流行性出血热病毒血凝和血凝抑制试验的进一步研究

本文对流行性出血热研究中传统采用的血凝和血凝抑制试验进行了较大改进。首次用吐温80-乙醚法制备滴度较高的血凝素;以鸽红细胞代替了常用的鹅血球;采用冻存的血球替代了新鲜红细胞。     

甲3型流行性感冒病毒血凝素的pH特征

本文报告,pH9.6碳酸缓冲液对甲3型流感病毒的血凝滴度有明显降低作用,对甲1型和乙型仅有轻微影响,对甲2型的影响则介于两者之间。用不同pH的碳酸缓冲液、磷酸缓冲液及盐水等,测定甲3型流感病毒的血凝滴度,结果表明高pH对其有明显影响。分别具有甲3、甲2或甲1血凝素的重组株,在pH9.6碳酸缓冲液中,其血凝素的稳定性也和上述结果一样,即具有甲3血凝素的重组株,其血凝素对pH9.6碳酸缓冲液最敏感;甲1重组株的血凝素较稳定:而具有甲2血凝素的重组株则介于两者之间。利用此pH特征测定新分离的经血凝抑制试验鉴定为甲3型和乙型流感病毒,得到同样结果,因此有可能利用此pH特征对新分离的甲3型流感病毒进行初步鉴定。     

无动物细胞条件下麻疹病毒与细菌共生培养的研究

麻疹病毒在无动物细胞的１９９培养基内与甲型链球菌共生的条件下,能自主复制,并可无限地传代。用猴及人的“Ｏ”型红血球凝集试验方法进行实验的结果显示,其血凝滴度可超过１：１０００,抗麻疹病毒免疫血清对所培养的病毒血凝抑制滴度为１：６４。用此病毒免疫家兔所产生的抗体,对麻疹病毒的血凝反应可引起抑制作用。因此,可以说明在培养基内经共生培养所繁殖的病毒的确是麻疹病毒,证实麻疹病毒在无动物细胞的甲型链球菌共生     

麻疹病毒血凝素基因H的点突变与血凝作用的转变

经Ｂ９５ａ细胞系纯化分离的三株麻疹病毒Ｆｕ、ＩＭＡ、ＳＭＤ的血凝试验（ＨＡＤ）为阴性,但将它们分别感染Ｖｅｒｏ细胞并传代培养后其血凝试验由阴性转变为阳性。实验证明这种血凝表型的转变与血凝素基因Ｈ的表达与吸附无关。以ＰＣＲ扩增血凝素基因Ｈ和融合基因Ｆ,并分别进行序列分析。表明三株病毒在两种培养细胞中传代后其融合基因Ｆ的序列未发现差异。但血凝素基因Ｈ的序列却有显著的点突变并伴随血凝表型的转变。其中Ｆｕ     

影响腺病毒凝集血球特性的某些因素

本文报告采用人胚肾细胞制备的腺病毒血凝素,就不同个体猴血球、不同血球浓度、不同培养温度、不同pH对腺病毒血凝滴度的影响进行的研究。结果表明,3、7、11、1{、21型腺病毒血凝滴度不仅受不同个体猴血球影响,(其中以3、7、1 4型病毒显著),同样也受不同血球浓度、培养温度、不同pH液体影响。进行腺病毒血凝反应的适宜条件为：选用对腺病毒敏感的猴血球,1％红细胞悬液、用1／50 M pH 7.6—8．0PBS作稀释液、37℃培养1小时。人胚肾细胞和HcLa细胞均可用于制备腺病毒血凝素,在人胚肾细胞上制备腺病毒血凝素时采用103—105ICID50病毒感染细胞,受染细胞在染毒后3—5天出现完全病变,产生的血凝素滴度高,午型血凝素滴度高于3型。     

肾综合征出血热病毒血凝素的研究 Ⅰ.病毒血凝活性的初步研究

以不同宿主来源的肾综合征出血热病毒(HFRSV)感染乳鼠,取脑经蔗糖-丙酮法制备血凝素,对这些毒株的血凝活性和血凝抑制(下称血抑,HI)反应进行了初步研究比较。结果提示受试毒株间血凝活性高低不等,似与对乳鼠的致病毒力有一定关系,血凝素抗原与其他病毒的免疫血清无交叉反应,在血凝活性较高的几个毒株间血凝素抗原性差异不明显,并找到了一株血抑滴度较高的单克隆抗体(McAb)。     

流行性乙型脑炎病毒的血凝试验III．苯浸血凝素性質的进一步研究

1．作者会发表流乙脑炎病毒戚染鼠塍的怒液以苯庭理溅屡蒸磺乾燥後,可以獾得较稚嫩定的血凝秦。同时还报导了新华廠的苯有高度的血凝抑制作用,不经减麈蒸驶除浮,即不能凝集血球。进一步研究强现有些廒家(新中等)出产的苯不抑制血凝,因此不经减屋蒸发,亦可獾得高效僵的血凝素感液。此獯血凝素怒液在4℃冰箱内可保持其滴度10天到1月时,其滴度由1：2560降至1：160。 2．流乙脑炎病毒血凝素用pH6．3的磷酸鹽缓重鹽水稀释时,於试验操作过程中,其滴度亦会降低,因之影响结果的准碓性。我们改用了pH8．2的磷酸噙授衙啸水稀释血凝秦及血清,加入磷酸二氧钠嗵水稀释的血球,克服了这种缺点。 3．实验又证明我们所裂成的血凝素,可以作为補體结抗元。在特異性方面,似乎此Espana氏苯浸抗元遗璎好一点;其优点在于制偏方法简单,无需真空帛氣设偏。     

双歧杆菌血凝特性的研究

观察3株双歧杆菌对人O型、人B型、绵羊、兔、鸡和小鼠红细胞的凝集滴度,并对其血凝素进行了提取。结果表明,3株双歧杆菌均能凝集各种来源的红细胞,血凝滴度无明显差异;D-甘露糖不能抑制血凝。提取的脂磷壁酸(LTA)具有血凝活性。其血凝素受体为糖类。     

高滴度感染力H5N1亚型禽流感病毒假病毒颗粒的制备

利用一个瞬时共转染系统,将H5N1亚型禽流感病毒的血凝素（Hemagglutinin,HA）蛋白与神经氨酸酶（Neuraminidase,NA）蛋白整合到鼠白血病病毒假病毒颗粒表面,包装成表达HA与NA的假病毒颗粒,通过透射电子显微镜形态学观察、感染滴度分析、血凝试验和中和试验研究其生物学特性。研究获得了高滴度感染力的H5N1假病毒颗粒（H5N1 Pseudotyped particle,H5N1Pp）,H5N1Pp的感染力滴度为1E8 Pp/mL,形态、血凝活性及中和特性均与野生H5N1病毒相似,结果为H5N1病毒受体、HA与NA的功能、中和抗体、抗病毒药物开发研究的开展建立了平台。     

流行性出血热病毒血凝素抗原位点分析

用八株不同来源的流行性出血热(EHF)病毒的单克隆抗体(McAb),采用血凝抑制试验、反向间接血凝抑制试验、间接酶联免疫及阻断酶联免疫试验等,对两种方法(TE、SA)制备的血凝素抗原进行分析。根据A35、2A6McA5试验的结果,证实血凝素抗原中的核蛋白上存在有非构象依赖性的血凝结合位点;而另外5株McAb在血凝抑制活性方面,虽具有明显的株间交叉,但在反向间接血凝抑制试验、间接酶联免疫试验时则均为阴性,故认为其血凝结合位点位于病毒的膜蛋白,可能与G_2糖蛋白有关,为构象依赖性位点。有关4G6McAb,在阻断酶联免疫试验时,虽与A35、2A6一样具有较高的阻断率,但在反向间接血凝抑制试验、间接酶联免疫试验时明显有别于后二者,对其属性有待进一步确定。     

RNA干扰抑制麻疹病毒体外复制的实验研究

为了研究短发夹RNA(shRNA)介导的RNA干扰对麻疹病毒体外复制的抑制作用,构建靶向与麻疹病毒复制密切相关的宿主细胞基因Rab9 GTPase基因特异性shRNA表达载体,分别转染Vero-E6和B95a细胞后感染麻疹病毒Edmonston株和野生株。逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫印迹技术(Western-blot)检测转染细胞内Rab9 GTPase基因表达水平;标准蚀斑试验测定麻疹病毒滴度。结果显示转染细胞内Rab9 GTPase mRNA和蛋白质的表达水平同对照组相比明显降低,标准蚀斑试验显示麻疹病毒的复制受到显著抑制,抑制率达到90%以上。结果表明载体介导的shRNAs能通过特异性下调Rab9 GTPase基因表达抑制麻疹病毒体外复制,Rab9 GTPase可能成为治疗麻疹病毒感染的RNA干扰靶。     

影响风疹病毒血凝和血凝抑制试验若干因素的研究

对大量制备高效价风疹病毒(RV)血凝素问题进行研究发现,每日更换RV感染细胞维持液可获得大量高效价血凝素。试验用Auletta液稀释血凝素、PH6.2、ca~(++)、Mg~(++)。离子浓度各0.1％时血凝滴度最高。比较两种处理血清中非特异性凝集抑制物的方法,发现高岭土法和肝素—氯化锰法结果相似。用此两种方法同时检测107份孕妇血清,结果符合率达98％。但高岭土法更为简便经济。     

肾综合征出血热病毒血凝素的研究 Ⅱ.血凝和血凝抑制试验影响因素的探讨

本文探讨了肾综合征出血热病毒(HFRSV)血凝和血凝抑制(简称血抑)试验的主要影响因素,观察到HFRSV血凝素的制备要求较高,4℃保存的效果较好,血凝素对热似有一定的稳定性,血凝作用的条件较为严格,最佳pH在5.7—6.1,鹅血球较为敏感,氯仿法去除血清中非特异性抑制物有效而简便。通过试验条件的模索和方法的改进,使之适用于基层。     

一种诊断肾综合证出血热的新方法——血凝与血凝抑制试验

第四军医大学微生物教研室和安徽省医学科学研究所病毒室共同协作,首次用国内分离出的毒株建立了肾综合证出血热(HFRS)病毒血凝与血凝抑制试验。该法首先将国内各代表毒株和朝鲜出血热(KHF)病毒76/118株适应于乳鼠,在此基础上,参照汤一苇等报导的方法加以简化,从感染乳鼠脑中制备血凝素。对国内主要代表毒株血凝活性进行了研究。     

H5N1禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达及生物活性鉴定

经RT-PCR扩增了H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)片断,限制性内切酶酶切后将其克隆到pFastBacHTA杆状病毒转座载体,经酶切鉴定及测序,筛选出阳性重组转座载体pFastBac-H5。将pFastBacH5转化含有杆状病毒穿梭载体（bacmid）的DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定获得重组杆状病毒穿梭载体rBacmid-H5。rBacmid-H5在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,SDS－PAGE蛋白电泳、Western blot、血凝试验和血凝抑制试验分析表明：分子量约63Kd重组血凝素蛋白（rH5）在sf9昆虫细胞中实现了高效表达。rH5具有血凝活性,而且其血凝活性能够被H5N1禽流感病毒高免血清所抑制;rH5免疫鸡诱导产生针对H5N1禽流感病毒亚型特异的血凝抑制抗体,说明表达的重组蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性。     

鸡胚细胞的传代培养和麻疹病毒的增殖

为了建立原代鸡胚细胞的传代培养工艺,探究传代鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性和适应性,本研究将原代鸡胚细胞进行传代培养,分别采用原代鸡胚细胞和传代鸡胚细胞培养麻疹病毒沪-191(Shanghai-191,S-191)株毒种,并对病毒收获液进行滴度检测和基因序列测定。结果显示,原代鸡胚细胞可稳定传代培养至第10代,各代次细胞生长趋势相似;第5代鸡胚细胞染色体检查为正常染色体核型;第8代鸡胚细胞成瘤性检查未见成瘤;采用第3、5代鸡胚细胞制备的麻疹病毒滴度水平高于原代鸡胚细胞,但无显著性差异(n=3,P>0.05),编码病毒核蛋白(nucleoprotein,N)和血凝素蛋白(hemagglutinin,H)的基因序列与S-191株完全一致,未发生变异。本研究证实,原代鸡胚细胞可进行传代培养,各代次鸡胚细胞对麻疹病毒的敏感性不变,产毒水平无显著差异,可用于培养麻疹病毒。     

流行性感冒免疫的研究IV．人体接种前抗体水平与流感活疫苗的免疫效果的关系

本文报告了应用端胚绒毛尿囊膜小块法测定A2型与B型病毒滴度和A2型的中和抗体的结果。对本法作了改进,并指出影响病毒和抗体滴度的一些因素。采用血凝抑制常规法、血凝抑制加温法和尿膜小块中和法测定了以往流成活疫苗试验人体的免疫前血清中和抗体,并与疫苗接种后的病毒分离率(代表生存性)和抗体升高率(代表免疫原性)联系起来进行分析,证明被接种者原来的免疫水平对活疫苗的生存性和免疫原性测定结果有很大的影响。在这3种抗体测定方法中,中和法最灵敏,血凝抑制加温法次之,常规法最濿。     

安徽省流行性出血热病毒杂交瘤单克隆抗体的研制与应用

用流行性出血热病毒(EHFV)李株和陈株血凝素(HAN)分别免疫Balb/C小鼠,取其脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/O融合,杂交瘤生长孔率为97.5％和60％,阳性率各为2.5％和22％,克隆化培养阳性率达到100％。通过筛选得2株杂交瘤细胞、一株为2B_7、另一株为1H_8。其腹水单克隆抗体(McAb)滴度均达1∶16×10~4—32×10~4。1H_8的血凝抑制滴度达1∶5120。经染色体核型分析,杂交细胞染色体2B_7为80—97条,1H_8为85—105条,每个细胞均含一条中着丝点标记染色体。McAb的Ig类别和IgG亚类检测结果2B_7为IgM,1H_8为IgG_(2b)。两者对19株不同来源的EHFV具有不同的反应,1H_8McAb与19株都具有不同程度的免疫荧光反应,滴度都较高,且对5株不同来源的EHFV-HAN具有血凝抑制活性,滴度在1∶1280—5120,故1H_8为血凝抑制抗体;2B_7只对12株EHFV起反应,对7株不起反应,且没有血凝抑制活性。这说明1H_8与2B_7具有不同的特性。     

麻疹病毒L4株血凝素基因的克隆与表达及免疫原性

从部分减毒的麻疹病毒Ｌ４株感染的Ｖｅｒｏ细胞中提取ｍＲＮＡ,进行逆转录及ＰＣＲ扩增,克隆到了长１．９ｋｂ的４个血凝素基因克隆,ＤＮＡ序列分析发现,Ｌ４株的血凝素甘因有４个碱基与Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ株不一致。造成了３个氨基酸差异,这４个克隆在重组痘苗中的表达后,３个克隆的表达产物均表现出良好的血凝活性,助融合活性（Ｆｕｓｉｏｎｈｅｌｐｅｒ）和较强的免疫原性,表达血凝素分子量分别为未糖化的６８ｋＤ以及糖     

一种抗AIV共有独特型抗体具有AIV血凝素分子的内影象

用纯化的鸡抗禽流感病毒(AIV)IgG作免疫原,通过单克隆抗体技术制备出1株分泌针对鸡抗AIV和兔抗AIV共有独特型抗体的杂交瘤细胞.竞争抑制试验、特异性检验和诱导产生血凝抑制抗体的功能实验证明,此抗体具有AIV血凝素分子的内影象.