序列变异对miR-378生物发生以及靶标关系的影响

本研究旨在探索序列变异对miR-378的结构、表达水平以及靶标关系的影响.利用PCR测序比对不同猪种miR-378的序列突变,预测突变对miR-378二级结构和自由能的改变;构建miR-378表达载体检测突变对其加工过程中各级产物表达水平的作用;运用TargetScan和TargetRank对突变引起的靶标关系变化进行...     

调节猪TNF-α表达的miRNAs鉴定

肿瘤坏死因子α(TNF-α)是脂肪细胞的分泌产物之一,在脂肪中行使着复杂的调节功能,为了研究猪脂肪组织中TNF-α的表达受到哪些miRNA的调控,从猪脂肪组织基因组中获得猪TNF-α3'端非翻译区(UTR)序列,与荧光素酶质粒PGL3-control连接构建猪TNF-α的萤光素酶表达质粒PGL3-TNF-α3'UTR。生物信息学预测miR-19a,miR-124,miR-130a,miR-301,miR-506等miRNAs均靶向猪TNF-α,将这些miRNA分别与PGL3-TNF-α3'UTR质粒共转到细胞中,以乱序序列作为阴性对照(NC),检测miRNA对质粒荧光素酶活性的作用。结果发现miR-19a,miR-124和miR-130a均能够显著抑制萤光素酶的活性(P0.01),为了验证这3个miRNA是否通过各自种子序列起调控作用,突变了PGL3-TNF-α3'UTR中这3个miRNA种子序列的结合位点,结果发现miRNAs对突变质粒中的荧光素酶均无明显抑制作用(P0.05)。结果证明,miR-19a,miR-124和miR-130a与猪TNF-α均有直接的靶向关系并通过各自种子序列抑制TNF-α的表达。     

牦牛miR-378前体克隆及组织表达分析

旨在克隆牦牛miR-378的前体序列,阐明其组织表达规律,结合bta-miR-378靶基因的生物信息学预测和分析,探讨miR-378在牦牛生长发育过程中的调控功能。采用PCR方法成功克隆类乌齐牦牛miR-378前体序列,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-378-3p在各组织中的表达模式,结合生物信息学软件TargetScan、DAVID以及数据库NCBI、miRbase等对miR-378进行保守性分析、靶基因预测及其生物学功能分析。结果表明,miR-378在各物种间高度保守,且miR-378-3p在各组织中广泛表达,其中在臀大肌中表达水平最高,显著高于其他组织(P<0.01),在臀脂中的表达高于卵巢、大脑、乳腺和肝脏。获得的272个靶基因主要参与细胞分化、细胞发育、大分子代谢等多个生物学过程,涉及孕酮介导的卵母细胞成熟、促性腺激素释放激素(GnRH)信号通路等,由此推测,miR-378可能在卵泡发育、卵母细胞成熟过程中起关键作用,进而影响母牦牛的繁殖性能。     

miR-378转基因小鼠骨骼肌组织的代谢表型分析

骨骼肌是机体最大的代谢器官,对机体代谢稳态有重要调控功能。该课题组前期工作发现miR-378可以调控机体能量代谢稳态,为探究过表达miR-378对骨骼肌组织代谢的影响,该研究利用核磁共振技术系统分析了miR-378转基因小鼠及同窝的野生型对照小鼠骨骼肌组织的代谢谱差异。研究结果显示, miR-378对骨骼肌代谢有重要调控功能,过表达miR-378使骨骼肌组织肌酸、氨基酸代谢物(谷氨酸、谷氨酰胺)及核酸代谢物(次黄嘌呤)增多,而乳酸、磷酸肌酸、甘油等代谢产物明显减少,提示miR-378转基因小鼠骨骼肌处于能量匮乏状态。进一步对AMPK信号通路相关蛋白的分析表明,miR-378转基因小鼠骨骼肌组织AMPKa及ACC磷酸化水平增加, AMPKa的激活进一步支持miR-378过表达导致骨骼肌组织能量不足。以上结果提示, miR-378对骨骼肌组织代谢有重要调控功能。     

miR-378促进脂质生成相关靶基因鉴定

旨为验证miR-378在脂肪细胞中的功能,及其脂质相关靶基因的筛选和鉴定.利用miR-378类似物转染3T3-L1细胞,验证miR-378在脂肪细胞中的功能;根据靶标位点的保守性以及促脂功能确定miR-378潜在靶基因;采用microRNA pulldown技术验证miR-378与靶基因的靶标关系;运用双荧光素报告基因...     

microRNA-378i抑制横纹肌肉瘤细胞增殖和迁移

该文主要研究了microRNA-378i(miR-378i)在人横纹肌肉瘤细胞中的表达水平及其对细胞增殖和迁移能力的影响。通过q RT-PCR(quantitative RT-PCR)法检测在横纹肌组织和横纹肌肉瘤细胞中miR-378i成熟体的水平。采用阳离子脂质体介导的方法将miR-378i成熟体转染入横纹肌肉瘤细胞,通过MTS法检测细胞增殖能力、细胞克隆形成实验检测细胞增殖和生长能力、流式细胞技术检测细胞周期,以及应用x CELLigence细胞功能分析仪检测细胞迁移能力。Western blot方法检测miR-378i对靶基因蛋白质水平的调控。结果显示,在横纹肌肉瘤细胞中,miR-378i成熟体的水平较正常横纹肌组织显著下调。恢复miR-378i的表达水平能显著抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖、细胞克隆形成和迁移能力,并诱导细胞发生G1或G2期阻滞。Western blot结果显示,miR-378i能够下调IGF1Rβ的蛋白质水平。综上所述,miR-378i能够显著抑制横纹肌肉瘤细胞的增殖和迁移。     

miR-92a家族与肿瘤关系的研究进展

miR-92a家族基因是由miR-25、miR-92a~1、miR-92a~2和miR-363等序列相似、结构相仿、种子区序列相同的微小RNA(microRNAs)组成,它们分别来自在进化过程中高度保守并互为旁系同源序列的miR-106b~25、miR-17~92和miR-106a~363基因簇。目前研究认为,miR-92a家族基因是一组与血管内皮细胞形成有关的miRNAs,其表达紊乱与肿瘤的发生发展密切相关。就miR-92a家族基因及其靶基因与肿瘤关系的研究进展进行综述。     

miR-26家族与肿瘤关系的研究进展

miR-26家族是由miR-26a、miR-26b、miR-1297及miR-4465等序列相似、结构相仿、种子区序列相同(UCAAGUA)的微小RNA(microRNAs,miRNAs)组成。多种组织细胞分化过程中伴有mi R-26家族表达的增加,其异常表达与特发性肺纤维化、原发性胆汁性肝硬化、多发性硬化及阿尔茨海默病等有关。近年研究报道,多种肿瘤组织亦存在mi R-26基因表达紊乱,并与肿瘤的发生发展密切相关。就miR-26家族及其调控的靶基因与肿瘤关系的研究进展进行综述。     

MiR-378a-5p直接靶ZEB1向上调鼻咽癌CNE-1细胞E-cadherin表达*

目的： Mir-378a-5p是一种被发现多年的微小RNA,其在包括肺癌、结肠癌和乳腺癌等多种肿瘤中都被认为具有抑制肿瘤生 长的作用。Mir-378a-5p与细胞增殖的关系在多篇文章中已经有较为详细的阐述,然而,目前没有报道提及miR-378a-5p是否通过 作用于细胞迁移和细胞粘附途径从而达到抑制肿瘤生长的作用。方法与结果：在本研究中,我们通过wound healing 和trans-well 的方法发现在鼻咽癌细胞CNE-1 中过表达miR-378a-5p显著的抑制了细胞迁移以及细胞浸润的过程。通过免疫印迹方法,我们 揭示了细胞粘附因子E-cadherin在过表达miR-378a-5p后显著上调。通过生物信息学的方法,我们预测了miR-378a-5p的可能作 用靶点,并通过双荧光报告载体的方法证实了ZEB1是miR-378a-5p的直接靶点。结论：我们的研究提示了miR-378a-5p造成的E-cadherin 的上调是通过直接抑制E-cadherin的负调控因子ZEB1造成的。E-cadherin的上调不但影响了细胞的迁移和粘附,而且 通过间接阻断Wnt通路抑制了下游控制细胞增殖的基因表达。本研究为理解miR-378a-5p的肿瘤抑制作用提供了一个新的作用 机理。     

急性冠脉综合征患者外周血miR-378a-3p的表达及其诊断价值

摘要 目的：探讨急性冠脉综合征（ACS）患者外周血miR-378a-3p的表达及其诊断价值。方法：收集ACS患者和健康人（control）血清各3份,进行基因芯片检测筛选发现miR-378a-3p差异表达最为显著。利用网络药理学分析miR-378a-3p与心肌缺血的相关性。构建小鼠心肌缺血再灌注（IR）模型,按缺血再灌注时间不同分为假手术（sham）组、I/R 1h组、I/R 3h组、I/R 6h组、I/R 12h组,检测外周血miR-378a-3p表达水平以及心肌肌钙蛋白T（cTnT）浓度水平。收集ACS患者（101例）和同期健康体检人群（49例）,进行实时定量PCR,检测miR-378a-3p在ACS患者的表达。采用受试者工作特征曲线（ROC）分析miR-378a-3p诊断ACS的诊断效能,并对ACS进行风险评估。结果：基因芯片结果显示miR-378a-3p在ACS患者外周血中表达升高。网络药理学分析提示,miR-378a-3p与心肌缺血存在共同靶点且miR-378a-3p可能通过细胞凋亡和血管生成途径干预心肌缺血,有作为心肌缺血标志物的可能。动物实验证实miR-378a-3p表达量随心肌缺血时间变化逐渐上调且在6h时表达明显升高,且miR-378a-3p表达水平较cTnT更早在心肌缺血中出现高表达。临床数据分析表明,同健康对照组比较,ACS患者血清中的miR-378a-3p在发生ACS的临床症状后,在短时间内可以显著升高。miR-378a-3p作为ACS的特异性诊断指标时,曲线下面积（AUC）为0.8476（95%可信区间为0.7749- 0.9204, P<0.001）,约登指数为0.6981,采用0.214作为cut-off值,miR-378a-3p诊断ACS的灵敏度和特异度分别为86.14%和83.76%。进一步的研究显示,在缺血的转化过程中,根据疾病分类的不同,结果显示miR-378a-3p的表达趋势也不同,在不稳定型心绞痛（UA）和心肌梗死（MI）组中,miR-378a-3p都显著上调（P<0.001）,同MI患者相比,UA患者miR-378a-3p表达上调更显著（P<0.05）,提示在诊断和判断ACS的分类中有较好的价值。结论：ACS患者外周血中miR-378a-3p表达升高是ACS发生的独立危险因素,早期检测miR-378a-3p有助于预测ACS的发病情况。     

MiR-378a-5p直接靶向ZEB1上调鼻咽癌CNE-1细胞E-cadherin表达(英文)

目的:MiR-378a-5p是一种被发现多年的微小RNA,其在包括肺癌、结肠癌和乳腺癌等多种肿瘤中都被认为具有抑制肿瘤生长的作用。Mi R-378a-5p与细胞增殖的关系在多篇文章中已经有较为详细的阐述,然而,目前没有报道提及miR-378a-5p是否通过作用于细胞迁移和细胞粘附途径从而达到抑制肿瘤生长的作用。方法与结果:在本研究中,我们通过wound healing和trans-well的方法发现在鼻咽癌细胞CNE-1中过表达miR-378a-5p显著的抑制了细胞迁移以及细胞浸润的过程。通过免疫印迹方法,我们揭示了细胞粘附因子E-cadherin在过表达miR-378a-5p后显著上调。通过生物信息学的方法,我们预测了miR-378a-5p的可能作用靶点,并通过双荧光报告载体的方法证实了ZEB1是miR-378a-5p的直接靶点。结论:我们的研究提示了miR-378a-5p造成的E-cadherin的上调是通过直接抑制E-cadherin的负调控因子ZEB1造成的。E-cadherin的上调不但影响了细胞的迁移和粘附,而且通过间接阻断Wnt通路抑制了下游控制细胞增殖的基因表达。本研究为理解miR-378a-5p的肿瘤抑制作用提供了一个新的作用机理。     

Mir-378a-5p抑制鼻咽癌细胞系CNE-1 细胞增殖以及肿瘤生长的初步研究*

目的： MiR-378a-5p是一种被认为在多种肿瘤发生过程中具有抑制肿瘤生长的微小RNA。然而miR-378a-5p在鼻咽癌中的 作用尚未见报道。因此,本文旨在通过临床样本的miRNA 表达谱分析以及细胞学实验从而揭示miR-378a-5p在鼻咽癌肿瘤发生过程中的作用。方法与结果：我们通过生物信息学的方法获取了鼻咽癌临床样本中miR-378a-5p的表达信息并通过与正常组织的 对比发现miR-378a-5p在鼻咽癌肿瘤组织中表达水平显著降低（P<0.01）。其次,我们发现高表达miR-378a-5p的鼻咽癌CNE-1 细 胞增殖速度显著较对照组降低（约40%~50%）。克隆形成实验证实了瞬时转染miR-378a-5p的鼻咽癌CNE-1 细胞的克隆形成数 量显著减弱。我们通过将稳定表达miR-378a-5p的CNE-1 细胞注射到裸鼠体内形成移植瘤并记录肿瘤生长曲线,结果显示 miR-378a-5p高表达组的裸鼠移植瘤体积明显较对照组小约50%,肿瘤重量显著降低(对照组0.33 g,处理组0.15 g)。结论：本研究通过对临床样本的分析以及在细胞和动物水平的实验验证揭示了miR-378a-5p具有抑制鼻咽癌肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的作用。     

猪FSH β亚基基因结构区Alu序列插入突变的研究

通过聚合酶链式反应（PCR）对中国华北型优良地方猪种莱芜猪及杜里猪,长白猪的卵泡刺激素（FSH）β亚基基因结构区插入片段进行扩增,并对0．5kb扩增产物进行克隆和测序,序列分析表明,在已发表的猪FSHβ亚基基因全序列的＋809和＋810碱基之间,莱芜猪,杜里猪和长白猪分别存在一个长度为275,277和274bp的插入片段,插入片段末端的poly(A)分别为17,19和16个腺苷酸,均显著短于高产猪种太湖猪（292bp和32个腺苷酸）,对FSHβ亚基基因插入片段进行BamHI多态性分析,发现本研究所检测样品中不存在BamHI 多态性,插入片段中存在一个RNA聚合酶Ⅲ启动子及AluI内切酶识别位点,所以该睡段可能为Alu成分,因RNA聚合酶Ⅲ这种有功能的内部启动子能够转录相邻的染色体序列,该插入片段可能影响FSHβ亚基基因或其他基因的表达调控,把FSHβ亚基基因作为控制猪产仔数主效基因的候选基因与产仔数进行连锁分析,证明FSHβ基因因座在莱芜猪种中与控制猪产仔数的主效基因紧密连锁,优质基因AA纯合子比BB纯合子母猪平均每胎产仔1．2头,因不同品种猪插入序列的主要差异是末端的poly(A)长短不同,推测该插入片段末端的pol(A)结构亦可能影响猪的产仔数。     

MiR-378a-5p抑制鼻咽癌细胞系CNE-1细胞增殖以及肿瘤生长的初步研究（英文）

目的:MiR-378a-5p是一种被认为在多种肿瘤发生过程中具有抑制肿瘤生长的微小RNA。然而miR-378a-5p在鼻咽癌中的作用尚未见报道。因此,本文旨在通过临床样本的miRNA表达谱分析以及细胞学实验从而揭示miR-378a-5p在鼻咽癌肿瘤发生过程中的作用。方法与结果:我们通过生物信息学的方法获取了鼻咽癌临床样本中miR-378a-5p的表达信息并通过与正常组织的对比发现miR-378a-5p在鼻咽癌肿瘤组织中表达水平显著降低(P0.01)。其次,我们发现高表达miR-378a-5p的鼻咽癌CNE-1细胞增殖速度显著较对照组降低(约40%~50%)。克隆形成实验证实了瞬时转染miR-378a-5p的鼻咽癌CNE-1细胞的克隆形成数量显著减弱。我们通过将稳定表达miR-378a-5p的CNE-1细胞注射到裸鼠体内形成移植瘤并记录肿瘤生长曲线,结果显示miR-378a-5p高表达组的裸鼠移植瘤体积明显较对照组小约50%,肿瘤重量显著降低(对照组0.33 g,处理组0.15 g)。结论:本研究通过对临床样本的分析以及在细胞和动物水平的实验验证揭示了miR-378a-5p具有抑制鼻咽癌肿瘤细胞增殖和肿瘤生长的作用。     

过表达miR-191抑制猪ADSCs向脂肪细胞分化

在脂肪组织发育过程中存在许多差异表达的microRNAs（miRNAs）,而 miR-191 是从实验室前期Solexa测序结果中筛选出的差异表达miRNAs之一.本研究对不同物种miR-191的成熟及前体序列进行同源性分析,并检测其在猪不同发育阶段各组织中的表达情况,发现miR-191的成熟及前体序列在不同物种间都非常保守,通过real-time qPCR检测发现,miR=191在猪脂肪组织不同发育阶段呈高丰度差异表达,其与Solexa测序结果一致.为了更好地研究miR-191在脂肪细胞分化过程中的功能,通过基因克隆的方法,利用Ad-Easy体系,构建过表达miR 191的腺病毒载体,转染 293A细胞,成功包装出重组 miR-191腺病毒并能高效侵染猪脂肪基质细胞（adipose derived stromal cells, ADSCs）.通过real time qPCR检测表明,感染重组 miR-191 腺病毒后的ADSCs能大量表达miR-191|油红O染色可以观察到,过表达miR=191的猪ADSCs在诱导分化后与对照组相比,脂滴明显减少. 进一步研究发现,miR-191过表达的猪ADSCs中,SREBP-1C（sterol regulatory element binding protein=1C）和LPL（lipoprotein lipase）的mRNA水平显著降低,脂解关键基因HSL（hormone sensitive lipase）和ATGL（adipose triglyceride lipase）mRNA水平显著升高. 同时,Western印迹结果显示,过表达miR-191的猪ADSCs在诱导分化过程中,PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor γ）、C/EBPα（CCAAT/enhancer binding protein α）和A-FABP（adipocyte fatty acid binding protein）的蛋白表达水平显著下调. 实验表明,过表达miR-191抑制了猪ADSCs的分化过程. 这为深入研究miR-191在猪ADSCs分化过程中的调控机制奠定基础.     

西藏小型猪线粒体D-loop区及微卫星多态性的遗传学分析

目的通过分析西藏小型猪线粒体控制区(D-loop区)及微卫星位点的遗传多态性,检测西藏小型猪的遗传背景,从而为其作为实验动物提供分子生物学方面的可靠依据。方法利用特异性引物对西藏小型猪的线粒体D-loop区及10个具有多态性的微卫星位点进行扩增,割胶纯化并对线粒体D-loop区进行测序,另外采用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法分离微卫星位点的等位基因。结果西藏小型猪线粒体D-loop区全序列没有多态性,微卫星位点则具有高度的遗传多态性和杂合度,分别为0.584和0.573。结论西藏小型猪线粒体基因组无多态性,证明其在母系进化和遗传上与其他猪种较为一致,本实验所用的西藏小型猪生长于一个封闭的环境,导致其微卫星位点遗传多态性的中低度水平。     

广西巴马小型猪miR-181b慢病毒表达载体的构建和鉴定

本试验旨在构建广西巴马小型猪miR-181b慢病毒表达载体,以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,利用PCR扩增miR-181b前体序列,构建重组质粒p LV-miR-181b,经PCR和测序鉴定,阳性重组质粒转染C2C12细胞,荧光倒置显微镜下检测转染效率。结果显示,miR-181b前体序列长度为377 bp,与预期片段序列长度一致。将鉴定为阳性的miR-181b重组质粒转染C2C12细胞48 h后,在荧光显微镜下检测到较强的绿色荧光蛋白的表达,说明重组miR-181b质粒在C2C12细胞中具有较高的表达活性。本研究成功构建了具有高表达活性的miR-181b重组慢病毒表达载体,为研究miRNA-181b调控骨骼肌生长发育的功能机制提供实验基础。     

miR-221/222及其靶基因与恶性肿瘤关系的研究进展

miR-221和miR-222 (miR-221/222)是由同一祖先基因重复产生的旁系同源物,它们在核酸序列上非常接近,并具有相同的种子序列“AGCUACAU”.miR-221/222在正常内皮细胞中高表达,在心血管系统的发育和生理功能的维持方面发挥重要作用,其异常表达与心血管疾病、代谢性疾病、免疫性疾病、神经退行性...     

miR-378转基因小鼠脂肪组织的代谢表型分析

microRNA是一类小分子非编码RNA,参与调控多种生物学过程。该研究组前期工作中揭示了microRNA-378(miR-378)在脂肪组织中通过靶向硬脂酰CoA去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1, Scd1)调控脂分解。为了系统明确在脂肪组织中miR-378调控的代谢通路,该研究采用核磁共振技术分析了miR-378转基因小鼠和同窝野生型对照小鼠脂肪组织的代谢组差异。两种脂肪组织三个不同部位(棕色脂肪BAT、附睾旁白色脂肪gWAT、皮下白色脂肪iWAT)的代谢组学分析结果显示:miR-378转基因小鼠BAT中甘油磷酸胆碱、胆碱、丙二酸等代谢物含量更高;而gWAT脂肪组织中牛磺酸、丙二酸、次黄苷等代谢物含量更高; iWAT脂肪组织中牛磺酸、甘氨酸、谷氨酸、丙二酸等代谢物含量较高,而脂质、腺嘌呤核苷(adenine nucleoside, AMP)、二磷酸核苷(nucleoside diphosphate, ADP)及三磷酸核苷(nucleoside triphosphate, ATP)等代谢物含量较低。总体上, miR-378转基因小鼠脂肪组织中脂质含量减少,脂质分解作用及氨基酸代谢增强,整个机体的能量代谢增强。该研究结果揭示了miR-378对脂肪组织代谢具有重要调控作用。     

microRNA-378 与相关疾病的研究进展

microRNAs是一类内源性表达的、长度约为22个核苷酸的非蛋白编码的单链RNA分子,是重要的转录后基因表达调控因子。在多种生理和病理过程中发挥重要作用,到目前为止,在动植物以及病毒中已经发现有24521个miRNA分子,miR-378是其中的一种,miR-378通过多种机制与众多疾病的发生发展密切相关。miR-378在不同肿瘤组织中起到不同作用,在胃癌,肝癌,结直肠癌等肿瘤中起到抑癌基因的作用,在白血病,胰腺癌,卵巢癌等肿瘤中起到癌基因的作用。在心血管方面,miR-378可以通过多种机制起到保护血管,延缓心血管疾病的发展。在骨代谢方面,miR-378可通过不同机制抑制或促进成骨细胞的分化。本文就其与肿瘤、心血管、骨代谢以及其他方面的研究进行介绍,为这些疾病的治疗和预防提供一种新的思路。