油菜BnMKK2基因的克隆及表达分析

通过实验从陇油6号油菜中克隆得到了一种新的MAPK激酶基因BnMKK2基因的cDNA,全长1 344 bp,其中包括5′非翻译区（5′UTR）111 bp,3′非翻译区（3′UTR）165 bp,开放阅读框（ORF）长1 068 bp,编码355个氨基酸,该基因编码的蛋白质分子量为39.3 kDa,理论等电点为6.8。与拟南芥AtMKK2有很高的同源性,因此命名为BnMKK2(GenBank登录号:HQ848661)。该基因实时荧光定量PCR分析表明,BnMKK2基因的表达受低温胁迫诱导。     

油菜BnMKK4全长基因的克隆及表达分析

从‘陇油6号’油菜中克隆得到了一个新的BnMKK4基因的cDNA,全长1317bp,其中包括993bp的开放阅读框,159bp的5’非翻译区（5^1UTR）,165bp的3。非翻译区（3’UTR）。与拟南芥AtMKK4有很高的同源性,因此命名为BnMKK4（GenBank登录号JF268686）。该基因编码330个氨基酸的蛋白质,分子量36．5kDa,等电点为9．01。实时荧光定量PCR结果显示该基因表达受低温胁迫和盐胁迫的诱导,表明该基因在油菜适应低温胁迫和盐胁迫的过程中发挥作用。     

油菜RbohB基因的克隆及逆境响应表达分析

利用RACE技术从‘陇油6号’油菜中克隆得到一个新的RbohB基因,全长2 694 bp,开放阅读框2 541 bp,编码846个氨基酸。实时荧光定量PCR分析表明RbohB基因表达受低温、高盐、H₂O₂诱导,MAPKK抑制剂U0126预处理12 h再经低温、高盐、H₂O₂诱导,与单独处理结果相比,RbohB基因表达明显降低,表明该基因在油菜适应低温、高盐、H₂O₂胁迫过程中发挥作用,U0126对该基因的转录有抑制作用。NADPH氧化酶活性受H₂O₂处理的诱导,U0126预处理12 h再经H₂O₂处理,与单独H₂O₂处理结果相比,NADPH氧化酶活性明显降低,表明MAPKK抑制剂U0126对该酶活性有抑制作用。     

红肉猕猴桃DFR基因的克隆及表达分析

利用葡萄（Vitis vinifera）果实的DFR-cDNA序列搜索猕猴桃（Actinidia Lindl.）EST数据库,拼接所有与该cDNA相似片段成contig并借此设计引物,分离出红肉猕猴桃（A.chinensis var.rufopulpa）中DFR的两个克隆（AcDFR1和AcDFR2）的片段。在此基础上利用5′RACE和3′RACE技术,分别克隆到具有完整阅读框的AcDFR1（1264 bp）和靠近3′端的部分AcDFR2序列（880 bp）。AcDFR1与茶DFR-cDNA（Camellia sinensis）相似达84%,且AcDFR1与非洲菊变种（Gerbera hybrida var.regina）的氨基酸序列相似达80%。据DFR聚类分析,AcDFR1与AcDFR2蛋白类型上差异显著。实时定量PCR分析表明,AcDFR1在‘金魁＇（A.chinensis var.deliciosa‘Jinkui＇）中表达很高,AcDFR1和AcDFR2在‘金农＇（A.chinensis var.chinensis‘Jinnong＇）与‘红阳＇（A.chinensis var.chinensis‘Hongyang＇）中较低,且在果实发育后期（大约花后90～120 d）均有所升高,二者可能参与了红肉猕猴桃中花青素的积累,而在绿肉猕猴桃‘金魁＇与黄肉猕猴桃‘金农＇中,AcDFR1可能还参与了类黄酮代谢过程中的上游分支途径。     

油菜种子特异表达napin基因启动子的克隆及序列分析

通过PCR扩增,从油菜（Brassica napus cv.XY15)中克隆了种子特异表达napin基因启动子,序列分析表明,该启动子有1147个核苷酸,与已报道的序列比较,其核苷酸的同源性为99.9%和99.4%,这是一个新的napin基因启动子,已将其登录到GenBank,登录号为AF420598.     

基因的克隆及表达分析

DNA重组激活基因（Recombination activating genes RAG）是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因,也是脊椎动物进化分析的标记基因之一。鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力,是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼;由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性,又是研究鱼类基因组进化的独特材料。本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因。鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp,由三个外显子和两个内含子组成,其中开放阅读框长3192bp,编码1063个氨基酸。Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,只有单一的编码区,编码530个氨基酸。Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守。不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的,转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点。其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点,提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性。用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达,提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组,也可能参与了生殖细胞的DNA重组。RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达,在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号,在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号,说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期。     

茶树脂氢过氧化物裂解酶基因CsiHPL1的克隆及表达

根据茶树基因CsiHPL1的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR方法从茶树品种龙井43′中克隆了CsiHPL1序列,并分析了CsiHPL1在生物和非生物胁迫下的诱导表达情况及亚细胞定位。结果表明,CsiHPL1包含一个1 476 bp的最大开放阅读框,编码491个氨基酸,预测为13-HPL基因。Real-Time PCR分析结果表明,CsiHPL1的表达受到茶尺蠖取食、机械损伤和茉莉酸的诱导;构建了CsiHPL1与绿色荧光蛋白（GFP）基因的重组表达载体,经农杆菌瞬时转化烟草叶片,利用激光共聚焦显微镜在叶绿体中观察到GFP荧光,表明CsiHPL1编码的蛋白质为叶绿体蛋白质。     

根癌土壤农杆菌VirD2蛋白基因的克隆及原核表达

根据U．Washington发表的根癌土壤农杆菌(Agribacterium tumefaciens)C58Ti质粒基因序列,设计一对引物含NcoⅠ、SalⅠ酶切位点,利用PCR的方法,扩增了C58根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区蛋白VirD2基因,连接T载体经测序与发表的序列同源性达100％。将目的片段从T载体上切下,连接至原核表达载体PET-30a上,转化E．coliDH5α,筛选出阳性免隆,提质粒转化E．coil BL21,用IPTG诱导表达,经SDS-PAGE电泳,发现与对照比较在近50kD处有特异条带,与理论大小(49．5kD)相符表明所克隆的VirD2基因获得了原核表达。     

番茄 calnexin 基因的克隆及胁迫表达分析

Calnexin是内质网中重要的类凝集素分子伴侣,其主要作用是辅助糖基化蛋白的折叠和装配,调节内质网中的Ca2 稳态平衡和Ca2 信号传导过程。从番茄(Lycopersicon esculentum)的cDNA文库中克隆到calnexincDNA全序列,将其命名为Lecnx61.0,并以其3’端DNA片段为探针对番茄基因组进行Southern分析,结果表明Lecnx61.0在该基因组中仅有一个拷贝;Northern和W estern分析表明,Lecnx61.0的表达还受热激、冷害、盐害和内质网应激诱导剂衣霉素的诱导,但对干旱胁迫没有明显的反应。LeCNX 61.0蛋白对Ca2 亏缺胁迫的响应呈现组织特异性,但高浓度Ca2 并不影响各组织中LeCNX 61.0蛋白的含量,实验结果表明LeCNX 61.0蛋白可能在植物抵抗特定的环境胁迫中发挥作用。     

油葵HaFAD2-2基因的克隆及表达分析

脂肪酸脱氢酶2(fatty acid desaturase,FAD2)催化油酸生成亚油酸,是植物体内生成多不饱和脂肪酸的关键酶。根据已报道的向日葵(Helianthus annuus L.)FAD2基因序列,设计引物进行RT-PCR,克隆得到油葵FAD2-2基因全长cDNA,命名为HaFAD2-2。该基因开放阅读框为1 152bp,编码383个氨基酸,相对分子质量43.96kD,等电点为8.56。对基因组进行内含子调查发现,该基因在编码区内没有内含子。多序列比对和系统进化分析发现,FAD2-2基因编码蛋白与金盏菊(Calendula officinalis)、斑鸠菊(Vernonia galamensis)等菊科植物具有较近的亲缘关系。qRT-PCR分析表明,HaFAD2-2基因在根、茎、叶、花、子叶和未成熟种子中均有表达,且以叶中的表达量最高,未成熟种子中的表达量最低;低温(5℃、15℃)胁迫处理能显著促进该基因在根中的表达,抑制其在叶中的表达;盐胁迫(300 mmol/L NaCl)处理对其表达也具有抑制作用。该研究结果可为进一步探讨HaFAD2-2基因的功能奠定基础。     

菠萝蜜低聚肽对db/db小鼠炎症反应、血糖及血脂的影响

目的：研究菠萝蜜低聚肽（JOPs）干预对db/db糖尿病模型小鼠炎症反应、血糖及血脂的影响作用。方法：选择db/db糖尿病小鼠模型,将其随机分为3个JOPs组（0.2、0.4、0.8g/kg·BW）以及糖尿病模型对照组、二甲双胍对照组、乳清蛋白对照组,并选用db/m小鼠作为非糖尿病小鼠空白对照。经过为期6个月的干预,检测小鼠空腹血糖（FPG）、血清胰岛素（INS）、白细胞介素6（IL 6）、白细胞介素8（IL 8）、白细胞介素10（IL 10）和肿瘤坏死因子α（TNF α）、C反应蛋白（CRP）以及脂代谢指标。结果：JOPs可显著降低db/db糖尿病小鼠空腹血糖水平及胰岛素抵抗指数;可使血清IL 6、TNF α、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）显著降低,并使高密度脂蛋白胆固醇（HDL C）显著升高。结论：JOPs干预可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平,改善胰岛素抵抗,同时有效调节炎症反应及血脂代谢。     

大熊猫FOXL2基因的克隆、序列分析及表达

从大熊猫基因组中克隆了FOXL2基因,并对其进行序列分析及原核表达和真核表达.将FOXL2编码区序列克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出FOXL2重组蛋白.成功构建了真核表达载体FOXL2-pcDNA3.1/V5-His C,并通过脂质体介导转染HEK293细胞,Western blot检测FOXL2蛋白表达.SDS-PAGE分析表明,FOXL2重组蛋白在诱导4h后表达量达到峰值,其大小约为58.9 kDa,Western blot分析结果显示重组蛋白能够被抗His单克隆抗体特异性识别.FOXL2基因的克隆及其表达为进一步进行FOXL2的活性检测以及应用研究奠定了基础.     

草莓APETALA2同源基因的克隆及表达分析

利用同源克隆方法首次从草莓花芽cDNA中分离出APETALA2同源基因SAP2。SAP2全长182bp,编码435个氨基酸。序列分析表明,SAP2具有AP2家族典型的结构域。采用RT-PCR方法分析SAP2在不同组织中的表达情况,结果显示SAP2在草莓营养组织、花芽以及不同花器官中均有表达,与拟南芥AP2、矮牵牛PhAP2A的表达模式一致。以上结果说明SAP2是草莓的AP2同源基因。     

水曲柳FmWRKY44基因克隆及表达分析

克隆水曲柳FmWRKY44基因,探究其在非生物胁迫和激素胁迫中的作用。利用水曲柳干旱转录组序列设计特异引物,克隆FmWRKY44基因的完整ORF序列,并对该序列及其编码产物进行生物信息学分析,采用qRT-PCR技术分析FmWRKY44表达模式。克隆了一个水曲柳WKRY基因,编码区长1383bp,编码460氨基酸。对其编码蛋白分析发现其为稳定亲水蛋白,亚细胞定位预测主要在细胞核,进行保守域及同源性分析分析,属于WRKYⅠ类家族,命名为FmWRKY44。qRT-PCR分析发现,FmWRKY44在种子中高度表达,并不同程度响应低温、高温、盐和干旱4种非生物胁迫。同时发现FmWRKY44与NAA、ABA、GA3、JA植物激素响应,水曲柳FmWRKY44基因积极响应低温、高温胁迫。     

茶树硝酸盐转运蛋白基因的克隆和表达分析

硝酸盐转运蛋白（NRT）是植物吸收和利用硝态氮的一种关键蛋白。运用RACE技术从茶树中扩增出NRT基因的cDNA,并利用实时荧光定量PCR检测了CsNRT基因在不同茶树器官与品种之间的差异表达。结果表明：CsNRT基因的cDNA全长2 061 bp,开放阅读框为1 818 bp,编码含由605个氨基酸组成的蛋白质,GenBank登录号为KJ160503,属于NRT2基因家族。CsNRT为组成型基因,对不同处理的水培茶苗进行定量表达分析显示,该基因在根、茎、叶中都有表达,其中在根部的表达水平最高,1.0 mmol·L-1的NO3-可诱导其表达量上升7.53倍。不同茶树品种中CsNRT基因的表达也有较大差异,‘龙井长叶’和‘凫早2号’的表达量较高,前者强烈响应0.5和1.0 mmol·L-1 NO3-的诱导,后者的响应浓度为1.0和2.0mmol·L-1,而‘舒茶早’在各浓度下的表达差异不明显。     

芜菁花青素合成酶基因的克隆、序列分析及表达

目的：克隆津田芜菁和赤丸芜菁花青素合成酶（ANS）基因并研究其表达特性。方法：用UV-A处理津田芜菁和赤丸芜菁块根24h后提取总RNA,通过RT-PCR方法克隆BrANS1和BrANS2基因并进行序列分析,通过Northern杂交检测BrANS1和BrANS2基因的表达。结果：BrANS1和BrANS2的开放读码框为1077bp,编码358个氨基酸残基;BRANS1和BRANS2与甘蓝ANS的同源性达97％,第211-307肽段具有20G-Fe（Ⅱ）加氧酶家族基因的结构域;BrANS1和BRANS2基因具有高度同源性,核苷酸序列在5个位置上存在差异,推导的氨基酸序列完全相同;uv-A可以诱导BrANS1和BrANS2表达,基因的表达量与处理时间相关。结论：克隆了津田芜菁和赤丸芜菁的BRANS1和BrANS2基因,这将为筛选依光型和非依光型花青素生物合成催化酶基因奠定研究基础。     

人RP2基因的克隆,测序和初步表达

ＲＰ２是最近定位克隆的一个Ｘ连锁隐性的视网膜色素变性基因。用ＰＣＲ法直接从人视网膜ｃＤＮＡ文库中扩增以包括人ＲＰ２基因编码区的内在ｃＤＮＡ,先克隆到ｐＪＬＡ５０３载体中,随后将ＲＰ２编码区基因亚克隆至表达载体ｐＰＲＯＥＸＨＴａ中,并进行了ＤＮＡ序列分析。用ＩＰＴＧ诱导ｈＲＰ２融合蛋白在大肠杆菌ＤＨ５α菌株中表达,３０℃诱导１０ｈ后重组蛋白质约占菌体总蛋白质的７％,而３７℃诱导５ｈ后重组蛋白邓占菌体