染色体上大片段DNA的直接克隆及移植

应用Red重组体内直接克隆染色体上大于10 kb的DNA序列非常困难.利用一种抗性拆分-融合策略成功地从供体菌染色体上直接克隆了约50 kb的DNA序列,并将其移植到受体菌的染色体上.首先将抗性基因(如cat)的互补片段cmb定向整合到染色体上拟克隆区域的一侧,然后将含有抗性基因另一互补片段cma的线性质粒载体电转到细胞内进行定向捕获,通过抗性筛选获得克隆.使用该方法,成功地将供体菌DH1-Z基因组上约48kb的大片段DNA捕获至质粒载体上,捕获阳性率达80%.然后,将该质粒转化到受体菌DH36,利用双链断裂促进同源重组策略,替换受体菌染色体上对应区域,一次敲除基因组上4个非必需区,获得重组菌DH40.该方法也可用于微生物天然产物生物合成途径的异源表达、基因组组装和大片段DNA的功能研究.     

人参大片段DNA(100kb)转化灵芝的研究

为探讨人参大片段DNA转化灵芝的可能性,通过电击法将双元细菌人工染色体(BIBAC)载体上的100kb人参大片段DNA转化到灵芝原生质体内。研究发现,在电极间距为4mm,电压强度为240V时,将5μL的人参大片段DNA转化到75μL的灵芝原生质体,在选择培养基上获得了具有再生能力的转化子。根据克隆载体两侧的序列设计两对引物,对转化子进行PCR分析。试验结果表明人参大片段DNA已经转化到灵芝的基因组中。     

质粒拯救法克隆细菌基因组大片段

[目的]细菌基因组大片段尤其是基因簇的克隆与操作,是细菌基因功能分析的一个难点.基因组测序工作的不断完成和序列信息的大量积累,为细菌基因组:DNA的操作提供了方便.本文报道了利用细菌的全基因组信息和质粒拯救法的原理建立的一种克隆细菌基因组大片段的方法.[方法]首先,根据基因组序列信息,在待克隆片段的一侧扩增一段DNA,并将其克隆到自杀载体上构建打靶质粒,然后,将打靶质粒整合到细菌的基因组中构建重组菌,提取重组菌的基因组DNA,酶切,自连,转化,将自杀质粒与待克隆的目的片段一起拯救出来.最后,根据需要将拯救的DNA片段亚克隆到新的载体中.[结果]我们利用该方法克隆了布鲁氏菌中长度为11kb的virB操纵子,并构建了互补质粒.将该质粒导入到virB的突变株中后使virB操纵子的转录活性得到了恢复,表明该策略切实可行.[结论]这种重组克隆策略给我们提供了一种新的对细菌基因组大片段进行操作的方法.     

大片段克隆载体研究进展

DNA克隆技术是分子生物学研究中一项重要的技术手段。自第一个质粒载体pSC1 0 1作为克隆载体以来 ,随着分子生物学技术的发展 ,克隆载体的整体结构、容载能力和转化效率都有了很大的改善。尤其是人类基因组计划的实施 ,产生了YAC和BAC克隆体系。随着植物基因组计划的进行 ,又产生了既能够克隆大片段DNA又能够将候选克隆直接通过农杆菌介导进行功能互补实验的载体。综述了几种常用大片段克隆载体YAC、BAC、BIBAC、PAC和TAC的特点及其应用 ,并对克隆载体的发展作了展望。     

链霉菌启动子的研究Ⅰ.灰色链霉菌启动子在大肠杆菌中的克隆和表达

灰色链霉菌(streptomyces griseus)No.45是链霉素产生菌,用于工业规模的链霉素生产,其启动子结构及基因表达的调控尚未揭示。本文报道了S.riseus启动子在大肠杆菌(Escherichia coil)中的克隆和表达,证实了S.griseus中也存在E.coli类型的启动子。我们已将S.griseus DNA的PstⅠ、BglⅡ酶切片段克隆到启动子探测质粒pGA46上,在大肠杆菌中表达四环素抗性基因启动子的功能。S.griseus DNA的Hin dⅢ酶切片段也已经克隆到另一个启动子探测质粒pPV33-H上,在E.coli中表达四环素抗性基因启动子的功能。为了进一步验证和分析,将重组质粒和载体以限制性内切酶酶切,从电泳图谱中可以重新找到共同的载体区带。以DNA分子杂交的方法进行DNA同源性分析,结果表明载体pGA46或pPV33-H和S.griseus DNA没有可察觉的杂交区带,而重组质粒和S.griseus DNA及载体均有明显的杂交区带。这说明重组质粒中的外源插入序列确是来自S.griseus,这些DNA片段携带了四环素抗性基因的启动子。为了进一步分析启动子功能区域的结构,已将重组质粒No.8中4.24kb的S.griseus插入序列缩短到1.89kb。插入序列的继续缩小正在进行中。     

可转化大片段DNA载体系统及其在花生育种中的应用前景

可转化大片段DNA载体系统主要包括双元细菌人工染色体BIBAC(binary bacterial artificial chromosome)和可转化人工染色体TAC(transformation-competent artificial chromosome)系统,它们能够高效克隆大片段DNA,在获取目的基因相关信息的同时转化植物得到转基因植株。本文综述了BIBAC和TAC载体的特点、种类、发展现状以及近年来在植物种质创新中的应用。同时,根据我国花生育种的现状,展望了可转化大片段DNA载体系统在利用野生花生资源改良栽培花生品种中的应用前景。     

适用于链霉菌大片段基因组DNA 克隆和异源表达的细菌人工染色体(BAC)载体的构建及应用

【目的】很多链霉菌来源的天然产物的生物合成基因簇往往很大,用传统的cosmid载体很难完整的克隆和异源表达。本研究通过载体改造,成功构建出一个新的细菌人工染色体(BAC)载体,用于链霉菌来源的天然产物生物合成基因簇的克隆及异源表达实验。【方法】从复合型载体pCUGIBAC1出发,通过λRED介导的PCR-targeting方法,用链霉素抗性基因替换掉原有的氯霉素抗性基因标记,同时插入链霉菌中常用的安普拉霉素抗性标记、转移起始位点oriT、φC31整合酶基因int、整合位点attP等元件。【结果】成功构建出可装载链霉菌大片段DNA的BAC载体pMSBBACs。使用pMSBBACs构建出链霉菌U27的基因组BAC文库,平均插入片段大小为100 kb。选取其中一个大小为140 kb的BAC质粒进行功能验证,实验证明通过接合转移和原生质体转化的方法都能够将这个大型BAC质粒导入链霉菌模式菌株,并通过位点特异性重组整合到染色体中进行异源表达。【结论】BAC载体pMSBBACs可成功用于放线菌大片段基因组DNA的克隆和异源表达实验。     

使用与Gateway技术兼容的T载体获得入门克隆

与Gateway技术兼容的农杆菌双元载体系统已开始应用于植物功能基因组的研究,但应用这些载体系统的一个瓶颈问题,是如何简单、经济和高效地将PCR产物或其他来源的目的DNA片段构建到入门载体上获得入门克隆.为此,将传统的TA克隆技术与Gateway重组克隆技术进行整合,构建了与Gateway技术兼容的两种TA克隆载体,用于在克隆PCR产物或其他来源的目的DNA片段的同时获得入门克隆.利用兼容Gateway技术的TA克隆载体有效地解决了上述瓶颈问题.     

体内遗传标记成团肠杆菌固氮质粒pEA9

用卡那霉素抗性（Kan^r)基因对成团肠杆菌固氮质粒pEA9进行活体遗传标记。将来自质粒pEA9的3.0kb片段(nif ENX)克隆到pBR322载体中,再将卡那霉素抗性(Kan^r)基因插入到3.0kb的片段中,构建成供体质粒pST5。将该质粒转化到含有待标记质粒pEA9的E.a.339菌株中,然后在AP培养基中消除供体质粒,筛选得到40个失去了pST5并保持卡那霉素抗性的克隆,分析表明它们不是质粒pEA9和pST5的共整合体,而是卡那霉素抗性基因通过两个质粒在nifENX区域内的DNA间的同源重组整合到了质粒pEA9上。     

hEPO cDNA重组逆转录病毒的构建

通过DNA重组技术,将不含非编码区的hEPO cDNA片段重组到逆转录病毒质粒pLXSN, pLNCX中重组质粒转染PA317细胞后,经G418筛选,抗性克隆细胞培养上清能成功地感染NIH3T3细胞,使之在筛选培养基中形成典型的G418抗性克隆,该克隆细胞染色体中成功地整合了EPOcDNA,并且表达出有生物学活性的红细胞生成素(EPO)产物。