CRISPR/Cas9与心血管疾病

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9(CRISPR-associated proteins)作为一种新型基因组编辑技术,为解释疾病的发生机制和治疗疾病提供了新方法。来自Ⅱ型原核CRISPR系统的CRISPR/Cas9能够通过单链向导RNA(single guide RNA, sgRNA)将Cas9核酸酶靶定到特定的基因组序列发挥作用。已经被成功用来进行基因编辑构建疾病模型,以进行相关领域的功能研究和疾病的治疗。CRISPR/Cas9技术正在迅速的应用于生物医学研究的各个领域,包括心血管领域,它促进了人们对电生理、心肌病、心律失常以及其他心血管疾病的更多了解,已经创建了靶向很多基因的细胞和动物模型,为新一类疗法打开了大门。本综述介绍了CRISPR/Cas9的作用原理、优点和局限性,以及在心血管疾病中的应用进展。     

CRISPR/Cas9系统研究进展

CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调控目标基因表达水平的能力,从而为生物体的精确基因组编辑提供了有力的工具。简化后的CRISPR/Cas9系统由两部分组成:Cas9蛋白和sgRNA。其作用原理为sgRNA通过自身的Cas9把手与Cas9蛋白形成Cas9-sgRNA复合体,Cas9-sgRNA复合体中sgRNA的碱基互补配对区序列与目标基因的靶序列通过碱基互补配对原则进行配对结合,Cas9利用自身的核酸内切酶活性对目标DNA序列进行切割。与传统的基因组编辑技术相比,CRISPR/Cas9系统具有几大明显的优势:易用性、简便性、低成本、可编程性以及可同时编辑多个基因。CRISPR/Cas9基因组编辑技术以及衍生出来的CRISPRi和CRISPRa基因表达调控技术已经广泛应用于多种真核和原核生物中。综述了CRISPR/Cas9系统的起源、作用机理、在生物体中的应用和其衍生出的技术,并概述了其脱靶效应和未来前景。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术

规律成簇间隔短回文重复序列(CRISPR)协同其相关蛋白Cas组成了细菌和古细菌的获得性免疫系统。利用该系统可以对外来某一特定单链或双链DNA实施高度特异性沉默或降解的特性,近年来对基因组进行精确定点编辑的CRISPR/Cas系统迅速发展。着重介绍了CRISPR/Cas系统的研究历史、结构、分类及作用机制,并分析讨论了现阶段以Cas9为核心的Ⅱ型系统在应用方面存在的问题及前景。     

CRISPR/Cas9系统在昆虫中的应用

CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated nuclease 9)技术是一种RNA引导的基因组靶向编辑技术,能对基因组序列进行精确编辑,在探究基因功能、修复受损基因、沉默有害基因、改良品质性状等方面具有广阔的应用前景。近年来,随着对CRISPR/Cas9系统研究的不断深入和改造,该系统以其操作简易、省时、高效等优点在生物学研究的众多领域中得以推广和应用,特别是在果蝇(Bombyx mori)、家蚕(silkworm)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)和蝴蝶(butterfly)等多种昆虫中。本文概述了CRISPR/Cas9的结构、作用原理及发展优化,总结了CRISPR/Cas9导入昆虫的策略和在昆虫中的应用,以及对CRISPR/Cas9系统产生脱靶问题的应对策略,以期对经济昆虫和有益昆虫的分子育种、害虫的生物技术防控等研究提供参考。     

CRISPR/Cas基因编辑系统研究进展

规律性成簇间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR)的发现和工程技术对生命科学的发展带来巨大的推动作用。RNA引导的Cas(CRISPR-associated)酶已被用作操纵细胞、动物和植物基因组的工具。这加速了基础研究的步伐,并使其在临床和农业上的应用成为可能。CRISPR/Cas9对在实验系统中进行的功能基因组学的研究有重大影响。CRISPR/Cas9系统自发现以来,因其操作便捷、成本低、特异性高、可同时打靶任意数量基因等优点而被广泛应用。经过近几年研究发现,Cas9变异体(Cas12a、Cas13)有利于突破和克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制,Cas12a极大地扩展了基因编辑靶位点的选择范围,同时其介导的多基因编辑具有明显的优势;Cas13等蛋白能特异性结合和编辑RNA,开启了转录组研究的新篇章。本文主要就CRISPR/Cas的研究背景以及Cas9、Cas12a和Cas13系统研究进展和应用进行综述,并对其应用前景和发展方向进行了展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在丝状真菌中的应用

随着对丝状真菌基因水平研究的不断深入,CRISPR/Cas9技术作为先进的基因编辑技术,已被广泛应用于丝状真菌的基因编辑。探究了CRISPR/Cas9系统在不同丝状真菌中的应用情况,主要从sgRNA的构建与表达、Cas9蛋白的改造与表达、不同的DNA双链断裂修复（DNA double-strand break,DSB）方式等方面进行概述,并对编辑效率、脱靶效应进行总结,旨在为今后丝状真菌中CRISPR/Cas9系统的构建及改良提供思路。     

CRISPR/Cas9在肿瘤治疗中的研究进展

CRISPR/Cas9技术自从出现以来便迅速应用于肿瘤研究。在肿瘤发生的机理研究中,CRISPR/Cas9可用于研究单核苷酸突变、染色体异位等因素在肿瘤发生中的作用机制,同时也可以用于肿瘤细胞中功能缺陷基因的筛选。在肿瘤治疗方法的研究中,CRISPR/Cas9主要用于诱发机制比较清晰且诱因为病毒的肿瘤类型,例如鼻咽癌、宫颈癌等,通过对相应病毒的基因进行编辑从而抑制其致癌作用。利用CRISPR/Cas9技术还可以加速新肿瘤治疗靶点基因的发现。尽管发展和应用十分迅速,但是CRISPR/Cas9在肿瘤研究和治疗中的作用仍然受多种因素的限制,包括Cas9和sgRNA的输送效率、脱靶效应以及安全性和成本等。对CRISPR/Cas9在肿瘤研究中的应用进展进行了综述,以期为肿瘤发生、转移机制和肿瘤治疗等方面的研究提供参考。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术的研究进展及其应用

随着测序技术的不断进步,获得了越来越多物种的全基因组序列。面对这些海量的基因组数据,基因定点编辑技术是高效捕获目标基因、迅速获得基因功能和应用信息的重要研究手段。CRISPR/Cas9是目前最有效的一种基因定点编辑技术。CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated)是广泛存在于细菌及古生菌中的,由细菌体长期进化而形成,能够降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统。因此,对CRISPR/Cas9系统的发展、应用,以其在相关研究中的应用前景进行阐述显得尤为必要。     

CRISPR/Cas9系统中sgRNA设计与脱靶效应评估

基于CRISPR/Cas9系统介导的第三代基因组编辑技术,已成功应用于动物、植物和微生物等诸多物种的基因组改造。如何提高CRISPR/Cas9技术的基因组编辑效率和最大限度降低脱靶风险一直是本领域的研究热点,而使用高效且特异的sgRNA(Small guide RNA)是基因组改造成功的关键性因素之一。目前,已有多款针对CRISPR/Cas9技术的sgRNA设计和/或脱靶效应评估软件,但不同的软件各有优缺点。本文重点对16款sgRNA 设计和脱靶效应评估在线和单机版软件的特点进行了阐述,通过制定38项评估指标对不同软件进行了比较分析,最后对11种用于检测基因组编辑效率和脱靶的实验方法,以及如何筛选高效且特异的sgRNA进行了归纳总结。     

Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing

The CRISPR/Cas9 system is a rapid, simple, and often extremely efficient gene editing method. This method has been used in a variety of organisms and cell types over the past several years. However, using this technology for generating gene-edited animals involves a number of obstacles. One such obstacle is mosaicism, which is common in founder animals. This is especially the case when the CRISPR/Cas9 system is used in embryos. Here we review the pros and cons of mosaic mutations of gene-edited animals caused by using the CRISPR/Cas9 system in embryos. Furthermore, we will discuss the mechanisms underlying mosaic mutations resulting from the CRISPR/Cas9 system, as well as the possible strategies for reducing mosaicism. By developing ways to overcome mosaic mutations when using CRISPR/Cas9, genotyping for germline gene disruptions should become more reliable. This achievement will pave the way for using the CRISPR technology in the research and clinical applications where mosaicism is an issue.     

CRISPR/Cas9系统纳米递送及其在肿瘤治疗中应用

新兴的CRISPR/Cas9基因编辑技术可实现在分子水平上对基因进行操作,具有设计简单、易于操作、特异性好、效率高等优点,广泛应用于肿瘤发生、发展和转移的潜在机制以及临床治疗的研究.利用纳米技术研发的非病毒纳米载体可以将CRISPR/Cas9系统高效递送到体内,为CRISPR/Cas9技术在临床领域的应用提供新途径.本文介绍CRISPR/Cas9的作用原理,简要概括目前CRISPR/Cas9系统的递送形式和常用的纳米递送载体,总结在部分肿瘤治疗中应用该技术的研究进展,并进一步对此进行展望.     

CRISPR/Cas9技术及其在转基因动物中的应用

CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组定点编辑技术,具有设计简单、特异性强、效率高及可以在目标位点产生多种类型的编辑结果等特点,适用于在多种细胞中进行大规模的基因编辑。综述了CRISPR/Cas9技术的研究背景、基本原理和研究进展,从靶基因敲除(knock-out)、外源基因整合(knock-in)和目标基因转录沉默(knock-down)等方面总结了CRISPR/Cas9在转基因动物中的应用概况,并对现有的三种基因组定点编辑技术进行了比较。CRISPR/Cas9技术在转基因动物中具有明显的应用优势和良好前景。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的本科教学实验体系的创建与实践

CRISPR/Cas9是新兴的基因编辑技术,在生命科学研究中发挥着重要的作用。将它引入本科生的实验教学,使本科生了解这项前沿科研技术很有意义。我们创建了一个基于CRISPR/ Cas9技术的本科教学实验体系。该实验体系侧重CRISPR/Cas9技术在哺乳动物细胞中的应用,选用一株基因组上被插入mCherry基因的小鼠胚胎成纤维细胞为实验材料,命名为STO-82。首先设计靶向mCherry的sgRNA,构建CRISPR-Cas9/sgRNA共表达质粒。经测序验证无误后,转染到STO-82细胞。采用流式细胞仪分析检测mCherry阴性和阳性两群细胞,分选出阴性单细胞并扩大培养。最后用测序检验单克隆细胞中靶标DNA序列的编辑情况。结果显示,靶位点有插入或缺失突变,说明体系创建成功。该实验体系将sgRNA设计、CRISPR-Cas9/sgRNA共表达质粒的构建、细胞转染、单细胞分选、单克隆细胞培养、测序序列分析等内容融合为一个综合实验,用于高年级本科生的实验教学。根据实际情况,将教学实践内容分解分块教学,也可以做完整性项目教学。本教学实践采用10人左右的小班分块教学,2人一组,经过3个班（共13组）的实践,绝大部分学生都能完成实验,得到预期结果。通过这个实验,学生加深了对CRISPR/Cas9技术的原理和实验流程的理解,锻炼了实验操作能力和严谨的科研思维,也使学生对该技术的医疗应用风险有了一些认识。     

CRISPR/Cas9 system in Plasmodium falciparum using the centromere plasmid

The CRISPR/Cas9 nuclease system is a powerful method to genetically modify the human malarial parasite, Plasmodium falciparum. Currently, this method is carried out by co-transfection with two plasmids, one containing the Cas9 nuclease gene, and another encoding the sgRNA and the donor template DNA. However, the efficiency of modification is currently low owing to the low frequency of these plasmids in the parasites. To improve the CRISPR/Cas9 nuclease system for P. falciparum, we developed a novel method using the transgenic parasite, PfCAS9, which stably expresses the Cas9 nuclease using the centromere plasmid. To examine the efficiency of genetic modification using the PfCAS9 parasite, we performed site-directed mutagenesis of kelch13 gene, which is considered to be involved in artemisinin resistance. Our results demonstrated that the targeted mutation could be introduced with almost 100% efficiency when the transfected PfCAS9 parasites were treated with two drugs to maintain both the centromere plasmid containing the Cas9 nuclease and the plasmid having the sgRNA. Therefore, the PfCAS9 parasite is a useful parasite line for the genetic modification of P. falciparum.     

Chromosome engineering in zygotes with CRISPR/Cas9

Deletions, duplications, and inversions of large genomic regions covering several genes are an important class of disease causing variants in humans. Modeling these structural variants in mice requires multistep processes in ES cells, which has limited their availability. Mutant mice containing small insertions, deletions, and single nucleotide polymorphisms can be reliably generated using CRISPR/Cas9 directly in mouse zygotes. Large structural variants can be generated using CRISPR/Cas9 in ES cells, but it has not been possible to generate these directly in zygotes. We now demonstrate the direct generation of deletions, duplications and inversions of up to one million base pairs by zygote injection. genesis 54:78–85, 2016. © 2016 The Authors. genesis Published by Wiley Periodicals, Inc.     

CRISPR/Cas12a系统：核酸检测的多功能工具

规律成簇的间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）是原核生物的适应性免疫系统,对抗外来遗传物质（如质粒和噬菌体）的攻击。近年来,科学家们发现了一种新型基因编辑工具,一种强大的分子剪刀CRISPR/Cas12a系统,该系统在对靶标DNA进行切割的同时还具有对体系内单链DNA进行任意切割的活性,并将其转移到体外检测系统。本文对CRISPR/Cas12a系统组成、结构、Cas12a与Cas9的对比和CRISPR/Cas12a系统在核酸检测中的应用进行了综述。