蛋白质组学肽段鉴定可信度评价方法

蛋白质组学基于质谱数据鉴定肽段和蛋白质，从而给出基因表达的直接证据，帮助解析蛋白质的结构和功能，研究蛋白质与疾病的关系，提供靶向治疗方案，而这些都取决于鉴定的肽段和蛋白质的准确性。蛋白质组学常采用目标-诱饵库方法（target-decoy approach，TDA）对鉴定的肽段和蛋白质进行质量控制，并对其进行改进演化后应用到子类肽段（比如突变肽段和修饰肽段等）和交联肽段等特殊鉴定结果的可信度评价中。然而，TDA存在两个局限，即错误率估计值不够准确以及不能评价单个鉴定结果的可信度，经过TDA质量控制后的结果还需要进一步检验，因此领域内也提出了一系列其他方法（本文统称为Beyond-TDA方法），协同加强肽段的可信度评价。本文对数据依赖模式下采集的质谱数据肽段层面的TDA常规方法和特殊方法进行了综述，对Beyond-TDA方法进行了分类阐述，并总结了各种方法的优势与不足。     

蛋白质的肽质谱指纹图分析方法的优化

肽质谱指纹图分析是一种常用的蛋白质的鉴定方法.为了提高这种方法鉴定蛋白质时序列覆盖率和准确度,以6个标准蛋白质为分析样品,对几种不同的酶解肽段的浓缩、脱盐和点样方法进行了检验和优化.结果发现,将酶解肽段的浓缩体积控制在5μl以下和采用10mmolL柠檬酸铵缓冲液板上脱盐能提高蛋白质鉴定的准确度;在点样的时候,采用先点样品再点基质的方法能明显提高匹配肽段的个数和信噪比.这些优化的样品制备方法明显地提高了MALDITOF质谱肽质谱指纹图分析方法鉴定蛋白质的可靠性.     

反相高效液相层析在糖化白蛋白肽段分离纯化中的应用

采用一种简单的“甲醇-水-三氟醋酸”作为洗脱体系的反相高效液相层析（简称RP-HPLC）对通过固相合成方法合成的糖化白蛋白肽段进行了分析鉴定和分离纯化.使用酸敏性PEG载体,Fmoc保护化学法合成了白蛋白八肽NH₂-Lys-Gln-Thr-Ala-Leu-Tyr-Tyr-Cys-COOH.对其N端Lys进行糖化反应后,经Sephadex G-10柱色谱纯化后,通过RP-HPLC分析,证明得到了糖化八肽的单一峰.使用Merrifield树脂,Boc保护化学法合成了白蛋白七肽NH₂-Gln-Thr-Ala-Leu-Tyr-Tyr-Cys-COOH.通过RP-HPLC半制备分离提纯后,得到了所需的肽段.对N^α-Boc-Lys的ε氨基进行糖化反应后,经RP-HPLC分析,证明得到了比较纯的糖化赖氨酸,与纯化后的白蛋白七肽偶联后,通过RP-HPLC分析,得到了偶联产物——糖化八肽的单一峰.     

黑豆多肽分离及其抗氧化活性的研究

采用凝胶柱层析法分离具有抗氧化活性的黑豆多肽,并分析其分子量分布;同时还采用DPPH·清除法研究各分离肽段的抗氧化活性,对抗氧化活性最佳的肽段进行动力学分析.结果表明:黑豆多肽经分离后得到3个片段,黑豆小分子肽BSP3对DPPH·自由基具有最强清除作用,其半清除浓度(HSC50)为0.664 mg/mL.所以,分子量小于1000 Da的黑豆小分子肽具有很好的抗氧化活性.     

溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑用于羧基衍生:潜在应用于肽段的高灵敏度质谱鉴定

本文发展了阳离子衍生化试剂溴化1-丁基,3-(3-氨丙基)咪唑(BAPI),并应用于肽段的羧基衍生化.以合成肽段RVYVHPI(RI-7)作为样品,其衍生化标记效率可接近100%.此外,肽段衍生物在含0.1%的三氟乙酸水溶液或乙腈/水(体积比1︰1)溶液中至少可稳定保存1周.进一步研究了BAPI衍生对肽段离子化效率的影响.结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析,模式肽段RI-7的检测灵敏度可提高42倍以上,优于商品化哌嗪试剂的衍生效果.此外,衍生肽段在电喷雾质谱(ESI MS)中的离子带电荷数也得到显著提高.上述结果表明,BAPI是一种具有潜在优势的衍生化试剂,有望应用于肽段的高灵敏度质谱鉴定研究.     

蛋白质组研究中离子阱串联质谱数据搜库结果解释方法

基于离子阱串联质谱仪的鸟枪法是一种高通量的蛋白质鉴定方法。得到的数据一般使用软件SEQUEST搜索蛋白质序列数据库,得到肽段鉴定列表以及相应的打分。为了得到蛋白质鉴定列表,还需要进行肽段鉴定结果的过滤和假阳性率的计算,然后根据肽段鉴定结果组装蛋白质列表。这两个问题目前还没有很好地解决。对已有的方法进行总结和比较,可以给搜库结果解释方法的选择提供参考,对数据质量控制方法的改进也有所帮助。     

细胞色素C中肽段相对运动的动力学分析

我们利用经验势函数作为蛋白质分子内部相互作用势的依据,使用自己编写的程序对细胞色素C中残基80～83构成的肽段的动力学性质进行了计算,并在郎之万方程近似下进行了粗略的讨论.有关的X射线晶体学研究发现,该肽段在细胞色素C的氧化态和还原态构象上有明显的差异;我们的计算结果说明,这种构象变化不可能起因于该肽段的随机摆动.     

规模化蛋白质鉴定中母离子的准确检测技术研究

蛋白质组学的基础研究之一是蛋白质鉴定.规模化的蛋白质鉴定通常采用"鸟枪法",即选择一些酶切肽段(母离子)碎裂生成二级谱图,通过二级谱图及其母离子质量鉴定肽段,再推断对应的蛋白质.在鉴定过程中,母离子质量是一个关键参数.母离子是否是肽段的单同位素峰决定了正确肽段是否能进入候选,母离子的质量精度决定了候选肽段的数目.本文从判断单同位素峰和系统误差校准这两个角度研究了母离子的准确检测技术.判断单同位素峰的技术在蛋白质上已有研究,包括电荷判断、单同位素峰判断和重叠同位素峰判断.可以借鉴蛋白质水平的技术研究母离子的单同位素峰判断方法.同时母离子的系统误差校准也有较为成熟的方法.这两个角度的研究有助于提高规模化蛋白质的鉴定率.     

磷酸化蛋白质组学研究中磷酸化肽段富集与分离方法研究进展

对磷酸化蛋白质组（phosphoproteome）进行系统深入的研究依赖于高重复性和特异性的磷酸化肽段富集与分离方法。目前发展了多种不同原理的磷酸化肽段富集方法,它们往往具有不同的选择性和特异性,因此,根据不同的研究目的选择最适合的富集方法显得尤为重要。本文综述了基于亲和色谱法（affinity chromatography）、免疫沉淀法（immunoprecipitation）、化学衍生法（chemical derivatization）、色谱法（chromatography）和其他新发展方法的磷酸化肽段富集方法,详细介绍了各自的优缺点及相关的优化与改进策略。此外,还简单介绍了磷酸化肽段富集与预分方法的不同组合的研究进展。     

鸟枪法蛋白质鉴定质量控制方法研究进展

鸟枪法串联质谱蛋白质鉴定策略由于其高可靠和高效率而被广泛应用于蛋白质组学研究中,这种方法直接对蛋白质混合物进行酶切,以肽段为鉴定单元,继而推导真实的样品蛋白质．由于利用质谱图推导肽段存在一定的假阳性率,而且直接对蛋白质混合物的酶切也导致了肽段和蛋白质之间关联信息的丢失,所鉴定的蛋白质难免存在部分不可靠结果．因此,蛋白质鉴定的质量控制在蛋白质组学研究中极为重要．蛋白质鉴定的质量控制包含两大类主要方法,其一为利用肽段进行蛋白质组装,当前最常用也被证明最有效的方法是使用简约原则,即用最少的蛋白质解释所有鉴定肽段,现有的方法可以分为布尔型和概率型,其二为鉴定蛋白质的可靠性评估,包括单个蛋白质鉴定置信度和蛋白质鉴定整体水平的假阳性率计算．综合各种可辅助蛋白质鉴定的先验信息,构建普适的概率统计模型,是目前蛋白质鉴定质量控制方法的发展趋势．     

质谱技术解析磷酸化蛋白质组

蛋白质磷酸化是生物体内存在的一种普遍的调节方式,在细胞信号传递中占有极重要的地位.质谱已逐渐被人们认为是挑战这一领域的有利工具.综述了目前利用质谱技术分析磷酸化蛋白质的方法,包括利用固定化的金属亲和层析柱、抗体和化学标签技术富集目的分子,肽片段质量图和前体离子扫描（precusor ion scans）等技术检测磷酸化肽段,串联质谱对磷酸化肽段测序鉴定磷酸化位点,以及引入质量标签对蛋白质的磷酸化水平进行定量等.虽然现在已经有很多可行的方法用于分析磷酸化蛋白质,但要达到从少量生物样品中解析其全部磷酸化蛋白质仍需要有很多技术上的突破.     

稳定同位素标记试剂DiART在蛋白质组中的定量特征研究

等重同位素标记方法,如同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ),可以对肽段进行化学标记,之后通过质谱分析得到的报告离子的强度信息而实现对肽段的定量.目前,这种标记技术在定量蛋白质组学研究中有广泛应用.DiART也是一种等重同位素标记方法,且与iTRAQ的定量原理类似,但是其化学结构组成与iTRAQ有所不同,因而其定量特征有其独特表现.本研究通过对DiART标记的简单蛋白样品、复杂蛋白样品以及复杂样品中目标蛋白的定量情况进行了分析,从而对DiART的定量特征进行了研究,并同时与iTRAQ进行了比较.结果表明,DiART方法在定量稳定性、准确性及动态范围方面均更具优势.     

免疫八肽的纯化工艺研究

目的:研究免疫八肽的纯化工艺.方法:以水-乙腈为二元梯度洗脱流动相,以0.1%三氟乙酸(TFA)为离子对,用RP-HPLC(反相高效液相色谱)对合成产物进行分析,探索主峰出峰时间和杂肽分离度,优化程序后将程序放大并制备纯化,用RP-HPLC分析纯肤产物并与标准品对照其色谱保留值,结果一致,结果:此程序下收集的纯肽产物是目标八肽,并且收集的3段肽液纯度全部大于95%,产率高,纯度高.结论:建立了适于大规膜生产免疫八肽(AT-N)的纯化工艺.     

风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达

目的:表达风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组融合蛋白.方法:经过双酶切鉴定和测序鉴定的阳,陛重组质粒载体pGEX-2T/E1-N,转化到感受态大肠杆菌BL21后,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,并对诱导条件进行优化.用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化重组融合蛋白,SDS-PAGE鉴定.结果:用IPTG可以诱导E1特异肽段的重组融合蛋白表达,37℃诱导时,最佳诱导剂浓度为1 mmol/L,最佳诱导时间为4h.诱导温度从37℃降至16℃时,重组融合蛋白以可溶性形式表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的重组融合蛋白.结论:利用原核表达系统可以获得纯化的风疹病毒E1特异肽段的重组融合蛋白.     

葛根糖基转移酶蛋白肽段序列的分离与鉴定

目的:分离鉴定葛根糖基转移酶蛋白肽段序列.方法:从野葛根部提取糖基转移酶,分离后对符合糖基转移酶分子量大小的5条蛋白条带进行酶解,经过高效液相色谱分离纯化后,电喷离子化质谱测定获得蛋白.结果:共获得440蛋白,发现有明确功能的蛋白有325个;具有催化活性的蛋白质有247个.根据报道的糖基转移酶分子量和等电点分布的特点,筛选出6个可能为糖基转移酶的蛋白.结论:初步推测葛根糖基转移酶的蛋白肽段序列,为其在葛根素生物合成中的作用研究奠定基础.     

葡萄糖修饰人血浆载脂蛋白的肽类标志物

目的:研究葡萄糖对血浆中载脂蛋白的修饰作用,寻找标志性肽段,作为临床诊断糖尿病以及衰老相关疾病的生物标志物。方法:将蛋白质组学和生物信息学相结合,采用LC/MS联用技术寻找差异肽段。结果:载脂蛋白(APOA1)与葡萄糖发生糖基化反应,导致正常肽段的含量发生变化,并生成早期糖基化产物果糖胺。而糖尿病人体内的APOA1也同样会发生这种非酶糖基化修饰,其中的一些肽段也出现类似的变化情况。结论:筛选出五个肽段,将有可能作为临床诊断糖尿病以及与衰老相关疾病的生物标志物。     

合成多肽制备的抗体用于蛋白质免疫组织细胞化学定位研究

对本实验室克隆的小麦春化相关基因VER2编码蛋白的氨基酸序列进行软件分析,确定了具有免疫原性的一段（204～215位）含12个氨基酸的短肽,用化学法合成了该短肽并将其与牛血清白蛋白（BSA）相偶联,用偶联物作为抗原免疫家兔获得该12肽的抗体. 分别用VER2全蛋白抗体和该12肽抗体对VER2蛋白进行免疫细胞定位比较分析,两者所得结果一致,即二者在免疫组化检测蛋白质时的灵敏性和特异性方面具有一致的特性. 结果表明,化学法合成短肽制备的抗体可用于蛋白质的免疫组织细胞化学分析, 该方法快捷灵敏,且具有较高的特异性.     

黑木耳核糖体失活蛋白的质谱分析

目的：对悬浮培养黑木耳菌丝体中分离纯化得到的核糖体失活蛋白进行质谱分析,测定其肽的指纹图谱。为用5′-RACE与3′-RACE方法,克隆和表达核糖体失活蛋白的基因,设计5′和3′末端的PCR引物。方法：使用HPLC和MALDI-TOF-MS（基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱）分析方法。结果：测定出肽的指纹图谱及三个随机肽段的氨基酸序列。结论：可根据所测肽段氨基酸序列设计5’-和3’-RACE的引物。     

自组装短肽在脊髓急性创伤早期减少细胞凋亡的研究

目的 为研究在脊髓急性损伤中,自组装短肽溶液对创伤后神经组织的保护作用及创伤后早期神经组织细胞凋亡的时间分布规律.方法 实验使用了手术切断大鼠脊髓胸段T8至T10作为脊髓损伤动物模型,使用末端脱氧核苷酸转移酶介导生物素标记(TUNEL)技术,检测实验后不同时间点的损伤脊髓组织细胞凋亡情况.结果 伤后2 h,损伤区及邻近段开始出现末端标记阳性细胞;伤后8 h,凋亡阳性细胞数达高峰;同时,自组装短肽实验组细胞凋亡较空白对照组少.结论 自组装短肽溶液对急性脊髓创伤组织具有保护作用.     

肽段的理论串联质谱图预测方法研究进展

基于串联质谱技术的蛋白质组学已经成为生命科学领域的重要工具,其中肽段的理论串联质谱图(通常也被称为二级谱图)预测问题在近年来广受关注.大量高质量质谱数据的积累和计算技术的发展为此问题的解决提供了有效途径.肽段的理论二级谱图预测的方法可以分为两大类,一类是基于物理模型的方法,即基于移动质子模型的方法,例如MassAnalyzer、MS-Simulator;另一类是基于机器学习的方法,包括集成学习相关算法和基于神经网络的方法,例如PeptideART、MS2PIP、MS2PBPI和p Deep等.本文对这两大类方法进行了整理和综述,并简要指出了目前理论谱图预测方法存在的一些不足,展望了未来的发展方向.