡ序列,其遗传结构得到了修饰的动物,其改变了的染色体ＤＮＡ可遗传给后代,通过转基因操作所产生的动物叫做建造动物（ＦｏｕｎｄｅｒＡｎｉ－ｍａｌ）,只有部分建造动物的性细胞整合有外源基因［１］。目前为止,转基因动物多数是采取向受精卵原核中注入ＤＮＡ而获得的。自从Ｓｈｕｍａｎ和Ｓｈｏｆｆｎｅｒ［２］在１９８２年第一次将转基因技术应用于家禽之后,许多学者正致力于这方面的工作。家禽的世代周期短,生产性能高,最适合于转基因技术的应用。但家禽繁殖系统的特殊性导致转基因家禽研究,始终落后于其他动物。     

低氧对体外培养鸡原始生殖细胞凋亡的影响

本研究的目的是通过低氧处理体外培养的鸡原始生殖细胞(Primordial germ cell)优化培养系统,降低细胞凋亡率,提高细胞活力,为高效生产转基因鸡提供科学依据。研究采用低氧气体(1%O_2)分别处理鸡PGCs 6 h、12 h、24 h,随后用q-PCR检测凋亡相关基因Caspase3的表达。与常氧组(21%O_2)相比,1%O_2-24h低氧组Caspase3显著下调(p0.05)。进一步检测1%O_2-24 h低氧组p53和Bcl2的表达情况,结果显示p53表达显著下调(p0.05),Bcl2表达无显著差异。采用流式细胞术检测细胞凋亡比例,低氧组((13.5±0.8)%)凋亡比例低于常氧组((21.8±2.1)%)。采用q-PCR,免疫荧光染色,细胞迁移鉴定低氧处理后的鸡PGCs生物学特性,发现其仍保持生殖细胞的生物学特性。本研究表明,在体外培养条件下,1%O_2低氧处理鸡PGCs 24 h能抑制细胞凋亡,且不改变其生物学特性。     

细胞因子对鸡胚胎原始生殖细胞（EPGCs）增殖的影响

采用MTT法分别检测mLIF、bFGF、hSCF、hIL-11四种细胞因子协同作用对体外培养的第19、28期鸡EPGCs生长的影响。结果表明：与对照组相比较,19期的EPGCs体外培养72h后, mLIF、hSCF、bFGF、hIL-11对鸡EPGCs的增殖影响显著（P<0.05）。mLIF的最佳作用剂量是10~20ng/ml,hSCF的最佳作用剂量是15~20ng/ml,bFGF的最佳作用剂量是10～20ng/ml。hSCF、bFGF的联合使用优于单因子作用的结果（P<0.05）。单独使用hIL-11时,细胞的增殖情况比其他三因子单独使用的效果较差,但OD均值有随剂量增高而上升的趋势。在与其他因子联合使用的情况下, hIL-11的最佳作用剂量为0.10~0.20ng/ml。     

鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV干扰载体的构建及筛选

旨在构建靶向鸡胚胎干细胞多能性相关基因cNanog和cPouV的siRNA表达载体,并在体外检测其对cNanog和cPouV表达的抑制作用。分别选择cNanog和cPouV中3个区域合成寡聚核苷酸构建siRNA表达载体,同时构建cNanog和cPouV全基因表达载体来检测基因表达下调的效果。经Western blotting检测显示,所构建的siRNA表达载体可在293T细胞内表达siRNA或shRNA,诱发RNA干扰效应,从而抑制目的基因cNanog和cPouV的表达。不同位点的寡核苷酸序列抑制效率不同,其中pS3-cNanog和pS3-cPouV重组质粒的干扰效果和抑制效率最好。研究结果为后续得到稳定干扰cNanog和cPouV基因的重组载体和进一步研究cNanog和cPouV基因功能奠定了基础。     

不同饲养层对鸡胚胎干细胞培养效果的影响

目的:为探索鸡胚胎干细胞培养的优化条件,比较不同饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养的效果。方法:用传至第2代的鸡胚成纤维细胞与鸭胚成纤维细胞,经丝裂霉素处理后制作饲养层,比较这2种饲养层以及不用饲养层对鸡胚胎干细胞离体培养效果的影响。结果:在以鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞作为饲养层的培养体系中,鸡胚胎干细胞均可保持良好的生长状态,而且2种饲养层对鸡胚胎干细胞克隆形成的影响差异不显著(P0.05)。结论:鸡胚成纤维细胞和鸭胚成纤维细胞均可作为较好的饲养层细胞用于鸡胚胎干细胞的离体培养。     

禽类多能干细胞的研究与应用

禽类多能干细胞是一种未分化的细胞,来源于X期未孵化的胚盘细胞或5.5 d性腺的原始生殖细胞,具有自我更新能力,并能分化为所有类型细胞,包括生殖系.禽类多能干细胞最重要的应用就是在体外对其基因组进行特异性修饰,用来制备转基因禽类.禽类多能干细胞的培养已取得显著进步,随着对其多能性分子基础等研究的深入,禽类多能干细胞也将得到充分运用.综述了禽类多能干细胞的培养方法、生物学特性及其应用进展.     

鸡胚血液中原始生殖细胞的分离及其培养的研究

从孵化４８～５５小时鸡胚中抽取血液,每只胚胎可获血液２～６μｌ左右。一步法离心分离原始生殖细胞,可使其浓度由０．１％以下提高到５０％以上。将多余血细胞用微量吸管移走后,加入添加１０％胎牛血清的ＴＣＭ—１９９做为培养基,３７．５℃,５％ＣＯ２,９５％空气,饱和湿度下培养,原始生殖细胞可成活２４小时左右。     

影响鸡原始生殖细胞分离克隆因素的研究(简报)

具有多向分化潜能的胚胎干细胞有两种来源:一是来自于早期胚胎内细胞团的胚胎干细胞(Em-bryonic Stem Cells,ESCs),另一种是来自于胚胎生殖腺原始生殖细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)的胚胎生殖细胞(Embryonic Germ Cells,EGCs)。     

胚胎干细胞SM22α-EGFP表达克隆的建立及平滑肌细胞体外发育的动态观察

为探讨血管发育早期血管平滑肌细胞(VSMCs)募集和增殖特点,构建了含有SM22α启动子序列和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)编码序列的质粒,建立了平滑肌特异性蛋白SM22α启动子控制下稳定表达EGFP的胚胎干细胞株(ESCs),以研究VSMCs的发育特点.实验发现,起源于SM22α-EGFPESCs形成的胚胎小体(EBs)在第11天开启SM22α启动子并表达EGFP.此后EGFP阳性细胞持续增加,在第30天达到高峰.VSMCs多起源于EBs中细胞密集处,应用免疫荧光染色及RT-PCR观察到EGFP阳性细胞表达多种平滑肌特异性标志物.在贴壁培养的胚胎小体中VSMCs形态可分为纺锤形及上皮样的多角形,慢速视频显微摄像测得纺锤形细胞迁移速度较上皮形细胞快.以上结果表明,SM22α-EGFPESCs分化形成的EBs可以模拟体内早期胚胎血管形成过程,从形态学上获得VSMCs募集分化的证据.     

蒙古绵羊原始生殖细胞用于胚胎干细胞培养的研究

原始生殖细胞是用做分离和克隆胚胎干细胞的一种新的细胞资源。本研究将30-45日龄的蒙古绵羊胚胎生殖嵴及其临近组织用机械剪碎和胰蛋白酶+EDTA消化处理,添加DMEM（低糖）+10%FBS（犊牛血清）、38.0℃、5%CO2和饱和湿度条件下进行培养。其结果：未加任何细胞生长因子的情况下与其胎儿成纤维细胞共培养的方式也能分离得到类胚胎干细胞集落。这些集落细胞经多次克隆传代具有胚胎干细胞的诸多特征,如：具有连续传代的能力,细胞集落有典型鸟巢状结构,AKP染色呈阳性,核型分析结果染色体正常等。这些表明该细胞具有多能性,是绵羊类ES细胞。     

胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中能量代谢变化的研究

本文通过定向诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,对分化过程中胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞糖酵解能力和线粒体氧化磷酸化能力进行实时定量检测,旨在探索分化过程中细胞能量代谢表型的转换机制.用GSK3抑制剂CHIR99021和Wnt信号通路小分子抑制剂IWP2的方法定向分化人胚胎干细胞为心肌祖细胞和心肌细胞;细胞免疫荧光检测人胚胎干细胞标志物,流式细胞术检测人心肌祖细胞和心肌细胞标志物;应用细胞外流量分析(extracellular flux analysis)方法检测人胚胎干细胞、心肌祖细胞和心肌细胞能量代谢情况.研究发现,人胚胎干细胞干性保持稳定,均表达Nanog、OCT4、SOX2细胞标志物;在向心肌分化过程中,第7 d心肌祖细胞标志物Isl1表达99%以上,分化第14 d心肌细胞标志物cTnT表达83%以上;人胚胎干细胞糖酵解代谢能力最强,心肌细胞线粒体功能最强,心肌祖细胞处于两种代谢方式的过度阶段.因此推断,在人胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中,细胞糖酵解能力逐渐减弱,线粒体氧化磷酸化能力逐渐增强,细胞的能量代谢类型发生转变.本研究旨在优化人胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的方法,揭示...     

胎牛雄性生殖干细胞源类ES细胞的分离培养与多能性研究

雄性生殖干细胞(male germ stem cells , mGSCs)来源于原始生殖细胞(primordial germ cells ,PGCs) ,且终生存在于性分化后的睾丸中。从20周胎牛分离睾丸细胞,2步连续贴壁速率差法能有效纯化胎牛mGSCs ,经流式细胞仪检测,CD9阳性细胞的比例达到95.8 %。原代与支持细胞共培养,出现隆突状和鸟巢状两种细胞集落。获得1株传至4代仍呈现集落生长的细胞株,且集落AKP染色阳性。对第3代鸟巢状细胞集落免疫组化和诱导分化分析,结果显示:SSEA1和Oct-4免疫组化染色阳性;短期内可自发形成c-kit染色阳性的分化态精原细胞;定向诱导分化形成了表达神经丝蛋白(Neuro filament ,NF)的神经样细胞和表达α-actin的心肌样细胞团。试验结果表明:20周胎牛雄性生殖干细胞在体外可形成具有多分化潜能性的类胚胎干(embryonic stem,ES)细胞。