抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达及初步纯化

目的：研究抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达并初步纯化。方法：根据大肠杆菌密码子的偏好性,人工设计并合成2段核苷酸序列,退火获得PekⅡ基因;将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2中,构建成抗菌肽基因PekⅡ融合表达载体pGEX-PekⅡ,转化至大肠杆菌BL21中,用IPTG进行诱导。取超声破碎后的上清经Glutathione SepharoseTM4亲和层析得到纯化融合蛋白。结果：PCR和测序表明已获得正确PekⅡ编码基因,SDS-PAGE显示29kD处有特异性的蛋白条带出现,纯化得到的GST-PekⅡ经MALDI-TOFMS分析得出其相对分子质量为29553．03。结论：抗菌肽PekⅡ基因在大肠杆菌中的融合表达获得成功,初步纯化得到纯品。     

小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKX1原核表达载体的构建及表达

目的:构建小麦细胞分裂素氧化酶基因TaCKXI原核表达载体并进行表达,以期得到大量的His标签融合蛋白.方法:根据GenBank中的TaCKXI序列以及pET-24a载体中的多克隆位点设计引物,以含有TaCKXl编码基因的批pMD-QRCKXI重组质粒为模板,经PCR扩增得到TaCKXI基因的DNA片段.将所得的片段与pET-24a载体连接,转化DH5α大肠杆菌,筛选阳性克隆,其测序结果与原序列一致,表明原核表达载体pET-TaCKXI已构建成功.提取per-TaCKXI质粒转化到BL21(DE3)pLysS表达菌株中,经IPTG诱导后收集菌体进行SDS-PAGE电泳鉴定,并优化其表达条件.结果:在大肠杆菌中获得TaCKXI基因融合表达,主要以包涵体形式存在;融合蛋白的分子量为58.91kD;IPTG终浓度为0.5、1.0、1.5.2.0mmol/L时,诱导融合蛋白产量相差不大.选用0.5mmol/L诱导15h获得大量的融合蛋白.经用原核表达蛋白纯化试剂盒纯化,得到了单一的融合蛋白.结论:小麦TaCKXI基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为今后TaCKXI蛋白多克隆抗体的制备奠定了基础.     

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的：建立颗粒裂解肽（NKG5）的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法：采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEx-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose 4B纯化重组蛋白。结果：重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论：获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。     

大鼠CRIP2蛋白的表达和分离纯化

目的:获得大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌中表达、纯化大鼠CRIP2(cysteine-rich intestinal protein 2)蛋白。方法:从大鼠主动脉组织中提取总DNA,RT-PCR扩增出相应大小的crip2 DNA片段,与pGEM-T-easy载体连接后测序;将测序正确的crip2按照BamHⅠ和HindⅢ酶切位点克隆入原核表达载体pRSET A,将连接产物转化大肠杆菌BL21,挑出阳性克隆,IPTG诱导表达重组的6×His融合蛋白,通过镍柱进行纯化。结果:PCR获得的crip2序列与GenBank报道的一致(为707 bp);重组融合蛋白在大肠杆菌BL21中以可溶形式高效表达,经SDS-PAGE和Western印迹分析,在相对分子质量为27×103处有特异的蛋白条带,经镍柱纯化后,得到了高纯度的CRIP2融合蛋白。结论:克隆了大鼠crip2基因片段,并在大肠杆菌BL21中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度的CRIP2融合蛋白。     

天蚕素A-蜂毒素杂合肽用pBV220载体的表达、纯化和活性测定

为提高抗菌肽的表达,在抗菌肽的N端融合了1段酸性小肽以中和表达产物对宿主的毒性;并将融合肽基因同向串连成多拷贝,在大肠杆菌中获得了较高的表达。用化学合成法分别合成了编码天蚕素A(1-8)-蜂毒素(1-10)杂合肽和酸性小肽的DNA片段,首先将其拼接成融合肽的完整基因,然后通过前后接头将融合肽基因连接成两侧具有EcoRI和SalI酶切位点的同向串连的多拷贝基因。将5份拷贝的基因克隆至pBV220表达载体,转化E.coliDH5α,温度诱导得到表达量为35%的融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式存在,将包涵体溶解,经Ni²⁺-NTA琼脂糖亲和层析获得纯化的融合蛋白。融合蛋白再经CNBr切割和阳离子交换层析,得到纯化的抗菌肽,经蛋白质N端测序确认序列正确。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。     

拟南芥SHORT-ROOT基因稀有密码子分析及其在原核细胞中的表达和纯化

目的:在大肠杆菌中重组表达拟南芥SHORT-ROOT(SHR)蛋白并纯化。方法:将SHR基因编码区克隆至p GEX-4T-2表达载体,构建重组质粒p GEX-4T-2-SHR并转化大肠杆菌Rosetta(DE3),表达产物经谷胱甘肽亲和层析凝胶4B分离纯化,SDS-PAGE分析和Western印迹鉴定。结果:SHR融合蛋白在大肠杆菌Rosetta(DE3)中获得表达,亲和纯化后,SDS-PAGE显示相对分子质量为预期的86×103,且经Western印迹确证。结论:获得了拟南芥SHR融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

死亡肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将人工合成的寡核苷酸片段,通过PCR扩增得到死亡肽（thanatin）基因,并将其克隆到表达载体pGEX-3X中,序列分析结果正确。经IPTG诱导,在大肠杆菌BL21中进行高效可溶性表达,表达量可达20%以上。融合蛋白通过GST亲和层析纯化,用肠激酶酶解表达产物,用Sephadex G-25初步纯化得到具有抗菌活性的死亡肽。     

家蝇防御素在大肠杆菌中的表达、纯化与抗体制备

家蝇防御素是从家蝇中克隆得到的1种抗菌肽。为了进一步研究家蝇防御素的功能和制备特异性抗体,采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法, 进行了家蝇防御素原核表达的研究。根据克隆到的家蝇防御素基因(Mdde) 的cDNA序列, 设计特异性引物, PCR 扩增成熟肽的cDNA片段, 将成熟肽序列重组到表达载体pGEX 4T 1中, 构建m Mdde/pGEX 4T 1重组表达载体, 在大肠杆菌BL21 中诱导表达, 重组表达的融合蛋白GST Mdde占菌体总蛋白的33 4%。纯化得到GST Mdde后, 再用凝血酶将其从特定位点切开, 得到表达的m Mdde。液体抑菌实验结果初步表明, 表达的融合蛋白GST Mdde对细菌生长有一定的抑制作用。利用纯化的GST Mdde融合蛋白, 制备了抗血清。     

人表皮生长因子受体结构域蛋白的原核表达、纯化及活性检测

目的:构建人表皮生长因子受体(EGFR)胞外结构域(ED)和胞内激酶结构域(PKD)的原核表达载体,获得纯化的GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD融合蛋白,并检测其活性。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增EGFR的ED和PKD基因编码序列,将其正确插入p GEX-KG载体,重组质粒转化大肠杆菌Rossate表达后,用GST-Sepharose4B珠子纯化融合蛋白。结果:构建得到GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD的原核表达载体,双酶切鉴定得到与预期片段大小相符的外源基因插入片段,经测序与目的序列完全一致;在Rossate菌中诱导表达出与预期位置相符的目的蛋白,经Western印迹检测,融合蛋白成功表达;纯化得到融合蛋白GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD。结论:克隆了GST-EGFR-ED和GST-EGFR-PKD基因,并获得了活性良好的GST-EGFR-ED和GST-EGF-PKD融合蛋白,为研究EGFR在肿瘤中的作用奠定了实验基础。     

结核分枝杆菌肝素结合血凝素蛋白的表达、纯化及免疫学特性的初步研究

目的:克隆肝素结合血凝素(HBHA)基因,并在大肠杆菌中进行表达和纯化,利用获得的蛋白进行免疫学特性的初步研究.方法:用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出HBHA基因片段,克隆至pMDI8-T载体中,序列测定正确后,将其亚克隆到表达载体pQE80L并在大肠杆菌DH5α中表达,表达蛋白经SDS-PAG及Western-blot分析后,亲和层析法纯化蛋白.获得的蛋白免疫BALB/c小鼠,测定血清抗体水平及IgG2a/IgG1比例.结果:克隆了HBHA基因,并成功表达该蛋白,SDS-PAGE及Western-blot分析表明表达产物正确.通过亲和层析法得到28kD纯化蛋白,与文献报道相符,诱导小鼠可使CD4+和CD8+细胞数明显增加.结论:成功获得了纯化的HBHA蛋白,明确了HBHA蛋白的免疫学特性,为进一步研究HBHA蛋白的致病机理及新型疫苗的开发提供了实验依据.     

人铜锌超氧化物歧化酶在大肠杆菌中的融合表达与纯化

目的:在大肠杆菌中表达并纯化人铜锌超氧化物歧化酶(HuSOD1)。方法:合成HuSOD1编码基因,PCR扩增后连入pMAL-p5x质粒构建融合表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,IPTG诱导表达,NBT法测定HuSOD1酶活,利用麦芽糖结合蛋白亲和层析柱纯化MBP-HuSOD1融合蛋白,经因子Ⅹa酶切及分子筛柱层析纯化HuSOD1蛋白。结果:构建了pMAL-p5x-HuSOD1表达载体,在大肠杆菌中实现了高表达,目的蛋白占全菌蛋白的30%,其中可溶性表达占63%,具有超氧化物歧化酶活性;通过亲和层析纯化得到纯度大于95%的融合蛋白MBP-HuSOD1,经因子Ⅹa酶切后纯化得到纯度约90%的HuSOD1蛋白。结论:在大肠杆菌中表达并纯化获得有活性的MBP-HuSOD1,经进一步酶切、纯化后得到HuSOD1。     

人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白的原核表达及纯化

目的:表达和纯化人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。方法:利用PCR搭接方法及基因合成方法获得目的基因,插入带有6×His标签的原核高效可溶性表达载体pET32a中,构建重组表达质粒pET32a-T9-ac-9,将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导目的基因表达;对融合蛋白进行Ni2+金属螯合柱纯化。结果:构建的重组表达质粒经PCR、内切酶鉴定及基因序列测定证实;目的蛋白在大肠杆菌中获得表达,SDS-PAGE显示相对分子质量为22.917×103;对表达产物进行了亲和层析纯化,从上清中获得了纯度较高的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白。结论:获得了可溶性的人肿瘤坏死因子α抑制肽-抗炎酸性尾巴融合蛋白,为其生物学功能研究奠定了基础。     

炭疽芽胞杆菌A16R株FtsE蛋白的可溶性表达和纯化

目的:构建炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白的原核表达载体,实现其在原核表达系统中的可溶性表达,并纯化融合蛋白。方法:用PCR方法从炭疽芽胞杆菌A16R株扩增得到ftsE基因片段,酶切后连接到pET28a原核表达载体,构建重组表达质粒pET28a-ftsE,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,筛选可溶性诱导表达与纯化融合蛋白的条件,以获得高纯度融合蛋白。结果:构建了FtsE蛋白的融合表达载体,并在大肠杆菌中获得高效表达;在20℃下,经0.1 mmol/L IPTG诱导3 h表达的产物主要是可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化获得了高纯度的FtsE融合蛋白,经Western印迹检测,目的蛋白表达正确。结论:实现了炭疽芽胞杆菌FtsE蛋白原核表达系统的可溶性表达并获得了高纯度融合蛋白,为后续研究奠定了基础。     

人自噬相关蛋白ATG7的原核表达及纯化鉴定

目的:原核表达并纯化自噬相关蛋白ATG7,初步鉴定其生物学活性。方法:利用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人ATG7基因的编码序列,插入载体p ET-28a(+)得到重组质粒,经Bam HⅠ和NotⅠ双酶切鉴定后转化大肠杆菌Rossate菌株进行小量诱导,纯化融合蛋白His-ATG7,通过Western印迹和SDS-PAGE检测融合蛋白的纯化效果。结果:用PCR技术从人乳腺文库中扩增得到约2031 bp的目的片段,插入载体p ET-28a(+)后构建出His-ATG7重组质粒,并经酶切鉴定及测序证实无误;转化大肠杆菌Rossate并进行小量诱导,纯化后SDS-PAGE检测显示获得相对分子质量约为78×103的融合蛋白。结论:纯化得到原核系统表达的His-ATG7融合蛋白,为后续研究ATG7在自噬中的作用机制奠定了实验基础。     

核心组蛋白的融合表达和纯化

目的:克隆核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的基因,表达并纯化组蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。方法:用PCR方法从乳腺文库中扩增核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的编码序列,分别将其以正确相位与pGEX-KG载体中的GST编码序列融合,得到重组质粒pGST-H2A、pGST-H2B、pGST-H3和pGST-H4,分别转化大肠杆菌BL21,表达融合蛋白GST-H2A、GST-H2B、GST-H3和GST-H4;用谷胱甘肽-Sepharose 4B亲和纯化融合蛋白;用Western印迹检测融合蛋白的表达及纯化。结果:分别构建了核心组蛋白H2A、H2B、H3和H4的融合表达载体;Western印迹检测表明,融合蛋白GST-H2A、GST-H2B、GST-H3和GST-H4获得表达及纯化。结论:表达并纯化了H2A、H2B、H3和H4的融合蛋白,为进一步研究核心组蛋白的功能奠定了基础。     

表皮生长因子受体干扰序列与白细胞介素24融合蛋白的原核表达

目的：在大肠杆菌中表达表皮生长因子受体干扰序列（EGFRi）与白细胞介素24（IL-24）的融合蛋白。方法：人工合成肿瘤细胞表面受体特异性结合位点EGFRi核苷酸序列,应用重叠延伸PCR技术将其与IL-24基因连接,其间引入一段柔软短肽编码基因;将融合基因克隆入pET-22b原核表达载体,IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）中表达,对表达条件进行优化;用His·Bind纯化试剂盒对表达产物进行纯化,SDS-PAGE进行鉴定。结果：酶切和测序结果证实EGFRi-IL-24融合基因的原核表达载体构建正确;在IPTG浓度为0.8mol／L、28℃诱导10h的条件下,可溶性融合蛋白表达量最高;表达产物的相对分子质量与预期值一致,为22000;经纯化得到了均一的融合蛋白。结论：获得大肠杆菌表达的融合蛋白EGFRi-IL-2,可用于活性分析。     

新型冠状病毒S蛋白RBD肽段的原核表达与纯化

目的:利用原核系统对新型冠状病毒S蛋白的受体结合域(RBD)肽段进行克隆、表达和纯化,制备高纯度的RBD肽。方法:在RBD肽段N端加入肠激酶位点序列(DDDDK),对应的核酸序列参照原核系统表达偏好进行全基因合成,构建pET-DsbC-RBD融合表达载体,通过原核表达和亲和纯化获得DsbC-RBD融合蛋白,用肠激酶对融合蛋白进行酶切和二次亲和纯化,获得高纯度新冠病毒S蛋白RBD肽。结果:构建了pET-DsbC-RBD表达载体,融合蛋白DsbC-RBD在大肠杆菌中实现了高效表达,经亲和层析纯化,重组融合蛋白DsbC-RBD相对分子质量为58×103,纯度约90%。用肠激酶对融合蛋白进行酶切,酶切效率近100%,通过二次亲和纯化获得了RBD肽,相对分子质量为25×103,纯度92%以上。结论:利用原核表达系统获得可溶性DsbC-RBD融合蛋白,采用亲和纯化和肠激酶酶切联用的方法制备获得高纯度的新冠病毒S蛋白RBD肽,为后续抗体制备和抗病毒药物筛选奠定了基础。     

风疹病毒(RV)包膜糖蛋白E1特异基因片段的原核表达

目的:表达风疹病毒(RV)E1特异肽段的重组融合蛋白.方法:经过双酶切鉴定和测序鉴定的阳,陛重组质粒载体pGEX-2T/E1-N,转化到感受态大肠杆菌BL21后,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其表达,并对诱导条件进行优化.用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化重组融合蛋白,SDS-PAGE鉴定.结果:用IPTG可以诱导E1特异肽段的重组融合蛋白表达,37℃诱导时,最佳诱导剂浓度为1 mmol/L,最佳诱导时间为4h.诱导温度从37℃降至16℃时,重组融合蛋白以可溶性形式表达,用谷胱甘肽琼脂糖珠纯化获得了纯化的重组融合蛋白.结论:利用原核表达系统可以获得纯化的风疹病毒E1特异肽段的重组融合蛋白.     

利用GST融合蛋白表达系统表达与纯化人N-Ras蛋白

目的:克隆人N-ras蛋白全长编码区基因,获得其原核表达产物,并对融合蛋白进行纯化。方法:采用PCR技术从人乳腺文库中扩增出人N-ras蛋白全长编码区基因,将其克隆到p GEX-KG载体中,在大肠杆菌Rossate中表达后,利用GST-Sepharose 4B亲和珠对原核表达产物进行纯化,SDS-PAGE鉴定表达与纯化产物。结果:从人乳腺文库中扩增获得约600 bp的DNA片段,并克隆至p GEX-KG载体上,经测序与目的序列完全一致;在大肠杆菌Rossate中诱导表达出相对分子质量约47×103的目的蛋白;纯化后,经鉴定获得了纯度较高的重组蛋白GST-N-Ras。结论:获得了重组蛋白GST-N-ras,为后续深入研究Ras基因与其他癌基因、抑癌基因的相互作用奠定了基础。