长梗木霉内切葡聚糖酶I基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

一株纤维素酶高产菌株经ITS序列鉴定并命名为长梗木霉SSL (Trichoderma longibrachiatum, SSL)。利用RT-PCR的方法从该菌株中克隆出内切-1-4-β-D-葡聚糖酶I的基因 (eg1), 该基因全长1386 bp, 编码461个氨基酸。序列分析表明：该基因序列与T. longibrachiatum egl1基因具有90％以上的同源性。将该基因的成熟肽编码序列插入到Pichia pastoris表达载体ppic9k中, 构建重组表达质粒ppic9k-eg1, 转化P. pa     

特异腐质霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

【目的】在毕赤酵母中表达特异腐质霉Humicola insolens的中性内切葡聚糖酶Ⅱ,并对其性质加以研究。【方法】利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicola insolens)NC3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因(egⅡ)的cDNA。将其插入表达载体pPIC9K,重组质粒经线性化后电击转化毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株GS115。【结果】SDS-PAGE和酶活的检测结果均表明:egⅡ基因在毕赤酵母中成功表达。重组酶的部分酶学性质研究表明,该酶的最适反应温度为70°C,且在65°C以下具有较好的热稳定性。最适反应pH为6.5,在pH 6.0?7.0之间有较好的稳定性。【结论】用重组毕赤酵母可高效表达外源中性内切葡聚糖酶,为其今后在工业应用奠定了基础。     

特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达

利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉（Humicola insolerts）H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母（Pichia pastoris）菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ（EGⅣ）在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中的表达。采用RT—PCR的方法从里氏木霉（Trichoderma reesei）中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris—EGⅣ1。在甲醇诱导下,重组菌株P.pastoris-EGⅣ1可以合成并分泌EGⅣ,培养液的CMC活力达到2．11U／mL。     

毕赤酵母中植酸酶和内切葡聚糖酶共表达菌株的构建及其高效表达(英文)

植酸酶和内切葡萄糖苷酶广泛应用于动物饲料添加剂中,能更有效地帮助饲料的利用,同时为动物的生命活动提供必需的重要物质。首先构建重组质粒pPICZα-EG,经过线性化后,电转化到含有植酸酶phyA基因的毕赤酵母感受态细胞中,构成含有植酸酶基因和内切葡萄糖苷酶基因的重组体菌株GS115-phyA-EG。经甲醇诱导后其活性分别达到出发菌株GS115-phyA和GS115-EG的39.4%和56.2%。酶学性质的分析显示,最适反应温度和最适反应的pH值分别为55℃和5.5,植酸酶和内切葡萄糖苷酶在温度为45℃~55℃,pH值为4.5~5.5时,酶活相对稳定,均能达到最高酶活的80%以上。结果表明这种在同一个系统种同时表达2种酶的方法能更好地节约时间和成本,使其在饲料工业的应用上有更广阔的前景。     

内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌与毕赤酵母中的表达

根据绿色木霉(Trichoderma viride)WL 0422菌株内切葡聚糖酶基因egⅡ的cDNA序列,设计特异引物,以重组质粒pTG19-T-egⅡ为模板,扩增得到全长1 194bp的egⅡ成熟肽cDNA片段.将该片段分别克隆到大肠杆菌(Escherichia coil)表达载体pET-28a( )和毕赤酵母(Pichia pastoris)表达载体pPIC9K中,并在大肠杆菌Rosset(DE3)和毕赤酵母GS115中进行了表达.重组大肠杆菌表达蛋白占菌体总蛋白的15%,表达产物无内切葡聚糖酶活性.重组毕赤酵母经甲醇诱导实现了分泌表达,在摇床水平上酶活性达到2 788U/ml.酶学性质分析表明,该酶作用的最适pH为4.5,pH 3.5～6.0范围内酶活性保留在80%以上;最适温度为50℃,55℃以下酶的稳定性在90%以上.     

康氏木霉内切葡聚糖酶(EGⅠ)基因的克隆及表达

目的：构建纤维素酶EGⅠ原核表达载体,并对表达产物进行初步酶学性质研究。方法：以康氏木霉的总RNA为模板,利用RT-PCR扩增内切葡聚糖酶EGⅠ,重组到T7启动子控制下的质粒pET.His中,构建重组质粒pET.His-EGⅠ,并将其转化至E.coli BL21（DE3）plysS感受态细胞中,经0.4mmol/L的IPTG诱导表达后对其表达产物进行13%SDS-PAGE分析。结果：SDS-PAGE电泳显示EGⅠ在大肠杆菌中得到了与预期目的蛋白相一致的外源蛋白带,分子量约45kDa。初步研究表明：重组蛋白具有内切葡聚糖酶活性,最适pH为6.0,温度在30℃～40℃时酶活稳定,金属离子Mn2＋对酶活力有明显的促进作用。结论：纤维素酶EGⅠ在大肠杆菌中成功表达,具有一定活性。     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶基因在工业啤酒酵母中的整合和表达

用PCR合成的瑞氏木霉（T.reesei）β-内切葡聚糖酶Ⅰ（EGⅠ）的cDNA, 构建了由酵母醇脱氢酶 （ADH1）启动子和终止子引导表达、β-内切葡聚糖酶自身信号肽序列引导分泌、由酵母rDNA序列引导同源整合的酵母YIP型β-内切葡聚糖酶表达分泌质粒pA15PET。采用pA15PET与酵母YEP型G418抗性表达质粒的共转化,将EGⅠ表达单元整合到已整合有α-乙酰乳酸脱羧酶（α-ALDC）表达单元的啤酒酵母工程菌BE9711的染色体rDNA序列中,获得同时表达胞内α-ALDC和胞外β-内切葡聚糖酶的啤酒酵母工程菌。     

特异腐质霉中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因的克隆及表达*

利用RT-PCR的方法,以特异腐质霉(Humicolainsolens)H31-3总RNA为模板,克隆到中性内切葡聚糖酶Ⅱ基因egl2的cDNA,将其插入到表达载体pGAPZαA中,重组质粒经线性化,电击转化毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株GS115,筛选到分泌表达重组EGⅡ的毕赤酵母工程菌株。SDS-PAGE检测结果表明,重组EGⅡ在酵母中得到了特异性表达,表达产物的表观分子量约为55kD,同时对工程菌株的发酵条件和重组EGⅡ的性质进行了初步研究。     

斜卧青霉L-06内切葡聚糖酶Ⅰ基因的克隆与表达

【目的】克隆斜卧青霉L-06的内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egI),并实现其在大肠杆菌内的高效表达。【方法】利用RT-PCR技术克隆了斜卧青霉L-06的内切葡聚糖酶Ⅰ基因(egI),并将egI基因克隆到原核表达载体中,构建了重组质粒pET32a-egI。【结果】转化至大肠埃希菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE检测结果表明:重组表达产物的相对分子质量约为80 kD,与预期相符。重组表达的菌悬液,经破碎离心,取其上清液,进行纤维素酶活性染色,获得了活性条带。DNS法测得内切酶活力为2.56 IU/mL。【结论】构建了斜卧青霉L-06内切葡聚糖酶Ⅰ的原核表达系统。     

里氏木霉内切葡萄糖苷酶Ⅳ在毕赤酵母中的表达*

进行了内切葡萄糖苷酶Ⅳ(EGⅣ)在毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统中的表达。采用RT-PCR的方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)中分离到eg4基因。将eg4基因与毕赤酵母表达载体pPICZαA连接,得到重组质粒pPICZαA-eg4。将该重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,eg4基因通过同源重组被整合到毕赤酵母的染色体上,并处于酵母α因子的下游,得到重组菌株P.pastoris-EGⅣ1。在甲醇     

瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ基因的克隆及在酿酒酵母中的表达

采用刚果红染色法从瑞氏木霉cDNA文库中分离到一株具有CMCase活性的阳性克隆 ,测序结果显示该基因所编码的蛋白质为瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅲ (EGⅢ )。对重组酿酒酵母所产生的EGⅢ进行了酶学性质分析 ,其最适pH为 5 0 ,最适温度为 60℃。检测了酿酒酵母蛋白质分泌系统组分SSO2和SEB1对EGⅢ分泌的影响。结果表明 ,在可过量表达蛋白质分泌系统组分SSO2的酿酒酵母H837中 ,EGⅢ的分泌量最高。由此分析 ,酿酒酵母SSO2蛋白可能在EGⅢ的分泌中 ,是一个限速步骤。通过PCR方法删除EGⅢ基因 5′端非翻译区的 98bp核苷酸序列使EGⅢ表达量提高了 5 3倍。这提示我们 ,瑞氏木霉的EGⅢ基因在酿酒酵母细胞中表达时 ,其mRNA 5′端先导序列中可能存在影响该基因表达水平的调控序列。     

长梗木霉β-葡萄糖苷酶基因的克隆及表达

【目的】以实验室筛选获得的一株长梗木霉GM2(Trichoderma longibrachiatum)为材料,克隆出其β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidase)基因bgl并在大肠杆菌和酵母中进行表达。【方法】利用同源克隆扩增出其β-葡萄糖苷酶基因bgl全长序列,分别亚克隆到质粒pET-32a(+)和pPICZα-B中,构建其原核表达载体pET32a(+)-bglI和真核表达载体pPICZα-B-bgl。【结果】bgl基因序列全长2 369 bp,含两个内含子,编码744个氨基酸。在大肠杆菌BL21(DE3)中表达bgl,重组蛋白以包涵体形式存在,上清液中没有β-葡萄糖苷酶的酶活。将载体pPICZα-B-bgl电转化入毕赤酵母GS115,得到78 kD左右重组蛋白,与预测大小相符。按9%接种量接入50 mL YP培养基(初始pH 5.5),30°C振荡培养96 h,添加终浓度1%的甲醇诱导后β-葡萄糖苷酶酶活达60 U/mL。重组酶bgl催化水杨苷水解反应的最适pH为5.0,最适温度为70°C;另外,此bgl在pH 3.0 10.0和40°C 60°C范围内具有比较好的稳定性。【结论】长梗木霉GM2的β-葡萄糖苷酶在P.pastoris中获得可溶性表达,并证明有一定的活性。     

里氏木霉内切-β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达

采用PCR方法从里氏木霉(Trichoderma reesei)基因组中获得含有两个内含子的内切-β-甘露聚糖酶全长基因,末端重叠延伸PCR去除内含子后,将其插入到巴斯德毕赤酵母(Picher pastoris)表达载体pPIC9K中,位于α-因子信号肽序列的下游,并与之同框,获得重组质粒pM242。重组质粒线性化后用电击法转化毕赤酵母菌株GS115。经大量筛选,获得高效分泌表达内切甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株Gpmf25。摇瓶发酵结果表明,培养基中甘露聚糖酶的活力可达12.5IU/mL。重组酶最适pH和最适反应温度分别为5.0和80℃,在pH5.0～6.0时酶活稳定,在pH5.4时70℃保温30min酶活维持50％以上。     

枯草杆菌内切葡聚糖酶基因的克隆及表达

以质粒Ｐｕｃ１８为载体,从枯草杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＤＢ１０４基因组中克隆到一个内切葡聚糖酶基因。限制酶切分析表明重组质粒中的插入片段为３.５ｋｂ,其中各含有一个ＥｃｏＲＩ,ＨｉｎｄⅢ和ＰｖｕⅡ位点。该插入片段含有一完整的内切葡聚糖酶基因,其自身启动子能被大肠杆菌转录系统所识别。当加入ｌａｃＺα基因启动子的诱导物ＩＰＴＧ后,内切葡聚糖酶表达量提高２.８倍。加入０.５％葡萄糖能抑制该基因的表达。该基因在大肠杆菌ＤＨ５αＦ′中表达的内切葡聚糖酶分布为：胞外６７.３％,胞间周质３.９％,胞内２８.８％。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实了该插入片段来自供体菌Ｂ．ＳｕｂｔｉｌｉｓＤＢ１０４。     

黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

【目的】以毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71为宿主菌表达黑曲霉（Aspergillus niger）SG136 α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）。【方法】以实验室保藏的A. niger SG136总DNA为模板,根据NCBI 数据库中A. niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶的cDNA序列（aglu）设计引物,通过PCR和重叠延伸PCR（overlap-PCR）方法,扩增得到aglu,将其克隆到载体pMD18-T simple vector,测序结果表明,aglu编码960个氨基酸。与A. niger CBS 513.88 α-葡萄糖苷酶相比仅有一个氨基酸的差异。将得到的aglu亚克隆到质粒pPIC9K,构建表达载体pPIC9K-aglu,经Bgl Ⅱ线性化后电转化P. pastoris KM71,经过MD、YPD/G418平板筛选表型,PCR方法验证,获得分泌表达重组P. pastoris KM71/pPIC9K-aglu。摇瓶培养中通过添加终浓度为1 %的甲醇诱导α-葡萄糖苷酶的分泌。【结果】SDS-PAGE显示表达蛋白的大小亚基分子量分别为98 kDa和33 kDa,阴性对照中没有出现此条带,非变性电泳检验为一条带。制备的粗酶液的酶学性质表明,转苷反应最适pH为5,最适温度为55 ℃。在最适pH和温度下,反应24 h时低聚异麦芽糖的总含量达到最大为26.0 %。【结论】黑曲霉α-葡萄糖苷酶在P. pastoris中获得可溶性表达,并证明有一定的转糖苷活性。     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

金针菇漆酶基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达研究

综合运用cDNA末端快速扩增 (RapidAmplificationofcDNAEnds ,RACE )和基因组步行等技术克隆到一个金针菇 (Flammulinavelutipes)的漆酶结构基因和其对应的全长cDNA ,经测序和BLAST比对分析表明该基因属于多铜氧化酶基因家族 ,与已发表的漆酶基因 (AF176 2 30 )的同源性最高 ,在氨基酸水平为 72 %。该结构基因命名为gl ccFv,cDNA命名为lccFv ,其序列提交GenBank ,登录号分别为AY4 85 82 6和AY4 5 0 4 0 6。将lccFv的开放阅读框克隆到毕赤酵母表达载体pHBM90 6 ,转化毕赤酵母GS115且实现了分泌表达。将重组毕赤酵母GS115 (pHBM5 6 5 )诱导产酶 ,在培养温度 2 0℃、甲醇流加量为 1 0 % (V V)的情况下 ,其分泌表达的LCCFv的最高酶活为 0 10 70U mL ,最适反应温度为 4 5℃ ,最适反应pH值为 3 9,在最适反应条件下其热稳定性和pH值稳定性均较好     

中性内切型纤维素酶在毕赤酵母中高水平表达的研究

中性内切型纤维素酶在纺织及造纸工业具有重要的应用,为了进一步提高从我国草菇中克隆的一种新的中性内切型纤维素酶(EG1)在Pichiapastoris中的表达水平,我们进行了提高基因拷贝数及高密度发酵等多种手段实现其高水平表达的研究。在前期研究的基础上,利用对已整合eg1的重组子再转化的方法,从含有2000μgLZeocin的YPDSZ平板上筛选到高抗Zeocin转化子,在摇瓶培养条件下,该转化子表达量比原来提高了3.8倍,在pH4～8条件下均有稳定表达,接种量(OD600=5.0)表达水平最好,提高甲醇的诱导浓度对表达有显著的促进作用。用3.2L发酵罐进行了高密度发酵,甲醇诱导95.5h后达到最高值,比摇瓶培养再提高了6.4倍,因此利用高抗Zeocin转化子及高密度发酵的手段,使EG1的表达水平提高了34倍,蛋白表达量达8.80mgmL,EG1酶活达到543.36IUmL,实现了中性内切纤维素酶的高水平表达,本研究将大大促进建立我国纺织用纤维素酶大规模高效生产技术。     

glyA基因的克隆及其在毕赤酵母中的表达

根据已知的序列设计引物,以大肠杆菌XL10-Gold总DNA为模板进行梯度PCR,并进行DNA序列测定,其序列与已经报道的glyA基因完全一致。将其克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pHBM905C上,获得表达质粒pHBM1001.该质粒转化毕赤酵母GS115所得重组子经PCR验证后成功进行了诱导表达,并初步测定了酶活力。