AP-1辅助激活因子JAB1的分子克隆及其与肝细胞生成素的相互作用

利用酵母双杂交方法,用肝细胞生成素(HPO)作为诱饵蛋白在人胎肝cDNA文库中筛选到能与HPO相互作用的蛋白：AP-1辅助激活因子JAB1.并用PCR方法从人胎肝cDNA文库中扩出JAB1全长cDNA,进行GST-JAB1原核融合蛋白表达与纯化.蛋白质结合实验表明,JAB1与人重组HPO以及COS7真核表达的HPO在体外有结合作用.     

GST pull-down联合质谱筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质北大核心CSCD

(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1(dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1)是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome-related organelles complex 1,BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽-琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱(LC MS/MS)分析筛选(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用Bio GPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO(gene ontology)富集分析。本实验共筛选出108个(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中(肌)营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

GST pull-down联合质谱筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在小鼠睾丸组织中的相互作用蛋白质

（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1（dystrobrevin binding protein 1,dysbindin-1）是溶酶体相关细胞器生物发生复合体-1(biogenesis of lysosome related organelles complex 1, BLOC-1)的1个亚基,在多种组织细胞中广泛表达;然而,其在睾丸组织中的作用至今尚不明确。为寻找（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质,以进一步研究（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸中的作用,本研究首先在Rosetta(DE3)菌种中表达可溶性GST-dysbindin-1融合蛋白,经谷胱甘肽 琼脂糖珠亲和纯化后,与小鼠的睾丸组织蛋白质孵育进行GST pull-down实验,并通过液相色谱串联质谱（LC MS/MS）分析筛选（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的相互作用蛋白质。利用BioGPS数据库聚类在睾丸组织中高表达和特异性表达的互作蛋白质,运用DAVID6.8在线分析工具从细胞组分、分子功能、生物学过程和KEGG通路等方面对筛选出的互作蛋白质进行GO（gene ontology）富集分析。本实验共筛选出108个（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1在睾丸组织中的潜在互作蛋白质,其中98个为尚未报道的（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1相互作用蛋白质,7个为睾丸高表达蛋白质,5个为睾丸特异性表达的蛋白质。这些候选蛋白质主要分布在细胞质、细胞核、细胞膜、细胞外泌体等细胞组分中,通过与蛋白质、核酸等分子结合参与蛋白质翻译和转运、囊泡运输及凋亡等生物学过程以及氨基酸生物合成、溶酶体及蛋白酶体等生物学通路。我们推测,在睾丸组织中（肌）营养不良短小蛋白结合蛋白1可能通过与多种蛋白质相互作用参与精子的发生和受精等过程。     

人mRNA输出因子Gle1与肽链释放因子相互作用上调HeLa细胞中蛋白质翻译终止活性

Gle1蛋白是一种mRNA核输出因子. 最近有研究报道Gle1蛋白参与了酿酒酵母的蛋白质翻译终止过程. 为了探讨Gle1蛋白是否在其它生物中也具有同样的功能, 本研究利用酵母双杂交、免疫共沉淀以及免疫共定位等方法证实了人Gle1蛋白与参与蛋白质合成终止的两类肽链释放因子均能够相互作用, 提示hGle1蛋白可能在人细胞中参与了蛋白质的翻译终止过程. 进一步在HeLa细胞中利用双荧光素酶报告系统分析人Gle1蛋白对蛋白质翻译终止的影响,结果显示, hGle1的过表达能促进细胞内蛋白质的翻译终止. 为进一步探讨hGle1蛋白在蛋白质合成中的作用机制奠定了基础.     

转录因子X-box结合蛋白1相互作用蛋白的筛选和鉴定

X-box 结合蛋白 1 是一种重要的转录因子,参与体内多项信号转导过程. 为进一步研究 XBP1 的生物学功能,运用酵母双杂交技术在肝细胞文库中筛选 XBP1 的结合蛋白. 首先运用 PCR 技术扩增获得 XBP1 的编码序列,克隆至 pGEM-T 载体,经测序鉴定后,亚克隆至诱饵载体 pGBKT7 中,转化酵母 AH109(a type). 免疫印迹检测诱饵质粒 pGBKT7-XBP1 在AH109 酵母中的表达之后,含有诱饵质粒的酵母 AH109 与含有肝细胞 cDNA 文库质粒 pACT2 的酵母 Y187(αtype)配合,配合后的二倍体酵母生长在含有 X-α-gal 的营养缺陷型培养基上 (SD/-Trp-Leu-His-Ade) 进行选择和筛选,经测序和序列比对确定阳性克隆的开放读码框 ORF,得到 7 种不同的蛋白质. 为了进一步验证这些筛选蛋白质与 XBP1 的相互作用,克隆其中一种蛋白质 MT1E,并运用 GST pulldown 和免疫共沉淀技术成功检测了 MT1E 和 XBP1 的相互作用(体外 / 体内),结果提示,MT1E 可能是 XBP1 的一个新的调节蛋白. 通过酵母双杂交技术筛选得到的 7 种蛋白质分别与肝细胞基础代谢、蛋白质的合成与运输、细胞的增殖与凋亡密切相关. 上述结果有助于揭示 XBP1 的生物学功能,为进一步探讨 XBP1 的表达和调控机制提供新线索.     

Bax Inhibitor-1与Herp的相互作用

应用酵母双杂交技术筛选Herp的相互作用蛋白。构建编码Herp的基因HERPUD1真核表达载体HERPUD1plexA,应用MATCHMAKERLexA酵母双杂交系统筛选人胎脑cDNA文库,获得的阳性克隆的插入子为Herp的候选相互作用蛋白质,将Herp与筛选到的相互作用蛋白再一对一回复进行酵母双杂交实验,去除假阳性。对阳性克隆插入子的DNA序列测序,在GenBank中作匹配及生物信息学分析。结果得到其中1个阳性克隆的插入子序列与TEGT基因序列一致,编码蛋白为Baxinhibitor1。得出结论:Herp与Baxinhibitor1相互作用,Baxinhibitor1具有调节凋亡特性,提示Herp可能参与凋亡调节。     

酵母双杂交系统筛选GATA-1相互作用蛋白质及功能验证

目的 利用酵母双杂交技术从人脑cDNA文库中筛选与人GATA-1相互作用的蛋白质.方法 从人K562细胞中扩增出全长GATA1基因,设计引物将其3段截断体亚克隆入酵母表达载体pDBLeu中,转化至AH109感受态酵母中,利用酵母双杂交技术筛选人脑cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,阳性克隆通过回转及免疫共沉淀试验进行验证,利用3xGATA荧光素酶报告基因对相互作用蛋白质进行功能验证.结果 成功构建出酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-GATA1（1）,pDBLeu-GATA1（2）,pDBLeu-GATA1（3）,筛到34个阳性克隆,用生物信息学分析及回转验证得到5个与GATA-1相互作用的候选蛋白,通过免疫共沉淀试验进一步验证,获得3个蛋白质能与GATA-1相互作用,分别是ECSIT,EFEMP1和GPS2.荧光素酶试验表明这3个蛋白质均能对GATA1的转录活性产生影响,证实它们之间的相互作用具有影响GATA1转录的功能.结论 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀试验,从人脑cDNA文库中成功获得3个与GATA-1相互作用并对其转录活性具有调节作用的蛋白质,为研究GATA1蛋白质的功能提供了新的线索.     

酵母表面展示技术在蛋白质工程中的应用

酵母细胞表面展示技术目前已成为蛋白质工程研究的重要工具,利用此技术可以鉴定蛋白间的相互作用、提高蛋白的亲和力和特异性、增加蛋白的稳定性和表达水平、绘制功能性抗原位图、固定化表达具有生物活性的蛋白和酶等,此项技术的运用代表着蛋白质工程研究中的最新进展.     

ORP8 与SPAG5 相互作用并影响细胞周期

目的:筛选与氧化固醇结合蛋白相关蛋白8(Oyxterol binding protein related protein 8,ORP8)相互作用的蛋白质,为揭示ORP8在细胞中的功能及其机制提供线索,并根据相互作用蛋白质初步探索ORP8的功能.方法:构建重组诱饵质粒Pgbkt7-ORP8m,利用GAL4酵母双杂交系统筛选人Universal Cdna文库,筛选出与ORP8相互作用的蛋白质,通过GST Pull-down以及免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)验证蛋白质相互作用,并通过流式细胞仪检测过表达ORP8对HepG2细胞周期的影响.结果:酵母双杂交筛选得到了精子相关抗原5(Homo sapiens sperm associated antigen 5,SPAG5),体外GST pull-down和Co-IP实验确证了ORP8-SPAG5的相互作用,流式细胞术显示ORP8过表达后与空载体相比,人肝癌细胞系HepG2的S期细胞数增加,G1期细胞数减少.结论:SPAG5是与ORP8相互作用的蛋白质,ORP8过表达影响人肝癌细胞系HepG2的细胞周期,可能通过SPAG5起作用.ORP8-SPAG5的相互作用为进一步研究ORP8在肝细胞中的功能及其机制提供了有用的线索     

酵母双杂交筛选类固醇激素合成急性调节蛋白的相互作用蛋白质

目的:利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与类固醇激素合成急性调节蛋白(STAR)相互作用的蛋白质。方法:将全长STAR基因克隆到酵母表达载体pDBLeu中,形成诱饵;将构建好的诱饵质粒转化至AH109酵母感受态中,利用酵母双杂交技术筛选人肝cDNA文库中与其相互作用的蛋白质,并进行相互作用的回转验证。结果:构建了酵母诱饵蛋白表达质粒pDBLeu-STAR,并筛选到6个猎物,其中有5对相互作用回转验证阳性。结论:为进一步研究STAR的功能和作用机制提供了新的线索。     

KIF2Abeta: A kinesin family member enriched in mouse male germ cells, interacts with translin associated factor-X (TRAX)

Translin associated factor X (TRAX) is a binding partner of TB-RBP/Translin. A cDNA encoding the 260 C-terminal amino acids of KIF2Abeta was isolated from mouse testis cDNAs in a yeast two-hybrid library screen for specific TRAX-interacting proteins. KIF2Abeta was expressed predominantly in the mouse testis and enriched in germ cells. The interaction of full-length KIF2Abeta or its C-terminus with TRAX was verified using in vitro synthesized fusion proteins. Deletion mapping of the TRAX-binding region of KIF2Abeta indicated that amino acids 514-659 were necessary and sufficient for the interaction in vivo. Confocal microscopy studies using GFP-fusion proteins demonstrated that KIF2Abeta colocalizes with TRAX in a perinuclear location. KIF2Abeta does not interact with TB-RBP, suggesting that either TRAX can function as an adaptor molecule for motor proteins and TB-RBP, or that this interaction reveals an undescribed role for TRAX in germ cells. The interaction with KIF2Abeta suggests a role for TRAX in microtubule-based functions during spermatogenesis.     

Identification and characterization of cDNAs encoding four novel proteins that interact with translin associated factor-X

Translin-associated factor X (TRAX) is the predominantly cytoplasmic binding partner of TB-RBP/translin in mouse testis. Four mouse testis cDNAs encoding specific TRAX-interacting proteins were isolated from a yeast two-hybrid library screen. One novel cDNA designated Tsnaxip1 (TRAX-interacting protein-1) encodes 709 amino acids. We isolated a cDNA encoding the 427 carboxy-terminal amino acids of MEA-2, a Golgi-associated, maleenhanced autoantigen; a cDNA encoding 429 amino acids with 73% homology to centrosomal Akap9; and a cDNA encoding 346 amino acids with 75% homology to SUN1, a predicted human protein that contains a SUN domain (which is present in some perinuclear proteins). Interactions were verified using in vitro synthesized fusion proteins. All four genes were expressed in the testis and enriched in germ cells. Confocal microscopy studies using green fluorescent protein fusion proteins determined that these TRAX-interacting proteins colocalize with TRAX. The data suggest that TRAX may have a function associated with perinuclear organelles during spermatogenesis.     

应用酵母双杂交系统筛选AMPK相互作用蛋白

一磷酸腺苷激活蛋白激酶(AMPK)是调节体内代谢平衡的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。应用酵母双杂交系统,以AMPKβ1亚基作为"诱饵"蛋白,筛选均一化的人源cDNA文库,寻找与AMPK相互作用的蛋白。通过对150个阳性克隆进行验证,最终得到了63个与AMPKβ1亚基相互作用的蛋白。其中,包括代谢酶、转录因子或转录相关蛋白、蛋白转运相关蛋白、GTP结合蛋白、支架蛋白、细胞周期调节蛋白、RNA结合蛋白等以及一些未知功能的蛋白。从酵母双杂交的结果来看,AMPK不仅在代谢领域,而且在许多非代谢领域,如核受体及其它转录因子的调节、信号转导、DNA修复及细胞周期调节等,可能都起到非常重要的作用。     

NXP-1, a human protein related to Rad21/Scc1/Mcd1, is a component of the nuclear matrix

Nuclear matrix is a complex intranuclear network supposed to be involved in the various nuclear functions. In order to identify the nuclear matrix proteins, we isolated a cDNA clone from a human placenta cDNA library. This clone was partially represented a known cDNA clone HA1237. HA1237 encoded a 631-amino-acid peptide, which we designated NXP-1. NXP-1 was related to yeast Rad21/Scc1/Mcd1, Xenopus XRAD21, and mouse PW29, and identical with HR21spA isolated from a human testis cDNA library. We developed a polyclonal antibody to the purified NXP-1 bacterially expressed as a fusion protein with GST. Western blot analysis with anti-NXP-1 polyclonal antibody showed nuclear matrix localization of NXP-1 in HeLa cells. Indirect immunofluorescence staining also showed nuclear and nuclear matrix localization of the NXP-1. Results of in vitro binding assays employing nuclear matrix preparations indicated that the N-terminal region (16-128 amino acid) of NXP-1 has an important role in nuclear matrix distribution.     

Characterization of zetin 1/rBSPRY,a novel binding partner of 14-3-3 proteins

14-3-3 proteins are ubiquitously expressed proteins which serve as central adaptors in different signal transduction cascades. In this study, yeast two-hybrid screening of a rat brain cDNA library identified a novel gene product termed zetin 1/rBSPRY that interacts with 14-3-3 zeta. The zetin 1/rBSPRY gene is ubiquitously expressed in a variety of rat tissues, with highest expression being found in testis. In adult brain, high levels of zetin 1/rBSPRY mRNA were observed in the hippocampus, cerebral cortex, and piriform cortex. Biochemical studies confirmed zetin 1/rBSPRY to interact with 14-3-3 zeta. Transient co-transfection in COS 7 cells caused a partial redistribution of zetin 1/rBSPRY into 14-3-3 zeta enriched submembranous foci at leading edges. Our results suggest a role for zetin 1/rBSPRY-14-3-3 interactions at specialized submembrane domains.     

利用酵母双杂交技术筛选与AtbZIP1相互作用的蛋白质

碱性亮氨酸拉链bZIP类转录因子在植物的生长发育、光形态建成、光信号传导及非生物胁迫反应中发挥重要的作用.为研究AtbZIP1基因的作用机理,本研究首先验证了该基因的自激活转录活性,通过缺失突变确定了该转录因子的转录激活结构域;以AtbZIP1缺失突变体AtbZ3为诱饵蛋白,采用Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System(Clonetch),共筛选获得5个与诱饵蛋白相互作用的蛋白质;并通过AbA(Aureobasidin A)抗生素标记基因,His营养缺陷和LacZ蓝白斑检测验证了阳性克隆.亚细胞定位分析发现,AtbZIP1蛋白除了定位于细胞核外,还定位于叶绿体细胞.通过分析这些靶蛋白的已知功能,为研究AtbZIP1蛋白的未知生物学功能提供重要信息.