RNA结合蛋白与RNA互作鉴定技术

RNA结合蛋白（RNA binding proteins,RBPs）通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA（non-coding RNA,ncRNA）研究的快速发展,催生了多种RBPs RNAs相互作用鉴定技术。这些技术反之又推动了 RNA领域的研究进程。本文对紫外交联免疫沉淀（ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation,CLIP）,CLIP cDNA文库高通量测序 (high-throughput sequencing of CLIP cDNA library,HITS-CLIP),光活化核苷增强的CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP),单核苷酸分离CLIP (individual nucleotide resolution CLIP,iCLIP),TRIBE (targets of RNA-binding protein identified by editing),RNA 标记,相互作用组捕获(interactome capture,IC) 和SerIC (serial RNA interactome capture)等RBPs-RNAs相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行综述。     

利用CLIP技术研究蛋白质和RNA的相互作用

紫外交联免疫共沉淀(CLIP)技术能揭示RNA结合蛋白质在体内的RNA结合位点。将讨论该技术的基本原理和一些新的发展,这些新发展显著地提高了技术的特异性、灵敏度和应用范围。     

RNA结合蛋白与RNA相互作用鉴定技术

RNA结合蛋白(RNA binding proteins,RBPs)通过与RNA相互作用,广泛参与到RNA的剪切、转运、编辑、胞内定位及翻译调控等过程中。RNA领域尤其是非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)研究的快速发展,催生了多种RBPs-RNAs相互作用鉴定技术。这些技术反之又推动了RNA领域的研究进程。本文对紫外交联免疫沉淀(ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation,CLIP),CLIP cDNA文库高通量测序(high-throughput sequencing of CLIP cDNA library,HITS-CLIP),光活化核苷增强的CLIP(photoactivatable-ribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation,PAR-CLIP),单核苷酸分离CLIP(individual nucleotide resolution CLIP,i CLIP),TRIBE(targets of RNA-binding protein identified by editing),RNA标记,相互作用组捕获(interactome capture,IC)和Ser IC(serial RNA interactome capture)等RBPs-RNAs相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行综述。     

运用紫外交联免疫沉淀技术构建RNA结合蛋白的靶基因文库

紫外交联免疫沉淀(crosslinking-immunoprecipitation,CLIP)是一种研究RNA结合蛋白的技术,它通过特异性抗体富集靶RNA片段,然后逆转录构建cDNA文库,最后进行高通量测序。它可以在基因组水平上全景式研究靶RNA的特点,为揭示该蛋白生物学功能与分子功能提供新的依据。本研究针对一个已知的RNA结合蛋白MOV10(moloney leukemia virus 10),通过CLIP技术构建cDNA文库,然后小规模克隆后测序,得到小部分靶RNA信息,并利用RNA免疫沉淀技术(RNA-immunoprecipitation,RIP)进行验证。测序提示MOV10结合mRNA,而其中有部分是其已知靶标。说明该文库可以用于后续深度测序,为研究该蛋白在精子发生领域内的功能和机制奠定基础。     

蛋白质-RNA相互作用鉴定技术研究进展

RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)是基因表达调控的关键因子，参与包括蛋白质复合物的协调与稳定、RNA的加工与成熟以及mRNA的转运、稳定、翻译和降解等重要的细胞生物学过程。而RBP和RNA之间的相互作用可以在它们各自的生物学过程中起到重要作用。因此，快速、准确检测RBP-RNA相互作用的技术对研究RBP和RNA的功能至关重要。对近些年发展起来的RNA纯化的染色质分离（chromatin isolation by RNA purification，ChIRP）、RNA靶标的捕获杂交分析（capture hybridization analysis of RNA targets，CHART）、三分子荧光互补技术（trimolecular fluorescence complementation，TriFC）、RNA免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation, RIP)、紫外交联免疫沉淀(UV-crosslinking and immunoprecipitation，CLIP)、RNA Pull-down和RNA电泳迁移分析等主要RBP-RNA相互作用鉴定技术的基本原理和优缺点以及应用进行了综述，旨在为新型技术的发现提供新的思路。     

NS5B与HCV负链RNA 3′末端特异性结合的分析

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶，在病毒RNA合成过程中起到中心催化酶的作用，在肠杆菌中表达和提纯了GST－NS5B融合蛋白，应用紫外交联试验（UV cross-linking）检测NS5B与丙型肝炎病毒（HCV）负链RNA3′末端的结合，确定NS5B是否参与HCV负链与HCN负链RNA3′末端复制体的形成。NS5B可与HCV负链RNA3′末端发生结合，这种结合存在量效关系， 比与正链RNA3′UTR X区的结合强约10倍，超大量的非同源性RNA和蛋白质不能竞争抑制S5B与负链RNA3′末端的结合，证明这种结合存在特异性。结果提示NS5B是HCV负链RNA3′末端复制体的成分之一。     

紫外交联合并串联亲和纯化高效鉴定蛋白复合物组分的RNA结合活性

RNA结合蛋白在RNA的生成与代谢中发挥着重要作用.我们在近年报道的PAR-CLIP(photoactivatableribonucleoside-enhanced crosslinking and immunoprecipitation)技术的基础上建立了一套快速、有效鉴定RNA结合蛋白的实验方法:以串联亲和纯化替代一步免疫沉淀获得高纯度蛋白-RNA复合物;将Sypro Ruby蛋白染色与RNA放射自显影相结合判断复合物中哪种或哪些组分为RNA结合蛋白,该方法命名为紫外交联合并的串联亲和纯化(cross-linkingand tandem affinity purification,CLiTAP).运用该方法对布氏锥虫的三种锌指蛋白ZC3H7、ZC3H34和ZC3H5进行分析,发现ZC3H7作为帽结合蛋白复合物的核心组分具有很强的RNA结合能力;ZC3H34结合RNA能力较弱,但其互作蛋白具有强的RNA结合活性;相比之下,ZC3H5及其复合物组分皆无RNA结合活性.这些结果表明,CLiTAP与蛋白质鉴定方法相结合,能够有效鉴定靶蛋白复合物中的RNA结合蛋白种类,也为进一步定位RNA结合位点、研究RNA结合蛋白的结构及作用机制奠定了基础.     

与丙型肝炎病毒复制中间体3′末端结合的宿主蛋白的研究

宿主细胞蛋白在HCV复制过程中起着重要的作用.应用蛋白质-核酸紫外交联法检测多个细胞株,目的是明确是否存在可与HCV复制中间体3′末端特异性结合的细胞蛋白质.结果显示,在多个细胞株中存在一个分子质量约为45 ku的蛋白质（命名为p45）,可与HCV复制中间体3′末端131～278 nt结合,这种结合可被过量的自身未标记RNA竞争抑制,而非同源蛋白和非同源RNA均不能竞争抑制这种结合.根据计算机RNA二级结构分析推测,p45可能特异性结合于HCV复制中间体3′端的一茎环结构内.这一结果提示,p45在HCV子代RNA复制中可能起着重要作用.     

高等植物叶绿体RNA编辑研究进展

RNA编辑普遍存在于陆生植物中,在高等植物叶绿体中以C→U的替换为主,可能是叶绿体产生功能蛋白的重要方式。近年来,使用体外分析、叶绿体转化和紫外交联等技术,使叶绿体RNA编辑机制的研究取得较大进展。本文对这些新的进展进行了概述,并对高等植物叶绿体RNA编辑研究中有待解决的问题进行了展望。     

Analysis of CLIP and iCLIP methods for nucleotide-resolution studies of protein-RNA interactions

ABSTRACT: UV cross-linking and immunoprecipitation (CLIP) and individual-nucleotide resolution CLIP (iCLIP) are methods to study protein-RNA interactions in untreated cells and tissues. Here, we analyzed six published and two novel data sets to confirm that both methods identify protein-RNA cross-link sites, and to identify a slight uridine preference of UV-C-induced cross-linking. Comparing Nova CLIP and iCLIP data revealed that cDNA deletions have a preference for TTT motifs, whereas iCLIP cDNA truncations are more likely to identify clusters of YCAY motifs as the primary Nova binding sites. In conclusion, we demonstrate how each method impacts the analysis of protein-RNA binding specificity.