PCR技术在鼠肺支原体检测中应用的初步研究

目的　探讨PCR技术在鼠肺支原体检测中的应用,希望能建立一种可行、快速、敏感的检测方法。方法　使用支原体通用引物及鼠肺支原体特异性引物对14 份大鼠喉气管拭子洗液和拭子支原体培养液进行PCR扩增,2 % 琼脂糖电泳鉴定。另设M53 和ATCC19612 二株标准鼠肺支原体菌株作阳性对照。结果　通用引物对大鼠喉气管拭子洗液检出率8/14 ,拭子支原体培养液检出率14/14,鼠肺支原体特异引物PCR扩增对大鼠喉气管拭子洗液检出率0/14 ,拭子支原体培养液3/14。通用引物扩增M53 和ATCC19612 二株标准株均呈现阳性,而鼠肺支原体特异引物扩增M53 和ATCC19612,只有M53 呈现阳性。结论　PCR通用引物检测比普通分离培养省时省力,而我们采用国外某学者认为对鼠肺支原体有特异性的引物,是否可用于鼠肺支原体的特异性PCR 检查仍需进一步探讨。     

细胞培养中支原体污染的PCR检测

根据支原体16s rDNA序列,选择RemyTeyssou设计的三条寡核苷酸链,组成两套引物:P_(1-2a)能检测出细胞培养中常见的各种支原体,P_(1-2b)能检出无胆甾原体。反应可检出体系中10CFV的菌体。此法先用于对实验室人为污染支原体Vero细胞的检测,后与DNA 染色法和培养法比较,检测了49份生物样品,其中24份传代细胞,PCR检测的阳性率为58％,DNA染色法为42％,培养法为33％;三者的灵敏性比较,PCR可检出10~(-3)稀释度的阳性样品,高于其他两种方法。此PCR方法快速、灵敏、特异,适用于细胞培养中支原体污染的检测。     

PCR技术检测猪肺炎支原体的研究进展

猪肺炎支原体(Mycopiasma hyopneumoniae)是引起猪支原体肺炎的重要病原,该病常引起继发感染和混合感染,严重威胁养猪业发展,造成巨大的经济损失.利用PCR技术对猪支原体肺炎早期正确诊断具有非常重要的意义.从猪肺炎支原体的特异性靶基因、临床样品采集方法与样品DNA处理方法、关键技术因素及普通PCR技术、多重PCR技术、套式PCR技术、荧光定量PCR技术、芯片检测和环介导等温扩增技术等在猪肺炎支原体检测中的研究进展、主要优缺点及应用进行综述.     

TaqMan探针双重荧光定量PCR同时检测解脲支原体和巨细胞病毒

目的探讨双重荧光定量PCR技术的优化条件,建立基于TaqMan探针技术荧光定量法检测同时检测解脲支原体和巨细胞病毒的新方法。方法分别采用普通定性PCR扩增母婴垂直传播常见的病原体（解脲支原体和巨细胞病毒）测序鉴定,然后分别采用TaqMan探针的单重和双重定量PCR技术对解脲支原体和巨细胞病毒同时定性定量检测。结果解脲支原体和巨细胞病毒单种定性PCR检测均为阳性,TaqMan探针单重和双重定量PCR检测解脲支原体和巨细胞病毒阳性率和特异性均为100％,相同样品TaqMan探针单重、双重定量PCR分别检测的结果符合率100％。结论TaqMan探针双重荧光定量PCR技术可同时检测两种靶分子,结果可靠,应用前景广阔。     

鸡毒支原体强毒株与F疫苗株双重PCR检测方法的建立

目的建立能同时检测MG强毒株和F疫苗株的双重PCR技术。方法根据鸡毒支原体(MG)R株的PvpA基因序列和F疫苗株假定的α磷酸海藻糖酶基因序列,设计2对引物R1、R2和F1、F2,在单一PCR的基础上,建立检测MG强毒株和F疫苗株的双重PCR方法,并运用该双重PCR方法对临床样品进行检测。结果在330 bp和444 bp处分别出现预期的特异性DNA扩增条带,敏感性试验显示该体系能检测出0.45 ng的MG R株DNA和0.25 ng的MG F疫苗株DNA。临床样品MG强毒株阳性检出率为79.69%,高于常规分离培养鉴定法。结论成功建立检测两种毒株的双重PCR技术,为根除鸡群中MG野毒株、建立无MG的阴性鸡群提供新的技术手段。     

鼠肺支原体单克隆抗体的研究

通过杂交瘤技术建立了３株抗鼠肺支原体单克隆抗体细胞株,它们分别是ＢＡ１１,ＢＤ７和Ｂ６１２．试验表明：３株细胞所分泌的抗体均属ＩｇＧ１亚类,都是鼠肺支原体的特异性抗体,与多种其它支原体无交叉反应。     

嗜肺军团菌实时荧光定量PCR快速检测方法的建立

目的：建立针对嗜肺军团菌Mip基因的实时荧光定量TaqMan PCR检测方法,并进行自来水和空调冷却水模拟标本的检测评价。方法：根据嗜肺军团菌Mip基因的特异性序列设计引物和TaqMan探针,建立嗜肺军团菌的实时荧光定量TaqMan PCR快速检测方法,对方法进行灵敏度及特异性评价,并对自来水和空调冷却水模拟标本中的嗜肺军团菌进行检测。结果：建立的方法对嗜肺军团菌的检测具有高度特异性,与3种非嗜肺军团菌和6种其他呼吸道病原均没有交叉反应;基因组DNA的检测灵敏度为1.6pg／μL,模拟自来水和空调冷却水标本的检测灵敏度为10CFU／mL。结论：建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,适于嗜肺军团菌的日常监测和暴发疫情的应急诊断。     

应用化学发光法检测核酸杂交

固定在膜上核苷酸序列已有许多不同的非放射性检测方法。最普通的方法是在杂交探针上附加一种酶。将这种酶在杂交前与探针共价连接,或者在杂交后与探针结合。然后将膜与信号显示底物一起保温处理就可看见杂交的目的顺序位置。最常用的底物系统是色原性的,色原性系统在酶的作用下在膜上沉淀出不溶性染料。通过最佳的色原性系统可在膜上检测出约2×10~(-6)mol的酶(表Ⅰ)。从理论上讲,底物所能检出的酶的摩尔数越低,能检测目的DNA或RNA的量就越小。     

聚合酶链反应检测实验动物弓形虫核酸的研究

建立弓形虫动物模型,常规方法提取肝、脾、肾、肺等组织DNA,应用聚合酶链反应（PCR）扩增,产物经电泳检测显示199bp的弓形虫特异带谱。并以γ－32p标记克隆的弓形虫特异DNA片段为探针,对扩增产物行Southern印迹分析,结果上述4种标本均出现阳性杂交带,进一步证实扩增条带是弓形虫特异DNA顺序。同时用酶标法检测显示鼠血清弓形虫抗体IgG;阳性。组织病理学检查结果,肝组织损伤较严重,肝细胞肿大,肝窦消失,脾、肾、肺组织可见轻微的病理改变。另外本文介绍一种简单PCR方法[1],取鼠尾静脉血2μl直接进行扩增,结果与酚-氯仿法提取的DNA扩增结果一致。     

盘羊肺炎支原体感染PCR 检测方法的建立与初步应用

羊支原体性肺炎,是由支原体引起的一类高度接触性传染病,又称羊传染性胸膜肺炎(Infections pleuropneumonia of sheep and goats),临床症状主要表现为高热、咳嗽、消瘦、     

逆转录-聚合酶链反应检测鼠肝炎病毒方法的建立

建立特异、灵敏的逆转录聚合酶链反应（RT－PCR）技术,结合碱性磷酸酶标记的探针杂交检测鼠肝炎病毒（MHV）,采用MHV－3,MHV－A59病毒株感染DBT细胞,37℃培养,待细胞出现病变时收集提取病毒RNA。依据MHV基因序列设计一对高度保守区特异性引物,进行RT－PCR扩增,结果可见147bp的鼠肝炎病毒产物特异扩增带。敏感性实验检测到10pg的鼠肝炎病毒RNA,同时用ELISA方法对照。结果提示应用RT—PCR技术结合探针杂交检测鼠肝炎病毒。具有简便、快速、灵敏等优势。本研究在国内尚未见报道。     

Mycoplasma bovis shares insertion sequences with Mycoplasma agalactiae and Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC: Evolutionary and developmental aspects

Three new insertion elements, ISMbov1, ISMbov2 and ISMbov3, which are closely related to ISMag1 (Mycoplasma agalactiae), ISMmy1 and IS1634 (both Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC), respectively, have been discovered in Mycoplasma bovis, an important pathogen of cattle. Southern blotting showed that the genome of M. bovis harbours 6-12 copies of ISMbov1, 11-15 copies of ISMbov2 and 4-10 copies of ISMbov3, depending on the strain. A fourth insertion element, the IS30-like element, is present in 4-8 copies. This high number of IS elements in M. bovis, which represent a substantial part of its genome, and their relatedness with IS elements of both M. agalactiae and M. mycoides subsp. mycoides SC suggest the occurrence of two evolutionary events: (i) a divergent evolution into M. agalactiae and M. bovis upon infection of different hosts; (ii) a horizontal transfer of IS elements during co-infection with M. mycoides subsp. mycoides SC and M. bovis of a same bovine host.     

硅对PCR过程的抑制作用研究

探讨不同氧化程度的硅材料对PCR扩增的抑制作用及其机理。将不同氧化程度的硅纳米颗粒加入PCR反应液中,使其与Taq酶、模板等充分接触,通过离心将硅纳米颗粒沉降在管壁上,取出上清或保留硅纳米颗粒上机扩增,扩增产物采用凝胶电泳法检测。结果表明,随着硅材料表面面积与PCR反应液体积之比的增大,核酸扩增效率将明显下降,并且在所研究的范围内,氧化程度高的硅材料对PCR过程抑制作用更强;通过对抑制作用机理进行初步的实验研究,表明硅材料对PCR反应液中的Taq酶的吸附是导致抑制现象产生的主要原因,而对模板的吸附影响较小;并且,反应管内是否保留硅材料对核酸扩增影响较小,硅材料没有明显的直接化学抑制作用。     

ISMmy1, a novel insertion sequence of Mycoplasma mycoides subsp. mycoides small colony type

A new insertion sequence, ISMmy1, has been identified in the bovine pathogen Mycoplasma mycoides subsp. mycoides biotype small colony (MmymySC). The occurrence of ISMmy1 in 15 MmymySC strains and 12 other mycoplasmas was examined by Southern blotting. All MmymySC strains showed identical hybridisation patterns except for the type strain PG1(T), the vaccine strain T1Sr49, and the strain Afadé, which all had unique patterns. ISMmy1-like sequences were also found in the bovine pathogen Mycoplasma bovis strain Donetta(T) while mycoplasmas that are phylogenetically closer to MmymySC lack ISMmy1. This observation suggests horizontal transfer between MmymySC and M. bovis.     

鼠伤寒沙门氏菌多重PCR检测方法的研究

分别根据沙门氏菌16S rRNA、质粒毒力基因spvC、致病基因invB、fimA序列设计4对引物,对沙门氏菌株及非沙门氏株菌基因组DNA进行多重PCR检测。结果该方法能检测出6.3×10² 个cfu/ml纯培养的沙门氏菌,人工染菌食品模拟检测结果显示,熟鸡肉初始含菌量为17cfu/g、全脂奶粉为11cfu/g、生牛肉为13.6cfu/g,经过8h增菌,PCR检测为阳性。该体系能鉴定产生多种毒力因子的沙门氏菌,特异性强、敏感性高,为检测和鉴定沙门氏菌株提供了一个新方法。     

PCR方法在HSF1基因敲除小鼠基因型分析中的应用

目的　为HSF1基因敲除鼠探索快速、简单的基因型PCR检测方法。方法　设计两对引物扩增野生型HSF1基因和HSF1缺陷突变基因的DNA片段 ,用PCR仪梯度方案测试最佳退火温度 ,并将所得基因型结果与经典的Southernblot方法比较。结果　野生型仅在 5 6 2bp处有一条条带 ,突变纯合子仅在 377bp处有一条条带 ,杂合子则在377bp和 5 6 2bp处出现两条条带。用PCR方法获得的HSF1基因分析结果与经典的Southernblot方法获得的结果完全一致。结论　用PCR方法分析HSF1基因敲除鼠的基因型具有快速、简单、廉价和适用的特点     

Diagnosis of Genital Herpes by Polymerase Chain Reaction Amplification

A new polymerase chain reaction (PCR) method employing type-specific primers and probes was applied to 114 clinical specimens obtained from 58 female patients with genital lesions or who had a history of genital herpes. Ten and 15 specimens, respectively, were positive for herpes simplex virus (HSV)-1 and HSV-2 by cell culture. All of 10 culture-confirmed HSV-1 cases and 11 of 15 (73%) culture-confirmed HSV-2 cases were identified by PCR. Although there were several cases with discrepancy between cell culture and PCR for HSV-2, the results suggest that this PCR procedure could be applied to clinical specimens from the female genital tract.     

单纯疱疹病毒的PCR直接基因分型

本文利用ＰＣＲ技术建立一种对ＨＳＶ直接基因分型的方法。在ＨＳＶ－Ⅰ、Ⅱ两型的ＤＮＡ多聚酶基因上设计了一条两型共同的上游引物（ＨＤＰ－Ｂ）和两条型特异的下游引物（ＨＤＰ－１、ＨＤＰ－２）。三条引物共同组成一个扩增反应体系,在ＨＳＶ－Ⅰ产生５４３ｂｐ条带,ＨＳＶ－Ⅱ产生３７２ｂｐ条带,据此在基因水平上对ＨＳＶ进行分型。５株不同来源的ＨＳＶ（２株Ⅰ型,３株Ⅱ型）分型结果与病毒分离及血清学方法完全一致。该反应体系与其它来源的ＤＮＡ不产生特异反应,敏感性可达１ｆｇ。应用该法对１５１份临床可疑ＨＳＶ感染的标本进行检测并分型,结果与免疫学方法完全一致。     

聚合酶链反应技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒

目的建立聚合酶链反应(PCR)技术检测禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)的方法。方法提取感染REV-T和脾坏死病毒(SNV)的SPF鸡胚成纤维细胞DNA为模板,利用前病毒长末端重复序列(LTR)区引物进行扩增。采集肿瘤病鸡,以及人工感染REV 28 d后鸡肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胸腺、法氏囊等器官,进行扩增。同时将采集的脏器组织,进行HE染色和免疫组化试验(IHC)。结果REV-T感染的组织未检测出电泳条带,而SNV感染的细胞中检测到了一条300bp特异而清晰的电泳条带,而且SNV感染的鸡组织中,PCR方法检测到了特异的条带。通过HE染色和免疫组化技术观察到了肿瘤组织,肿瘤细胞的形态、分布。结论PCR检测REV更快捷,特异更好。