不同年龄鼠骨髓干细胞移植治疗心梗后心衰的实验研究

目的：通过对比观察不同年龄鼠骨髓干细胞在体外的生长状态和移入受损心肌后对心肌梗死大鼠心功能的影响,说明年龄对骨髓干细胞的增殖能力和对移植效果的影响。方法：分别分离培养3日龄,1月龄,6月龄,12月龄Wister雄鼠骨髓干细胞,观察细胞生长状态,描记生长曲线。将60只大鼠用结扎冠状动脉前降支的方法制成心肌梗死模型后两周,随机分为三组：Ⅰ组：3日龄组（n=20只）：给予3日龄的5-溴脱氧尿嘧啶（Brdu）标记的鼠骨髓干细胞;Ⅱ组：6月龄组（n=20只）：给予6月龄的Brdu标记的鼠骨髓干细胞;Ⅲ组：对照组（n=20只）：给予培养液。各组均于治疗前及治疗后4周进行心脏超声检查评价心功能改善情况。处死动物取出心脏,进行直接测量后取左心室作石蜡切片,行苏木素-伊红（HE）染色及免疫组化检测,鉴定植入的细胞和心肌、毛细血管再生情况。结果：不同年龄鼠骨髓干细胞培养结果示3日龄及1月龄组增殖能力均高于6月龄及12月龄组,但3日龄与1月龄组之间无统计学差异,12月龄组在原代培养后期即死亡。治疗前超声心动图显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组心功能无显著差异（P〉0.05）,治疗之后四周超声心动图检查结果示：Ⅰ、Ⅱ组LVEF、FS、IVST、LVPW和LVESD较治疗前均有明显提高,且显著高于Ⅲ组;Ⅰ组LVEF、FS、IVST、LVPWs和LVESD又明显高于Ⅱ组;Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组LVEDD与治疗前比较无统计学意义。心脏直测结果显示Ⅰ、Ⅱ组的Wh、Wh、Wb、L、I度均较第Ⅲ组有所增加,其中Ⅰ组又明显高于Ⅱ组。免疫组化结果显示：Ⅰ、Ⅱ组于梗死周边均发现Brdu（＋）细胞存在,心肌特异性抗体阳性,且Ⅰ组阳性率明显高于Ⅱ组。毛细血管密度检测结果显示Ⅰ组毛细血管增生情况明显优于Ⅱ组。结论：不同年龄鼠骨髓干细胞的体外增殖能力不同,年龄越小,增殖能力越强。骨髓干细胞移植可以改善心肌梗死后大鼠的心脏功能,增加梗死区毛细血管密度,抑制心室重构,且年龄与移植效果成反比。     

骨髓基质干细胞向心肌细胞诱导分化的实验研究

目的探讨大鼠骨髓基质干细胞在体外和体内向心肌细胞诱导分化的能力,为下一步的细胞移植治疗心肌梗死提供实验基础.方法体外诱导实验中,将不同浓度的5-氮胞苷作用于不同培养时间的骨髓基质干细胞,摸索5-氮胞苷的最佳诱导时机和浓度,观察诱导后细胞形态变化,并用免疫细胞化学染色检测心肌特异性肌钙蛋白T的表达;在体内实验中,培养扩增的骨髓基质干细胞经BrdU标记后,自体移植于正常心肌内,分别通过BrdU和心肌特异性肌钙蛋白T免疫组织化学染色检测移植细胞的存活和分化情况.结果体外诱导实验中,5-氮胞苷的诱导作用以10μmol/L的浓度对传代细胞进行两次诱导,效果最好,不仅能诱导出表达心肌特异蛋白的心肌样细胞,而且这些细胞在体外能够自发搏动.体内诱导实验中,移植的细胞在正常心肌微环境中能够存活并分化为心肌细胞.结论骨髓基质干细胞在体外化学诱导和体内心肌微环境诱导时均能分化为心肌细胞,可用于细胞移植治疗心肌梗死的实验.     

骨髓单个核细胞移植对大鼠溃疡性结肠炎的作用

目的:探讨同种异体骨髓单个核细胞(BM-MNCs)移植大鼠溃疡性结肠炎模型的作用。方法:将DAPI标记的同种异体大鼠骨髓单个核细胞(BM-MNCs)经尾静脉注射移植到大鼠溃疡性结肠炎(UC)模型体内(模型组),以尾静脉注射等量PBS的UC大鼠作为对照组。光镜观察大鼠结肠组织病变改变,荧光显微镜观察标记DAPI的BM-MNCs在结肠组织中的定植及分布情况,免疫荧光检测BM-MNCs中CK19、CD34的表达情况。结果:移植组大鼠结肠组织可见新生黏膜上皮及腺体,黏膜下有新鲜至成熟肉芽组织生成,明显优于对照组;移植14天,大鼠结肠组织中可观察到DAPI标记的BM-MNCs细胞;DAPI标记的细胞可表达血管内皮细胞特异性表达蛋白CD34或黏膜上皮细胞特异性表达蛋白CK19。结论:BM-MNCs可向受损病变部位结肠组织迁移和定植,且分化为血管内皮细胞和黏膜上皮细胞。     

重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染骨髓间充质干细胞移植治疗心衰大鼠的实验研究

目的:重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)并植入心衰大鼠心肌,观察其心功能的变化.方法:采用部分缩窄腹主动脉法制备大鼠压力超负荷性慢性心力衰竭模型.分离和培养成年大鼠BMSCs,待细胞传代到第6代,用重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染BMSCs48h后将BMSCs移植入心衰大鼠心肌内.实验共分3组:心衰组、移植BMSCs组及移植转染Ad5-ADRbeta2-EGFP的BMSCs组.移植BMSCs(1×104)4周后,检测大鼠血流动力学各指标的变化.结果:荧光显微镜下可见转染BMSCs绿色荧光蛋白表达达到80%以上.移植BMSCs组和移植转染Ad5-ADRbeta2-EGFP的BMSCs组的左心室舒张末压力(LVEDP)低于心衰组,左心室内压变化最大速率(±dp/dt max)和心率均高于心衰组,差异均有统计学意义(P<0.05).移植转染Ad5-ADRbeta2-EGFP的BMSCs组的左心室内压上升最大速率(+dp/dt)高于移植BMSCs组,差异有统计学意义(P<0.05).结论:重组腺病毒Ad5-ADRbeta2-EGFP转染BMSCs并移植入心衰大鼠后,能够改善心衰大鼠的心功能.     

胸腺内注射供体BMSCs对同种异体腹部皮瓣移植排斥的影响

目的:将供体骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)胸腺内注射(intrathymic injection,IT)至受体胸腺,探讨其对同种异体腹部皮瓣移植排斥的影响及机制。方法:全骨髓贴壁培养法培养并纯化BN大鼠BMSCs,流式细胞术对其表型进行鉴定。受体Lewis鼠随机分为A组(空白对照组)、B组(BMSCs组)、C组(60Coγ射线4Gy全身照射组)、D组(全身照射+BMSCs组),每组6只。各组大鼠第0天进行同种异体腹部皮瓣移植,A组移植前14天IT PBS,B组移植前14天IT供体BMSCs,C组移植前15天给予60Coγ射线4Gy全身照射,移植前14天IT PBS,D组除移植前15天4Gy全身照射外,移植前14天IT供体BMSCs。大体观察移植皮瓣存活情况并绘制生存曲线,排斥终点流式检测脾细胞调节性T细胞(Treg)比例变化,体外混合淋巴细胞反应检测受体脾淋巴细胞对供体抗原反应性变化。结果:全骨髓贴壁培养法能够很好培养出BMSCs,其P3代流式细胞术表型鉴定结果为CD11b/c、CD45阴性,CD29、CD90阳性。B组的移植皮瓣存活时间与A组相比无明显差异(P>0.05),而D组的移植皮瓣平均存活时间较C组延长3.4天,差异具有统计学意义(P<0.01),脾细胞Treg比例显著增高(P<0.01),脾淋巴细胞对供体抗原反应性显著降低(P<0.05)。结论:IT供体BMSCs联合60Coγ射线4Gy全身照射通过上调受体脾细胞Treg比例能有效降低受体脾淋巴细胞对供体抗原的反应性,显著延长同种异体腹部皮瓣移植物存活时间。     

BrdU体内示踪骨髓基质干细胞生物学状态的效果分析

目的:探讨5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brd U)体内示踪骨髓基质干细胞(BMSCs)生物学状态的效果。方法:抽取健康成年比格狗骨髓,在传代培养中进行Brd U标记并鉴定,体外实验中测定细胞周期、凋亡率和细胞活力;在体内实验中将标记Brd U的骨髓基质干细胞植入自体股骨头缺损处,另一侧单纯植入自体骨作为对照,记录成骨量与分子标记物的表达情况。结果:骨髓基质干细胞的Brd U体外标记率为85.2%。Brd U组的细胞凋亡率为3.62±1.33%,未标记组为3.52±1.08%;Brd U组与未标记组的细胞成活率分别为96.31±1.39%和95.20±2.10%,两组对比差异均无统计学意义(P0.05)。移植侧Brd U标记的骨髓基质干细胞免疫组化观察可见Brd U免疫组化染色阳性,阳性率为81.6%。骨髓基质干细胞移植侧缺损区的骨钙素、Ⅰ型胶原阳性细胞表达数量与强度明显高于对照侧缺损区;骨髓基质干细胞移植侧成骨量为17.46±2.12%,对照侧为9.06±1.24%,两两对比差异有统计学意义(P0.05)。结论:Brd U在体外示踪骨髓基质干细胞能有效反映细胞的生物学状态,体内示踪显示移植的骨髓基质干细胞能成活,能促进骨组织形成和坏死骨修复。     

应用犬骨髓间质干细胞作为组织工程种子细胞的实验研究

目的:将犬骨髓间质干细胞(BMSCs)分离、扩增,观察生长情况,评价其作为组织工程种子细胞的可行性.方法:采用密度梯度离心及贴壁筛选法分离犬BMSCs,培养扩增,通过免疫细胞化学方法进行鉴定,Hoechst33342标记后传代,检测细胞荧光.结果:分离的BMSCs经免疫细胞化学方法观察到SH2-ir、Vimentin.ir、a2-SMA-ir细胞,标记后细胞生长旺盛,荧光无衰减.结论:BMSCs可以作为构建组织工程的种子细胞.     

自体内皮前体细胞移植对急性心肌梗死大鼠微血管新生及心功能的影响

目的探讨外周血来源的内皮前体细胞自体移植,对大鼠急性心肌梗死后微血管新生与心功能的影响。方法抽取SD大鼠外周动脉血,应用Ficoll密度梯度离心法获取单个核细胞。应用含有VEGF和bFGF的特定培养基体外培养,得到内皮前体细胞;结扎SD大鼠冠状动脉左前降支,建立急性心肌梗死模型;然后将得到的自体内皮前体细胞植入缺血心肌局部区域。对照组动物注入细胞培养液。结果与对照组比较,细胞移植组大鼠心功能明显改善,心肌收缩力显著优于对照组;梗死心肌微血管新生更为明显。结论急性心肌梗死心肌局部移植外周血来源的自体内皮前体细胞,能够促进血管新生;对局部梗死心肌组织结构有一定的保护作用,并可在不同时点不同程度恢复心肌收缩力,显著改善心功能。     

大鼠脂肪间充质干细胞在体内向肝细胞样细胞方向的转化

目的:探讨大鼠脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)在体内向肝细胞样细胞转化的可能性.方法:将从4周龄雄性SD大鼠腹股沟分离得到的原代脂肪间充质干细胞传至第3代,用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)在体外标记后,通过门静脉注射的方法移植入由四氯化碳造成慢性肝损伤的雄鼠体内.移植术后2周处死受体雄鼠,取其肝组织.通过免疫荧光双染色的方法观察BrdU标记细胞的存在和白蛋白的表达,以确定所注入的脂肪间充质干细胞在受鼠体内向肝细胞样细胞转化的情况.结果:在经门静脉注射法进行移植的实验组SD大鼠的肝组织内检测到同时表达BrdU和白蛋白的细胞.讨论:本研究证明了脂肪间充质干细胞在体内有向肝细胞样细胞转化的可能.     

诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化研究进展

骨髓间充质干细胞(one marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是骨髓内的一类非造血干细胞,具有自我更新和多向分化的潜能。心肌细胞本身不能再生,受损伤的心肌细胞无法通过自身的增殖和分化完成修复。BMSCs在体内外不同的诱导条件下可分化为心肌细胞,应用于缺血性心脏病的治疗,是目前心肌再生治疗的理想种子细胞。本文主要从外界干预诱导、缺氧条件影响、基因转染、临床自体移植方面将近年诱导BMSCs向心肌细胞分化的研究进行综述,以期为今后临床应用BMSCs治疗心肌梗死等心脏疾病提供理论依据。