稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR),从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭(Oryza sati-va L. cv.Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段.对这8个差示片段进行了回收、重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针,筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆.序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源性高达96%,推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致,与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸.Southern杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数,Northern杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达.因此推测该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应.     

稻瘟病菌孢子和毒素对水稻抗病性的诱导与苯丙烷类代谢途径的关系

用稻瘟病菌孢子和毒素处理水稻幼苗能诱导水稻对稻瘟病的抗性,经诱导的水稻植株提取液对稻瘟病菌生长有抑制作用。苯丙烷类代谢途径的三个关键酶(PAL、CA4H、4CL)活力在水稻萌发过程中都有一个消长过程,并存在着伴随性。毒素处理提高了PAL和4CL的活力。     

稻瘟菌侵染诱导水稻凝集素基因的表达

利用mRNA差异显示技术（DDRT-PCR）,从非亲和性稻瘟菌生理小种131侵染的水稻品种爱知旭（Oryza sati-vaL.cv.Aichi-asahi)叶片中分离了8个诱导差异表达的cDNA片段,对这8个差示片段进行了回收,重扩增和克隆,以其中一个长度为321碱基并与甘露糖结合水稻凝集素和水稻盐诱导蛋白基因高度同源的差示片段为探针。筛选水稻非亲和性cDNA文库,获得12个阳性克隆。序列测定和数据库查询表明该基因的cDNA与水稻凝集素基因的cDNA及盐诱导蛋白基因的cDNA核苷酸同源笥高达96%。推定的氨基酸序列与甘露糖结合水稻凝集素的氨基酸序列一致。与水稻盐诱导蛋白仅相差2个氨基酸。Southern杂交显示该基因在水稻基因组中有两个同源拷贝数。Northern杂交表明非亲和性稻瘟菌侵染可强烈诱导该基因表达。因此推则该基因参与了水稻对稻瘟菌侵染的防御反应。     

水稻受稻瘟菌侵染后发病初期的细胞学反应

采用致病性不同的3个稻瘟菌株接种水稻IR64品种.结果显示在抗性反应中,病菌接种后水稻细胞中形成原生质颗粒,逐渐向病菌侵入部位聚集;原生质浓缩及沉积的形成、细胞坏死与病菌侵染菌丝的受抑制在时间和空间上是一致的.在中度抗性反应中,原生质颗粒化的时间延迟.在感病反应中,尚未观察到水稻细胞质浓缩现象.病菌侵染后寄主细胞在蓝光激发下的自发荧光表明,在寄主细胞中有多酚类物质的产生和积累.抗性反应中稻瘟菌接种后多酚类物质产生早,荧光范围大而强;中度抗性反应中,多酚类物质产生迟,荧光范围小而弱;而在感病反应中,难以观察到寄主细胞的自发荧光.胼胝质、磷脂酶Dγ(phospholipase Dγ,PLDγ)产生和积累的趋势与多酚类积累的情况大致是相似的.不同互作类型寄主细胞中多酚类物质、胼胝质和PLDγ产生和积累的差异表明,这些物质在水稻的抗病性中起了重要作用.     

茶多酚对稻瘟病菌的抑制作用及抑菌机理

用不同浓度茶多酚对稻瘟病菌进行抑菌和抑菌机理研究。结果表明,不同浓度的茶多酚对稻瘟病菌菌丝生长和分生孢子萌发具有很强的抑制作用。随着茶多酚浓度的增加,其抑制作用增强,其中5.00 mg/mL和10.00 mg/mL抑制效果最好,其抑制率高达100%,且分生孢子畸形,细胞破裂,原生质外溢。其作用机理主要是破坏菌体的细胞膜结构,抑制CAT、POD酶活,使其丧失细胞膜的屏障和酶系的保护功能,最终导致菌体生长受到抑制或死亡。     

稻瘟菌侵染后水稻幼苗活性氧的产物与抗病性的关系

以对稻瘟菌ＺＢ１小种表现抗病（Ｈ８Ｒ）和感病反应（Ｈ８Ｓ）的两种水稻为材料接种稻瘟菌后,表现不亲和反应的水稻幼苗叶片中Ｏ＾－２产生速率提高,于２４ｈ和６０出现两个高峰;Ｈ２Ｏ２量在３ｈ和４８ｈ分别出现高峰;ＯＨ量在３６ｈ后略高于对照;过氧化物酶（ＰＯＤ）活性从６ｈ起显著升高。而在表现亲和反应的水稻中Ｏ２＾－、Ｈ２Ｏ２和．ＯＨ的产生及ＰＯＤ活性的增加均迟于现不亲和反应的,且强度也小。ＳＯＤ和过氧化氢     

稻瘟菌诱导的水稻几丁酶、β-1.3-葡聚糖酶活性及分布

稻瘟菌(Pyricularia oryzae C.)孢子感染或菌丝培养液处理后,水稻的几丁酶和β-1,3-葡聚糖酶活力被分别诱导提高6～9倍和3～5倍。用亲和层析初步纯化的几丁酶在体外能降解稻瘟菌细胞壁和抑制它的孢子萌发。这两个酶在细胞间隙和细胞内都有分布。     

稻瘟菌糖蛋白激发子诱导的水稻叶片膜脂过氧化及过敏性反应

将稻瘟菌细胞壁来源的专化性糖蛋白激发子接种于一套水稻抗稻瘟病近等基因系后,非亲和性互作水稻超氧阴离子(O-.2)积累在互作早期明显高于亲和性互作水稻;超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性均趋于下降,不同亲和性互作水稻间的差异不明显;脂氧合酶(LOX)活性在水稻/激发子非亲和互作早期增加明显、速度快;这些指标的变化进而导致非亲和性互作水稻的膜脂过氧化,其相对电导率及丙二醛(MDA)含量的高峰期和强度也明显早于和高于亲和性互作水稻.非亲和性互作水稻过氧化物酶(POD)活性在互作早期明显高于亲和性互作水稻,可能与其参与其它抗性有关.研究同时表明,激发子可专化性诱导完全和高度非亲和性互作水稻的过敏性坏死反应;而中度非亲和性互作和亲和性互作水稻则未发生过敏性(HR)坏死反应.这些结果表明,膜脂过氧化和HR反应的发生是激发子诱导水稻抗性的主要生理机制之一.     

稻瘟菌侵染后水稻幼苗活性氧的产生与抗病性的关系

以对稻瘟菌ZB1小种表现抗病 (H8R)和感病反应 (H8S)的两种水稻为材料接种稻瘟菌后 ,表现不亲和反应的水稻幼苗叶片中O- ·2 产生速率提高 ,于 2 4h和 6 0h出现两个高峰 ;H2 O2 量在 3h和 48h分别出现高峰 ;·OH量在 36h后略高于对照 ;过氧化物酶 (POD)活性从 6h起显著升高。而在表现亲和反应的水稻中O- ·2 、H2 O2 和·OH的产生及POD活性的增加均迟于表现不亲和反应的 ,且强度也小。SOD和过氧化氢酶活性在两类反应中基本保持不变。同时发现 ,不亲和反应中丙二醛量增加 (2 4h)及其两个高峰 (30h和 6 0h)分别出现在活性氧的产生及其两个峰值之后或同时。这些结果表明水稻幼苗中产生的活性氧可能启动了膜脂过氧化 ,由此引起水稻过敏性反应中的细胞死亡而在抗稻瘟病中起作用     

稻瘟菌诱导的水稻 WRKY 基因OsWRKY52 的分离和鉴定

WRKY 蛋白参与植物对生物或非生物胁迫反应和一些发育、代谢过程,在植物中组成一个转录因子大家族 . 从水稻 cDNA 文库中分离到一个新的 WRKY 基因——— OsWRKY52 cDNA ,包括一个 1 719 bp 的开放读码框,推测编码一个由 572 个氨基酸组成的蛋白质,与燕麦 (Avena sativa) AsWRKY1 具有 54 ％的氨基酸一致性 . 该基因被非亲和性稻瘟菌快速诱导 . 凝胶阻滞实验结果表明,原核表达的 OsWRKY52 能与水稻 PR1a 启动子上的 W 盒元件特异结合 . 采用酵母单杂交体系的方法证明了 OsWRKY52 具有转录激活活性 , 其丝氨酸岛、苏氨酸岛和 C 端的富酸性氨基酸区是负责转录激活的区域 . 这些结果提示 OsWRKY52 作为一个转录激活子,可能参与植物对稻瘟菌的应答反应 .     

产绿原酸内生菌的分离及其绿原酸合成途径关键基因的克隆和功能研究

【目的】分离产绿原酸的内生菌并对其绿原酸合成途径的一种关键酶基因进行克隆和功能研究。【方法】采用表面消毒法从金银花中分离内生菌,以高效液相色谱(HPLC)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)筛选确定产绿原酸的内生菌,克隆、表达该内生菌的组氨酸解氨基酶(HAL)并进行酶活测定。【结果】从金银花根中分离到一株产绿原酸的内生细菌RP1,同时在该内生菌发酵液中检测到了绿原酸代谢的中间物肉桂酸。对RP1的分子鉴定表明该内生菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对RP1的HAL基因进行克隆和原核表达,酶活测定表明该酶具有HAL和PAL (苯丙氨酸解氨基酶)双功能,其PAL活性产生的肉桂酸与LC-MS检测的结果一致。【结论】推测该内生菌可能利用其HAL的苯丙氨酸解氨基活性将苯丙氨酸的催化产物肉桂酸导入苯丙烷途径,从而产生绿原酸。     

水稻受稻瘟菌侵染后发病初期的细胞学反应

采用致病性不同的3个稻瘟菌株接种水稻IR64品种。结果显示：在抗性反应中,病菌接种后水稻细胞中形成原生质颗粒,逐渐向病菌侵入部位聚集;原生质浓缩及沉积的形成、细胞坏死与病菌侵染菌丝的受抑制在时间和空间上是一致的。在中度抗性反应中,原生质颗粒化的时间延迟。在感病反应中,尚未观察到水稻细胞质浓缩现象。病菌侵染后寄主细胞在蓝光激发下的自发荧光表明,在寄主细胞中有多酚类物质的产生和积累。抗性反应中稻瘟菌接种后多酚类物质产生早,荧光范围大而强;中度抗性反应中,多酚类物质产生迟,荧光范围小而弱;而在感病反应中,难以观察到寄主细胞的自发荧光。胼胝质、磷脂酶Dγ(phospholipase Dγ,PLDγ)产生和积累的趋势与多酚类积累的情况大致是相似的。不同互作类型寄主细胞中多酚类物质、胼胝质和PLDγ产生和积累的差异表明,这些物质在水稻的抗病性中起了重要作用。     

水稻疏基蛋白酶抑制剂的分子修饰与其对稻瘟病菌的抑制作用

水稻巯基蛋白酶抑制剂经用二硫苏糖醇,对氯汞苯甲酸和碘乙酸修饰后,对木瓜蛋白酶的抑制活性并无改变;用Ｎ－乙基顺丁烯二酰亚胺与ＣＰＩ反应,可以测出ＣＰＩ分子内有１９个巯基被修饰,被修饰后,抑制活性仍无改变,表明水稻ＣＰＩ的抑制活性不需要巯基参与;应用Ｎ－溴代丁二酰亚胺与ＣＰＩ反应,可测出ＣＰＩ分子内有２个Ｔｒｐ被修饰,修饰后,抑制活性全部丧失,表明Ｔｒｐ是保持抑制活性所必需的基因,水稻巯基蛋白酶抑制剂     

稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因的cDNA片段克隆与序列分析

以稻瘟病菌感染水稻,利用ｍＲＮＡ差汞显示技术分离了稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因ＥＲ１的ｃＤＮＡ片段。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明,ＥＲ１基因在稻瘟病菌侵染水稻叶片６ｈ后开始表达,８ｈ最强,１０￣１２ｈ开始减弱,１６ｈ消失。Ｓｏｕｔｈｅｍ ｂｌｏｔ分析表明,ＥＲ１基因属于水稻基因组。对ＥＲ１基因片段进行了克隆和序列分析。经查询,在ＧｅｎＢａｎｋ中没有与ＥＲ１同源的基因序列。     

稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因的cDNA片段克隆与序列分析

以稻瘟病菌感染水稻,利用ｍＲＮＡ 差异显示技术分离了稻瘟病菌侵染诱导的水稻早期反应基因ＥＲ１（ｅａｒｌｙ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｇｅｎｅ） 的ｃＤＮＡ 片段。Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明,ＥＲ１ 基因在稻瘟病菌侵染水稻叶片６ ｈ 后开始表达,８ ｈ 最强,１０ ～１２ ｈ 开始减弱,１６ ｈ 消失。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 分析表明,ＥＲ１ 基因属于水稻基因组。对ＥＲ１ 基因片段（２１９ ｂｐ） 进行了克隆和序列分析。经查询,在ＧｅｎＢａｎｋ 中没有与ＥＲ１ 同源的基因序列。     

利用有序差异显示技术克隆受稻瘟病菌诱导表达的水稻cDNA的研究

利用有序差异显示技术(ODD)分析受稻瘟病菌诱导表达的水稻基因,通过反式RNA印迹进行辅助筛选,获得了37个在接种稻瘟病菌后表达量增强的水稻cDNA克隆.采用RNA印迹对其中5个克隆在接种稻瘟病菌后的表达分析表明,这些克隆在抗病以及感病的水稻株系中都具有诱导表达的特点.根据序列同源性分析,与这些克隆序列相应的同源基因可能涉及抑制病原菌生长、清除真菌毒素、传递抗病信号以及调节宿主生理状态等几方面的功能.     

水稻内生放线菌OsiRt-1的分离鉴定及对稻瘟病的防治作用

【目的】从水稻中分离、筛选并鉴定出对稻瘟病真菌具有拮抗性能的内生放线菌,对高抗菌株进行稻瘟病生防效果评定,初步探讨其作用机制。【方法】采用4种分离培养基对水稻内生放线菌进行分离,用平板对峙法筛选出对稻瘟病菌拮抗性能最好的菌株,结合其菌落形态、生理生化及16S rRNA基因序列分析进行鉴定;用环境扫描电镜(SEM)观察拮抗菌对稻瘟病菌菌丝形态影响,用菌丝生长速率法对拮抗菌发酵滤液进行抗菌活性评价;大田条件下,喷洒拮抗菌孢子液于水稻,检测其稻瘟病控制效果;同时,对拮抗菌进行产酶和次级代谢产物分析,检测其聚酮合酶基因(PKSⅡ型)和非核糖体多肽合成酶基因(NRPS)。【结果】从1 800个水稻样品中分离出117株内生放线菌,从中筛选出拮抗性能最好的菌株Osi Rt-1,鉴定为米修链霉菌Streptomyces misionensis。该菌株使稻瘟病菌菌丝出现畸形,其无菌滤液对病菌菌丝生长的抑制率为28.06%;大田条件下,Osi Rt-1对水稻苗瘟、穗瘟均有较好防效,其中对苗瘟防效为7.76%,穗瘟防效高达25.65%,损失率降低了17.46%。与之对应,Osi Rt-1处理过的水稻地上部分,Osi Rt-1所占内生放线菌的比例明显高于未处理水稻。该菌株具有可能降解真菌细胞壁的纤维素酶、蛋白酶活性,同时可产生植物生长促进剂铁载体、IAA、ACC脱氨酶。菌株Osi Rt-1呈现PKSⅡ型和NRPS阳性。【结论】菌株Osi Rt-1是一株具生防潜力的内生放线菌,在农业上具有实际研发价值。     

水稻品种过氧化物酶活性和木质素含量与抗稻瘟病菌的关系(简报)

8个水稻品种的幼苗接种稻瘟病菌后,第3d抗病品种比感病品种过氧化物酶活性增加得快,5～7d后则相反。未接菌的抗病品种比感病品种含有较多木质素。接菌后第7d感病品种较抗病品种诱导了更多木质素。表明稻瘟病菌侵染早期,过氧化物酶活性的增加与抗病性有一定相关性,出现病斑症状后相关性则不明显。     

第二代测序技术用于水稻和稻瘟菌互作早期转录组的分析

稻瘟菌为了实现对水稻的有效侵染,在侵染水稻时可能通过表达和转运一定数量的效应蛋白进入到水稻细胞,抑制和干扰水稻的先天免疫机制。文章利用Solexa第二代测序技术,通过开展水稻和稻瘟菌互作早期转录组的测定和分析,克隆和鉴定在互作早期表达的稻瘟菌效应蛋白基因。利用序列同源比对,我们从总计约12.5 M条序列标签中,分离和鉴定了338 942条来源于稻瘟菌的序列,并最终定位到779个稻瘟菌预测基因。其中108个基因很可能参与了水稻和稻瘟菌互作过程,42个基因为预测的分泌蛋白基因。通过RT-PCR分析,最终确认了42个预测分泌蛋白基因中有12个基因在侵染水稻早期有显著的表达,而其中有4个基因表现为侵染早期特异表达。文章尝试利用第二代测序技术实现稻瘟菌侵染早期特异表达基因,尤其是分泌蛋白基因的快速克隆和鉴定,为稻瘟菌效应蛋白基因的克隆和功能鉴定提供了较为有意义的探索。