磷酸酪氨酸蛋白专一抗体的制备和纯化

以偶联磷酸化酪氨酸的牛血清白蛋白（ＢＳＡ）作为免疫原免疫兔获得抗血清。自抗血清中分离获得抗体。自酪胺合成磷酸酪胺,并偶联到溴化氰活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ上。抗体经磷酸酪胺－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ亲和柱纯化,所得抗体专一性强,Ｄｏｔ ｂｌｏｔ显示：抗体仅对酪氨酸磷酸化的蛋白质包括酪氨酸磷酸化的血清白蛋白,溶菌酶,卵清蛋白起抗原抗体反应,而不识别非酪氨酸磷酸化的溶菌酶,卵清蛋白,也不识别作为免疫     

大鼠肾脏和其它组织中磷酸酪氨酸蛋白的研究

本文采用P-tyr-BSA为免疫原免疫家无得抗血清。将纯化的IgG与HRP偶联,建立了P-tyr-Pr的ELISA法,并测定了正常大鼠肾脏等组织中P-tyr-Pr含量,其分布规律如下:上清中P-tyr-Pr含量高者,其颗粒部分则低,反之亦然;其中肾脏上清中含量远比其它组织(脾、肺、肝等)高。在此基础上,又研究了膜性肾炎大鼠肾脏P-tyr-Pr含量,发现其上清中的含量远远高于正常大鼠肾脏中的含量。     

小鼠再生肝胞浆磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶的纯化和性质研究

以~(32)P(Tyr)-Poly Glu,Tyr(4:1)为底物,用于研究小鼠再生肝胞浆磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)的分离纯化和性质。再生肝胞浆经60％饱和度硫酸铵盐析,二次DEAE纤维素层析,Sephadex G-200柱层析和Poly Glu,Tyr-Sepha-rose 4B亲和层析后,得到的PTPP分子量为67000,纯度提高1123倍,活性回收率为28％,对~(32)P(Tyr)-Poly Glu,Tyr有很高的活力,对~(32)P(Ser/Thr)-Casein(酪蛋白)和PNPP(对硝基苯酚磷酸盐)没有作用,其最适pH为6.8～7.1,对热不稳定。EDTA对酶有激活作用,Zn~(2+)、PNPP、P-Tyr、多胺化合物、焦磷酸根、钼酸根、柠檬酸根对酶有明显的抑制作用。酶对Na_3VO_4不敏感。碱性蛋白质组蛋白、鱼精蛋白对酶活力有抑制作用,酸性蛋白质酪蛋白和酸性多糖物质肝素对酶活力有激活作用,且后者能减弱前者的抑制作用。     

主动脉平滑肌细胞增殖周期中磷酸酪氨酸蛋白的研究

以人工合成的磷酸酪氨酸牛血清白蛋白为抗原免疫家兔,得到抗TPK 天然磷酸化底物(P-tyr-Pr)的特异性抗体。P-tyr-Pr ELISA测定结果显示:ASMC 胞浆和核内颗粒部分P-tyr-Pr 的最高含量均出现于G_1晚期(9 h),且核内P-tyr-Pr 的含量远高于胞浆。免疫组织化学显示:ASMC 中P-tyr-Pr 的总量也以G_1晚期为最高,在G_1晚期ASMC 中,P-tyr-Pr 主要分布于细胞核及其周围的胞浆中。     

维甲酸与星状孢子素联合分化诱导HL-60细胞过程中酪氨酸蛋白质磷酸化系统的变化

以人早幼粒白血病细胞株（HL-60）为材料,对维甲酸与星状孢子素联合诱导HL-60细胞过程中胞浆和膜部分的蛋白质酪氨酸磷酸化水平变化进行了研究．结果表明,诱导后2～24h范围内,TPK活力出现波动,随时间延长（24～27h）,胞浆部分TPK活力下降,膜溶脱部分TPK活力上升;PTPP活力明显升高且上升幅度比TPK大得多．利用抗P-tyr-BSA抗体分析底物含量变化的结果与相应时相的TPK和PTPP活力变化趋势一致．     

RAP蛋白的纯化和抗体制备

从04018金黄色葡萄球菌培养上清分离纯化获得相对分子质量为38000,具有激活RNAⅢ作用的RAP蛋白。用该蛋白免疫家兔得到效价为1：128000的多抗血清。纯化后的抗体可以特异结合RAP并抑制其激活RNAⅢ转录的作用。     

gcm蛋白的表达、纯化及多克隆抗体的制备

gcm(glial cells missing)是调控神经元细胞和神经胶质细胞相互转化的一个基因开关.在gcm功能缺损的突变体中,预期的神经胶质细胞发育成神经元细胞;而在gcm过表达的突变体中,预期的神经元细胞转化为神经胶质细胞.此外,gcm还调控血浆细胞发育.为了进一步研究gcm在发育中的功能,需要获得gcm蛋白并制备其抗体.根据已报道的gcm基因序列,以果蝇cDNA文库为模板进行PCR扩增得到gcm部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体以获得原核表达载体.重组载体经酶切测序鉴定确认后,转化大肠杆菌(E.coli)BL21,并用IPTG诱导融合蛋白表达.采用Ni-IDA凝胶柱亲和纯化蛋白,将纯化的His-gcm融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体效价.获得的gcm原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗gcm多克隆抗体,为gcm功能的进一步研究奠定了基础.     

Nodal蛋白的表达、纯化及多克隆抗体制备

斑马鱼心脏发育模型中Nodal编码转录因子调节心脏的左右不对称发育,为了进一步研究Nodal信号途径在心脏发育中的调控作用和心脏疾病发生的分子机制,需要获得斑马鱼Nodal蛋白并制备其抗体.采用从斑马鱼心脏组织中提取RNA,通过反转录得到心脏组织各种表达基因的cDNA为模板,PCR扩增得到Nodal部分编码区序列,然后将其连接到pET-28a载体上获得原核表达.经酶切及测序鉴定后,转化Rosseta细菌,并用IPTG诱导表达融合蛋白,Ni-IDA凝胶柱亲和纯化,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blotting检测抗体.获得了Nodal原核表达重组融合蛋白及高效价的特异性兔抗Nodal多克隆抗体,为Nodal功能的进一步研究奠定了基础.     

甘蔗花叶病毒P1基因的原核表达及其抗体制备

将扩增的甘蔗花叶病毒P1基因克隆到原核表达载体pET-32a上,转化BL21(DE3),获得重组子pET-32a-P1。超声波结果显示,所得的融合蛋白以可溶性的形式存在。SDS-PAGE检测其表达产物与目的蛋白大小一致,割胶免疫注射家兔得到抗体。间接ELISA测定结果表明稀释51200倍仍呈阳性信号,并通过western blot检测,证明抗体特异性良好。     

抗小鼠PLRP1多克隆抗体的制备以及特异性鉴定和应用

小鼠胰泡细胞表达和分泌一种被称为胰甘油三脂酶(PTL)的脂肪酶,主要参与食物来源的甘油三脂的消化吸收,胰泡细胞同时也表达胰脂肪酶相关蛋白1(PLRP1),它同PTL具有很高的同源性．为了研究PLRP1的生物学功能,需要制备其抗体．应用谷胱甘肽S-转移酶(GST)表达系统表达了GST融合蛋白,亲和纯化后用以免疫新西兰大白兔,获得了抗PLRP1的多克隆抗体．免疫印迹分析表明,该多克隆抗血清能检测出0.6 ng的融合蛋白抗原以及在3 μg的小鼠胰液提取物中检测出PLRP1蛋白．在证明抗体的特异性方面,尝试了一种新的方法：用PLRP1基因剔除的小鼠作为阴性对照,通过免疫印迹和免疫组化实验证明了该多克隆抗血清具有很高的特异性．进一步的研究发现,进食能促进胰腺中PLRP1的外分泌,这表明PLRP1可能在食物的消化过程中具有一定的生物学功能．     

转录因子XBP1的融合表达、纯化及多克隆抗体的制备

人X盒结合蛋白 1(XBP 1)为一种转录因子 ,与多种肿瘤的发生、发展有密切关系 .XBP 1有2种剪切形式 ,即XBP 1S和XBP 1U .将这 2种剪切形式中的一段相同编码序列 (编码 82～ 14 7位氨基酸 )重组于谷胱甘肽S转移酶 (GST)融合蛋白表达载体pGEX KG中 ,构建成重组质粒pGST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 ) .将该重组质粒转化E .coliDH5α后 ,表达GST XBP 1(82～ 14 7位氨基酸 )融合蛋白 ,经谷胱甘肽 Sepharose 4B亲和层析获得纯化的融合蛋白 .用此融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体 .利用制备的抗体分别用Western印迹和免疫细胞化学检测XBP 1的 2种剪切形式在哺乳动物细胞中的表达 .结果表明 ,该抗体对XBP 1的 2种剪切形式均具有反应原性 ,效价高 ,特异性好 ,可以用于进一步研究XBP 1的功能     

GOLPH2的原核表达、纯化、抗体制备和初步应用

目前发现GOLPH2蛋白与肝癌密切相关,将golph2基因进行克隆、表达并制备多克隆抗体,为进一步研究其功能奠定基础.应用RT-PCR技术,从人肝癌细胞系HepG2细胞中扩增得到golph2 cDNA,将其克隆到原核表达载体pET21a(+)-TRX内、转化大肠杆菌DH5a,用IPTG诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.His-tag磁珠纯化试剂盒纯化重组蛋白GOLPH2,SDS-PAGE鉴定.将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA、Western blot方法检测抗体的灵敏度和特异性,并测定临床血清标本中GOLPH2蛋白水平.成功地构建了表达TRX-GOLPH2融合蛋白的原核表达质粒pET21a(+)-TRX-GOLPH2.并在大肠杆菌BL21(DE3)内得以高效表达,且以可溶性的形式存在.SDS-PAGE和Western blot证实,重组GOLPH2蛋白质与预期结果一致.抗血清能够特异地识别52 kD重组蛋白、73 kD细胞裂解液和血清蛋白质.成功制备了GOLPH2蛋白质和多克隆抗体,能用于后续研究.     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a(+) 中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1.将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达.该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清.以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上.以Western blot 检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础.     

鸡贫血病毒衣壳蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

利用PCR技术,以pPrpo-VP1为模板扩增得到鸡贫血病毒的衣壳蛋白基因(VP1),以T4多聚核苷酸激酶磷酸化处理、纯化后,克隆至表达载体pET-30a( )中,从而构建了原核表达质粒pET30-VP1。将pET30-VP1转化至感受态细胞E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE分析,可见约45kDa的目的蛋白获得表达。该蛋白经亲和层析纯化后,免疫6-8w的雌性Balb/c鼠,三次免疫后,采血分离血清,制得抗VP1的多克隆血清。以纯化的VP1为包被抗原,用ELISA方法检测,制备的血清效价达12800×以上。以Westernblot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性。VP1蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究VP1蛋白的功能及开展CAV疫苗及诊断制剂的研制奠定了基础。     

人接头蛋白NRBP的表达、纯化及多克隆抗体制备

目的:制备接头蛋白NRBP的兔多克隆抗体,并检测该抗体的效价及特异性。方法:PCR方法以重组质粒PEF-NRBP为模板,获得NRBP全长及NRBP(1-99Aa)cDNA,构建到原核表达质粒pET-21a及pGEX-6P-1中。分别转入大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导表达后,纯化并鉴定表达产物将其免疫家兔,间接ELISA法及免疫印迹等方法鉴定抗体。结果:成功获得人NRBP的cDNA,构建得到相关的原核表达质粒,在大肠杆菌中可诱导性高表达,纯化后蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经ELISA检测为阳性结果,4只免疫家兔的抗体效价约为1:5 200～1:40 000。Western印迹结果显示,该抗体可特异性的识别真核细胞外源性及内源性约60kDa的NRBP蛋白,并且具有较强免疫沉淀能力。结论:NRBP多克隆抗体具有很好的特异性和敏感性,该抗体的成功制备为进一步研究NRBP的功能提供了重要工具。     

EpCAM蛋白的表达、纯化及其单克隆抗体的制备

目的:原核表达EpCAM蛋白并制备抗EpCAM特异性单克隆抗体,初步鉴定相应单克隆抗体的特性。方法:PCR扩增EpCAM基因胞外区,将目的基因亚克隆至载体pET-28a(+),转化至大肠埃希菌株BL21,IPTG诱导表达,组氨酸亲和层析法纯化表达产物。纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,将成功免疫的小鼠脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合,经ELISA筛选得到分泌特异性抗EpCAM的单克隆抗体的细胞株,免疫BALB/c小鼠进一步制备相应的单克隆抗体,并通过Western blot(蛋白质印记)和FACS(流式细胞分析)鉴定单抗的特异性及生物学活性。结果:成功构建重组表达载体pET28a-EpCAM并在大肠杆菌中获得表达,经His-tag亲和层析法获得纯化的EpCAM重组蛋白。EpCAM重组蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选,获得两株稳定分泌EpCAM抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为4B2、2F2并免疫BALB/c小鼠获得相应的单克隆抗体。Western blot结果显示4B2腹水纯化所得单抗能够识别FaDu细胞系(人咽鳞癌细胞)中的EpCAM蛋白,但2F2未能识别FaDu细胞中的变性的EpCAM蛋白。FACS结果显示两者均能和FaDu细胞中天然的EpCAM蛋白结合。讨论:成功制备了抗EpCAM的单克隆抗体,并能够识别人咽鳞癌细胞系FaDu中表达的EpCAM,为进一步研究EpCAM抗体在肿瘤治疗中的作用提供基础。