用两步PCR法克隆全长cDNA

采用两步 PCR法成功地克隆了一个全长的 c DNA.首先 ,用差式分析法克隆得到差别表达的 c DNA片段 ,再分别用这些片段内部的特异序列及 c DNA两端不同接头的序列为引物进行第一步 PCR扩增 ,得到差别 c DNA片段的上游和下游序列 .然后 ,根据第一步 PCR扩增得到的上游和下游序列设计基因特异的引物进行第二步 PCR,从而得到全长的 c DNA.     

磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星DNA片段

将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的中国李品种小黄李(Prunus salicinacv.Xiaohuangli)基因组DNA酶切片段杂交,以此杂交片段为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,根据PCR产物测序结果设计引物作为微卫星DNA的标记引物.结果在随机挑选的36个克隆进行菌落PCR检测时,从31个阳性克隆中挑选18个克隆进行测序后获得了12条特异序列,设计的8对SSR引物均在5个中国李受试品种上获得了预期的扩增产物,其中4对引物在受试品种上表现出多态性.     

基于PCR的染色体步移中单引物扩增的克服与非特异引物的利用

基于PCR的染色体步移(PCR-Walking)方法已有许多种,包括反向PCR、连接介导的PCR、随机引物PCR等.在众多的方法中,经常存在由通用引物引起的单引物非特异扩增现象.本文综述了连接介导的PCR-Walking中单引物扩增的形成原理及克服方法.克服单引物扩增主要是使接头引物在DNA两端的接头上只有1个结合位点,从而避开单引物扩增.常用的方法有3′端加氨基修饰的不对称接头、泡泡状接头或Y字型接头及单寡核苷酸接头等方法.还介绍了2种利用通用引物非特异扩增克隆目的序列的方法:引物错配法及基于RAPD原理的单引物PCR法.     

一种改良的启动子序列克隆的染色体步查法

利用染色体步行法,从已知DNA序列克隆侧翼未知序列是非常有效的方法之一,但由于所选用的特定限制性内切酶对目标基因组不能酶解成合适大小的片段,因而受PCR扩增能力的局限,往往扩增不出有效产物. 针对这一点,这里我们介绍一种简单有效的改良方法,它包括以下步骤：首先用不同的限制性内切酶(包括平末端和粘性末端) 酶解目标基因组DNA,接着,选择能将基因组酶切成弥散、分布均匀的限制性内切酶,如DraⅠ和HindⅢ,合成相对应的接头;然后,选择弥散的、分布均匀的限制性内切酶的酶解产物,构建成含相应接头的基因组DNA文库,用作PCR的模板;最后,用接头引物和特异引物,通过巢式PCR扩增目的片段,获得了理想的扩增效果.采用改进后的染色体步查法,有效地从较复杂的棉花核DNA中克隆出6个棉花启动子序列.     

聚合酶链反应（PCR）对未知序列DNA的扩增技术

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)是由引物介导,在体外将特异性DNA序列利用酶促作用进行扩增的方法。双链DNA热变性,然后在低温下与引物退火,再在中等温度下进行延伸,三步为一循环。一般经30～35次循环,很容易将目的基因或DNA片段特异地扩增至少10~6～10~7倍。它已是分子生物学研究中常用的、不可缺少的一项基本技术。但常规PCR需在待扩增的已知序列两端分别设计两个寡核苷酸引物,也就     

利用多模板Y形接头延伸法进行相邻序列的连续扩增

Y形接头延伸法(Y-shaped adaptor dependent extension,YADE)是一种扩增已知DNA片段相邻序列的方法,但其效率常受到已知序列周围酶切位点数目的限制。在Y形接头延伸中采用由多种酶切和连接产生的DNA作模板,大大提高了该方法扩增相邻序列的效率,实现了相邻序列的连续扩增。利用该方法通过2轮连续的扩增从7种酶切连接产物中成功地获得了1个棉花小GTP酶基因(GhRacB)的2228bp上游序列。结果表明,多模板Y形接头延伸法是一种从复杂基因组中扩增相邻序列的有用方法。     

利用SADF法进行家蚕基因组DNA多态性分析

从家蚕品种C108和大造后部丝腺提取的基因组DNA,用PstⅠ酶解后与自己设计的人工接头相连,并用与人工接头序列相匹配的选择性引物进行选择性PCR扩增(selective amplification).扩增产物经琼脂糖电泳检测显示,用SADF法在两品种中能检测到稳定的DNA多态性片段.     

复合PCR扩增人mtDNA HVR方法的初探

目的:建立一种高效的扩增线粒体DNA高可变区(mtDNA HVR)的方法.方法:本研究选取5例健康成人静脉血,用人血全基因组DNA试剂盒,提取全基因组DNA,设计引物,用复合PCR方式,对线粒体DNA中的高可变区进行扩增.复合扩增的方式为:用6对套叠引物分开进行两次独立的PCR,扩增mtDNA HVR.第一次扩增用3对引物,目标DNA片段基本涵盖整个线粒体DNA的高可变区,扩增后得到互不重叠的3个短片段,分别为113 bp,126 bp和131bp.第二次复合扩增用其余的3对引物,目标片段基本重叠在第一次扩增所得的目标片段的区域内,扩增得到3个互不重叠的片段为124 bp,133 bp和93bp.所有扩增产物经过纯化后测序.结果:复合PCR方式获得的mtDNA HVR基因序列完整,5个样本均出现特异性条带,电泳结果条带单一、清晰.结论:复合扩增PCR方法对mtDNA HVR区的扩增效率高,测序结果稳定,结合6对套叠引物,不但保证了序列的完整性,另外,两次独立的PCR也减少了PCR反应过程中错配的发生,此法也适用于保存时间较久的古代线粒体DNA短片段的研究.复合扩增PCR还展示出了潜在的高产量的特点,相对传统PCR显示了其更多的优势.     

基因标记、转化、表达与检测

再于72℃下放置2.5分钟;用2种BLB引物对共扩增时,94℃1分钟(第一次循环3.5粉爹钟),在65922074利用pCR检测牛淋巴瘤中的牛白血病病那〔英〕/Rasmussen,H.B.…了Bioteeh。ForumEur一2991,s(9)一527~519〔译自DBA,1901,10(23),91一13308〕 利用聚合酶链反应(PCR)从含30只雌牛淋巴瘤样品的材料中将由牛白血病病毒(BLV)引起的肿瘤与其它病因的肿瘤区分开。设计了两种扩增DNA BLV一专性片段的引物对,还设计了第三种识别牛K一酪蛋白基因启动子区的引物对,以控制模板的质量。利用Taq DNA一聚合酶扩增DNA(0 .25件g),条件如下:用1种BLV…     

长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片断的侧翼序列

为解决传统反向PCR技术扩增片段短、假阳性多的不足,建立了长距离反向PCR(LD I-PCR)扩增技术:0.5μg DNA/mL的反应体系使DNA酶解片段充分自身环化连接,其产物用25 nt~30 nt的序列特异引物进行长距离PCR。结果表明该方法能特异地扩增出长达16 kb的序列,在已知DNA片段的侧翼序列克隆方面具有高效、简便、特异的优点。     

动物遗传工程

923441利用PCR快速而生物学安全性地诊断非洲猪疽病毒〔英〕/Steiger,Y.…了J.Clin。Mierobiol。-1992,30(1)一i~s[译自DBA,1992,11 (5),92一02463〕 部分定序了非洲猪瘟病毒(ASFV)基因组保守区的740bp片段,设计并合成了4个PCR引物和1个寡核节酸DNA探针。利用寡核昔酸1和6为DNA引物、并利用来白下述样品的模板扩增了专性64obp PCR产物:受ASFV侵染的猪的器官和血浆;ASFV侵染的细胞培养物,含与原74obp克隆相同保守区的克隆的DNtA片段。对照无特殊反应产物。通过用巢状引物二次扩增或与专性生物素化寡核昔酸探针杂交确定PCR产…     

TAIL-PCR技术及其在植物基因中的克隆

热不对称性PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)是一种用来分离与已知序列邻近的未知DNA序列的分子生物学技术.该技术利用3个根据已知序列设计的嵌套特异性引物分别和简并引物组合进行PCR反应,选择恰当退火温度对目标片段进行PCR扩增.TAIL-PCR技术作为一种使用技术简单易行,反应高效灵敏,产物特异性高,重复性好,能够在较短的时间内获得目标片段,已经在分子生物学研究领域广泛应用.本文从TAIL-PCR技术原理出发,对该技术特异性引物设计、随机引物组合选择、PCR反应条件等关键性问题进行综述,并介绍TAIL-PCR技术在植物基因克隆上的应用现状及发展前景.     

SRFA法构建水稻DNA指纹图谱

水稻基因组DNA用PstⅠ酶切同时与人工接头连接后,使用选择性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测所构建的水稻DNA指纹图谱。结果表明在JX17和ZYQ8间以及5种野生稻间均存在DNA多态性片段。     

RFA法构建水稻DNA指纹图谱

水稻基因组DNA用Psf I酶切同时与人工接头连接后,使用选择性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测所构建的水稻DNA指纹图谱。结果表明在JXl7和ZYQ8问以及5种野生稻间均存在DNA多态性片段。     

大麻性别的RAPD和SCAR分子标记

利用随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)技术获得与大麻性别连锁的分子标记.将10株雄性大麻或10株雌性大麻的单个DNA样品等量混合分别组成雄性或雌性DNA池(DNApool),以提供具有相同遗传背景的雌、雄性DNA样品.每个随机引物分别用三个不同的循环程序进行PCR扩增.在30个随机引物中,用引物401扩增得到一条约2.5kb雄性多态性片段.对该片段进行了克隆和序列分析,并根据序列分析结果将上述RAPD分子标记转化为重复性和特异性更好的SCAR(sequencecharacterizedamplifiedregions)分子标记.     

DNA分析与扩增

930026大于1 0kb的DNA片段的离体扩增[英";/Kainz,P.…,Ana|.Bioehem.-1992,202(1).一46～49C译自DBA,1992,11(13),92~07224] 从九噬菌体模板合成10.9kb DNA片段,以扩大PCR范围。采用已发表的引物序列和条件时,应用AmpIiTaq和1人J,l三的Taq DNA聚合酶进行扩增的结果不他,ifli应用TLlb DNA聚合酶根本不能扩增这一片段。因此,采用Tub酶和二步PCR扩增方法(65℃进行退火和延伸,然后在9CC变性1.5分钟),获得了可靠的结果。酶浓度降到0.4U/50芦l,延伸时间减到4～12分钟(最优为8分钟)时,目标片段可被特异地扩增。若延长到20分钟以上,…     

绵羊胚胎性别鉴定试剂盒的研究

根据绵羊Y-染色体的特异序列和常染色序列分别设计了确定公羊Y-染色体特异序列的3对特异性引物和内标基因的4对特异性引物。单重PCR扩增绵羊基因组DNA,筛选出了3对Y-染色体特异引物和3对羊DNA特异内标引物。将不同的绵羊Y-染色体特异引物与内标引物组合,利用多重PCR扩增绵羊基因组DNA,筛选出了1个可用于羊早期胚胎性别鉴定的PCR引物组合:A0/C1。按照最优PCR扩增DNA条件配制了绵羊PCR性别鉴定试剂盒并成功应用于绵羊血液、已知性别的绵羊成纤维细胞和胚胎,表明本研究建立的体系完全可用于绵羊早期的胚胎性别鉴定。     

从水稻Ac/Ds插入突变体扩增Ds侧翼序列的最适TAIL-PCR引物

温度非对称交互PCR(TAIL PCR)技术已广泛应用于从多种生物体系克隆侧翼于已知序列的DNA片段的分子操作中 ,并极大地促进了反向遗传学研究。但是 ,可能由于不同物种间基因组大小和序列存在显著差异 ,在采用该技术进行转座元件Ds水稻插入突变体鉴定过程中 ,常因TAIL PCR反应的稳定性差而影响突变体筛选效率。有鉴于此 ,根据Ds核苷酸序列设计了分别对应或互补于Ds插入元件两端长度不同的 12个特异引物组成 32个组合 ,在大量预试验基础上与 6个不同简并性 (32～256 )的随机简并引物分别组合进行TAIL PCR反应 ,较系统地研究了引物特性对以水稻基因组DNA为模板的TAIL PCR反应效率的影响。结果发现 ,第一反应采用长序列特异引物(36～ 4 0mer)可显著提高扩增特异性 ,随机简并引物的简并度对反应的影响显著。还选择出两个适于从水稻Ds插入突变体基因组高效扩增出Ds插入侧翼片段的最优特异引物组合和最适简并引物。应用本研究结果可显著地提高TAIL PCR技术筛选水稻插入突变体的效率     

RAPD分子标记在园艺植物遗传学研究中的应用

1971年Khorana等提出多聚链式反应 (PolymeraseChainRe action ,PCR)的基本概念之后 ,1985年Saiki等阐述了具体原理和作法 ,并在 1988年从细菌中发现了热稳定性的TaqDNA聚合酶 ,从而实现了PCR反应的自动化。在PCR技术的基础上 ,Williams等[1 ] 1990年采用随机核苷酸序列为引物扩增基因组DNA的随机片段 ,产生了一种新的分子标记———随机扩增多态性DNA (RandomAmplifiedPolymorphicDNA) ,简称RAPD ,即以一个寡聚核苷酸序列 (通常为 10碱基 )为引物 ,对基因组DNA随机扩增 ,从而得到多态性图谱作为遗传标记的方法。同年Welsh…     

双退火温度PCR扩增DNA

【目的】与设置单一退火温度的常规PCR(S-T_m PCR)不同,本研究探讨双退火温度PCR(D-T_m PCR)由高到低设置2条引物各自退火温度。【方法】以PxF61和VPel为正/反向引物,用Q5 DNA聚合酶扩增4.3 kb的模式DNA pET20b-Xyn(黑曲霉木聚糖酶基因)。PCR程序为:98°C预变性3 min,30次循环{98°C变性30 s,设置双退火[T_(m1) 70°C(Px F61)退火15 s、T_(m2) 62°C(VPel)退火15 s],72°C延伸130 s}。【结果】与S-T_m PCR(61°C)相比,D-T_m PCR扩增4.3 kb的目的条带亮度更高,减少2条杂带;经25次循环目的 DNA产物量最高。D-T_m PCR用于长片段引物扩增5.3 kb重组质粒DNA条带更明显。【结论】D-T_m PCR直接扩增目的条带,避免了探讨T_m的麻烦,不要求2条引物T_m相近,从理论上更加清晰地认识引物与各自模板分步退火过程。