大鼠肾上腺单个嗜铬细胞分泌儿茶酚胺的电化学检测

报道以直径７μｍ的碳纤丝制作碳纤电极,在原代培养的大鼠肾上腺单个嗜铬细胞上检测诱发的儿茶酚胺激素分泌。当用微管向细胞吹加１０ｍｍｏｌ／Ｌ乙酰胆碱或６０ｍｍｏｌ／Ｌ氯化钾时,２－５ｓ延迟后记录到数目不等的峰形信号。峰信号上升快（约１ｍｓ）;衰减则较慢,呈指数形状。峰信号的检测要求电极上所加氧化电压足够大。实验表明,以高钾刺激时,该峰信号依赖于外钙（２ｍｍｏｌ／Ｌ）的存在。根据峰信号对应于嗜铬细胞内单个囊泡的儿茶酚胺量子化释放的事实,我们推算每次量子化释放的儿茶酚胺约为１０－２０—１０－１８ｍｏｌ量级。     

一种实用的碳纤电极制作方法

碳纤电极记录可用于对单个神经及内分泌细胞分泌过程进行电化学检测,其中技术关键之一是碳纤电极的制作。本文所介绍的碳纤的制作方法,简化了以往的工艺过程,使成功率与一致性得到了提高,同时检测灵敏度与噪声等指标满足了实验要求。用这样制作的碳纤电极在大鼠肾上腺嗜铬细胞上研究１－甲基－４－苯基毗啶对于单胺能神经细胞递质胞吐过程的影响,发现ＭＰＰ＾＋对于胞吐没有直接的影响并且不增加高Ｋ＾＋刺激所诱发的胞吐量。从     

PC12细胞中Synaptotagmin Ⅶ 的沉默抑制了致密核心大囊泡的分泌

Syt Ⅶ, 因其具有比Syt Ⅰ和Syt Ⅸ更高的钙离子亲和力, 以及在与脂质结合后表现出更慢的解离动力学过程, 被认为在致密核心大囊泡分泌的慢速动力学过程中起着钙离子感受器的作用, 而并不参与突触囊泡的快速分泌过程. 然而迄今为止, Syt Ⅶ的亚细胞定位和其在胞内具体的生理学功能尚未完全清楚. 在本研究中, 我们首先应用全内反射荧光显微镜技术表明, 在PC12细胞中Syt Ⅶ定位于致密核心囊泡. 通过综合运用高时间分辨率的细胞膜电容测量和碳纤维微电极安培检测, 确定了单独沉默内源性的Syt Ⅶ就可以明显减少PC12细胞中钙触发的致密核心囊泡和质膜的融合和抑制了融合孔的开放, 特别是减少了致密核心大囊泡胞吐触发相的幅值, 而对于其持续成分的速率则几乎没有影响. 这些发现提示我们Syt Ⅶ在PC12细胞致密核心囊泡融合机制中作为钙感受器, 对可释放致密核心大囊泡库的形成和维持起着非常重要的作用.     

高锶离子亲和力传感蛋白介导CALYX突触囊泡异步和自发释放

突触囊泡在钙离子(Ca2+)触发下释放神经递质普遍存在着同步和异步两种形式.突触囊泡膜蛋白(synaptotagmin 2,Syt-2)已被证实是Calyx of Held突触囊泡同步释放的Ca2+传感蛋白,而相关的异步释放Ca2+传感蛋白还有待于探索.虽然锶离子(Sr2+)因其物理和化学性质都接近Ca2+,且能触发更多的囊泡异步释放成分而成为研究异步释放机制的常用工具,但有关Sr2+触发异步释放的机制存在着争议.本文在胞外以Sr2+替换Ca2+的条件下,通过对野生型(WT)和Syt-2敲除型(Z2B-/-)小鼠Calyx突触囊泡自发和诱发释放的电生理特性分析,发现Syt-2是介导Sr2+诱发的突触囊泡快速释放的传感蛋白,但不是介导Sr2+相关神经递质异步释放和自发释放的传感蛋白;而未知的触发囊泡异步释放的传感蛋白相比Syt-2对Sr2+具有更高的亲和力,同时也介导突触囊泡的自发释放.这一研究为探索并最终发现触发囊泡异步释放的未知传感蛋白提供了新的线索.     

Synaptotagmin在神经递质释放过程中的作用

神经突触间递质的释放是神经系统完成其生理功能最重要的生物现象之一。在贮存递质的突触囊泡上存在一些神经细胞所特有的囊泡蛋白,如突触素（synapsin）、synaptobrevin和synaptotagmin等。其中synaptotagmins是膜转运蛋白中的一个家族,它们的特征是含有两个钙结合区：C2A和C2B。到目前为止,在哺乳动物中已经发现了15种synaptotagmin同形物（isoforms）。神经递质释放是由Ca^2＋内流以诱导突触囊泡发生胞吐而引起的,Ca^2＋需与细胞内部的Ca^2＋感受器相结合来协同控制囊泡胞吐释放,SynaptotagminⅠ可能作为快速同步释放的Ca^2＋感受器而发挥作用。现在已知synaptotagminⅠ在胞吐和胞吞两个过程中都扮演重要角色。     

ESYT-2 在致密核心囊泡分泌中起到的作用

目的:研究秀丽隐杆线虫(简称线虫)中一种扩展的Synaptotagmin同源物ESYT-2在致密核心囊泡分泌过程中起到的作用。方法:以线虫为研究对象,运用线虫腔胞吸收ANF-GFP的基本原理来确定ESYT-2与分泌相关,之后又进一步使用全内反射荧光显微镜技术(TIRFM)来研究ESYT-2对致密核心囊泡的具体调控。结果:①ESYT-2功能缺失影响线虫神经细胞致密核心囊泡分泌。②ESYT-2影响致密核心囊泡分泌的栓系过程。结论:ESYT-2调控了致密核心囊泡的分泌过程。     

囊泡运输的分子细胞机制

内膜系统构成了细胞及细胞器之间的天然屏障,保证重要的生命活动在相对独立的空间内进行。细胞内膜性细胞器之间的物质(如蛋白质、脂类)的运输主要是通过囊泡完成的。囊泡运输需要货物分子、运输复合体、动力蛋白和微管等的参与以及多种分子的调节,包括出芽、锚定和融合等过程。从上世纪60年代开始,人们认识到细胞分泌的蛋白需要先进入内质网,再到高尔基体,然后分泌到其作用部位。之后,信号肽假说被提出和证明。随后的研究完善了囊泡运输的过程,包括经内质网到高尔基体的蛋白质分泌运输过程中关键的调控基因及其作用环节、蛋白质复合物SNARE(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感的融合蛋白附着蛋白受体)在囊泡锚定和融合中的作用机制等。在囊泡运输中的具有代表性的神经细胞突触囊泡中,触发突触囊泡融合的钙感受器(synaptotagmin)能快速准确地将钙信号传递到突触囊泡,通过与SNARE复合体等作用,实现与细胞膜融合并释放神经递质,最终完成神经信息的传递。该文从囊泡运输的研究历史回顾、已有研究成果以及未来展望等三个方面对囊泡运输分子细胞机制进行了阐述。     

β-G spectrin的显性基因突变破坏致密核心囊泡的分泌

β-spectrin是细胞膜骨架的重要组成蛋白,其主要分布于质膜的基底部位.在线虫中只有一个编码β-spectrin亚基(β-G)的基因即unc-70.除了稳定质膜,使细胞产生极性等功能外,有报道称它还参与细胞分泌的调节过程.研究发现,在线虫中β-G spectrin的显性基因突变体unc-70(n493)会导致DCVs的分泌缺陷.在活体下,unc-70(n493)突变虫系的神经多肽分泌显著下降.此外,在主要分泌致密核心囊泡的ALA神经元内,钙光解释放促发的快相分泌也比野生型减少.运用TIRFM成像技术,观察在unc-70缺失的情况下ALA神经元内DCVs的锚定过程,结果显示质膜附近囊泡的密度没有显著变化,但囊泡在细胞膜附近停留的时程变短,表明囊泡锚定受到阻碍.为了验证unc-70是否还同时参与调控突触囊泡的分泌过程,运用电生理记录活体线虫神经肌肉接头的方法,发现自发的突触后电流mEPSCs没有明显变化.上述试验结果表明,β-G spectrin的显性基因突变虫系能够影响致密核心囊泡的分泌过程,其机制可能是影响了囊泡的锚定过程.     

单个囊泡内容物检测技术的成功

单个囊泡内容物检测技术的成功生物信息分子在细胞内合成后分类包装并贮存于囊泡中,当生理信号触发囊泡膜与细胞膜融合后,这些生物信息分子释放于胞外产生生物效应。通常单个囊泡内容物足以能产生明显的生物效应,但由于囊泡极其微小,数年来研究者们只能在囊泡群体水平...     

线虫全基因组RNAi筛选确定CAB-1为特异性调节致密核心囊泡分泌的因子

内分泌细胞和神经细胞通过释放激素和神经肽类物质来响应外界刺激,而这些物质的分泌,都是通过致密核心囊泡(dense core vesicle,DCV)来实现的.但是,现阶段关于DCV的生成、转运、释放的机制很大程度上是不清楚的.在本研究中,我们将线虫的排便行为和肠道分泌联系起来,并以此表型进行全基因组RNAi筛选,寻找调节DCV的新基因.我们成功筛选到了一些在肠道调节DCV生成或释放的基因.其中,CAB-1被确认为特异性调节DCV分泌的重要因子.在肠道中,cab-1突变会降低肠道DCV内容物的分泌,而在神经系统中,CAB-1的缺失也会导致DCV的标识物堆积在突触前,而突触囊泡(synaptic vesicle,SV)不受影响.