核输入蛋白α/β真核表达载体的构建及细胞内定位

目的:构建带有myc标签的核输入蛋白(importin)α/β的真核表达载体,转染人胚肾293T细胞并分析其表达。方法:以乳腺癌文库为模板PCR扩增核输入蛋白α/β基因,扩增产物插入真核表达载体p XJ-40-myc,经双酶切和测序鉴定;将空载体与重组质粒分别转染人胚肾293T细胞,通过Western印迹和免疫荧光技术检测核输入蛋白α/β的表达。结果:酶切鉴定与测序结果表明构建的myc-Importinα/β真核表达载体正确;Western印迹检测到重组质粒在293T细胞中的表达;免疫荧光检测到核输入蛋白α定位于细胞质和细胞核,而核输入蛋白β定位于细胞核。结论:构建了核输入蛋白α/β的真核表达载体,并确定了其在细胞中的表达定位。     

人p65真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建带Myc标签的人p65真核表达载体,对其在人宫颈癌He La细胞中的定位进行检测,并研究p65对核因子κB(NF-κB)转录活性的影响。方法:构建带Myc标签的p65真核表达载体pc DNA3.1-Myc-p65,质粒测序验证正确后脂质体法瞬时转染人胚肾HEK293T细胞,Western印迹鉴定p65的表达;细胞免疫荧光实验检测p65的亚细胞定位;重组质粒与NF-κB-Luc报告基因质粒共转染HEK293T细胞,加TNFα刺激后检测萤光素酶报告基因的活性。结果:测序结果证实pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体构建成功;脂质体法转染HEK293T细胞后检测到Myc-p65蛋白的表达;细胞免疫荧光实验显示Myc-p65蛋白定位于He La细胞的细胞质中,当加入TNFα刺激后大部分Myc-p65蛋白进入细胞核;萤光素酶活性检测结果显示,提高细胞内p65水平或加入TNFα刺激均可明显激活NF-κB信号通路的活性。结论:构建了带Myc标签的p65真核表达载体,并使其在HEK293T细胞中表达;正常情况下,Myc-p65蛋白定位于宫颈癌He La细胞的细胞质中,TNFα促进Myc-p65入核;Myc-p65能够以TNFα不依赖的方式激活NF-κB信号通路。pc DNA3.1-Myc-p65真核表达载体的构建,为进一步筛选NF-κB的相互作用蛋白及功能研究奠定了基础。     

带绿色荧光蛋白标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白的真核表达及其生物学功能研究

目的:构建带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标签的人细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cdc25c)基因的真核表达载体pEGFP-cdc25c,并检测其在人胚肾293T细胞中的表达定位情况及生物学功能。方法:采用PCR技术从实验室已有质粒中扩增人cdc25c基因,并将其克隆到pEGFP-C1载体中;将重组质粒转染人胚肾293T细胞,Western印迹检测转染细胞的表达情况,荧光显微镜观察cdc25c蛋白在细胞中的定位,并利用cdc2 Tyr15位特异性抗体验证EGFP-cdc25c作为磷酸酯酶的生物学功能。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-cdc25c真核表达质粒构建成功;转染293T细胞后获得表达,在荧光显微镜下,表达阳性的细胞呈绿色,并定位于细胞质;Western印迹结果表明,EGFP-cdc25c能增加cdc2 Tyr15位的磷酸化水平,起到拮抗内源性cdc25c的功能。结论:构建了带EGFP标签的人cdc25c基因真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞质;EGFP-cdc25c能够发挥显性负性作用,为深入研究cdc25c的生物学功能奠定了重要基础。     

ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶的真核表达及鉴定

目的：构建ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶真核表达载体,并在293T细胞（人胚肾细胞）中实现表达。方法：通过RT-PCR法扩增得到ω-3多聚不饱和脂肪酸脱氢酶基因fat1,构建重组真核表达载体pCMV－Myc－fat1,用脂质体法转染293T细胞,Western Blot检测fat1的表达,并用间接免疫荧光（IFA）确定其在293T细胞中的定位情况。结果：构建真核表达质粒pCMV－Myc－fat1,转染293T细胞后,可检测到细胞内有fat1的表达并确定其在细胞中的位置。结论：成功构建真核表达质粒pCMV－Myc－fat1,可检测出细胞内有fat1的表达并确定其在细胞膜和细胞质内均有表达,为进行fat1的功能研究奠定了基础。     

人GRB2基因真核表达及其在293T细胞中的定位研究

[目的]构建人GRB2蛋白真核表达质粒p Enter-GRB2,并观察其在293T细胞中的定位。[方法]从Hela细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得GRB2全长c DNA序列,并将其克隆到真核表达载体p Enter中,构建重组质粒p Enter-GRB2。转染293T细胞24 h、36 h和48 h后通过Western Blot检测其表达情况,通过免疫荧光观察其在细胞中的定位情况。[结果]经双酶切及测序鉴定,GRB2开放阅读框正确地构建到了真核表达质粒p Enter中,免疫印迹检测可见大小约为25 k Da的特异性条带,免疫荧光实验表明GRB2蛋白在细胞质和细胞核中均存在。[结论]成功构建了真核表达质粒p Enter-GRB2并在293T细胞中表达,证实GRB2在293T细胞中不仅存在于细胞质中,也存在于细胞核中,为更加深入地研究其生物学功能及机制奠定了理论基础。     

SCG10基因重组质粒的构建及蛋白表达和定位

目的构建SCG10真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内表达及定位。方法以人胎脑cDNA文库为模板,PCR扩增SCG10全长编码基因,亚克隆至pEGFP-C1表达载体中。将构建的重组质粒测序并转染到人胚肾HEK293中,提取细胞蛋白进行Western blot检测。利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-SCG10在HEK293细胞内定位。结果 SCG10全长基因序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段大小540bp。Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为48kD。pEGFP-SCG10在细胞内定位以细胞浆为主,在细胞核少量表达。结论成功构建了SCG10全长基因真核表达载体,pEGFP-SCG10蛋白主要定位于HEK293细胞浆内。     

人酪氨酸蛋白激酶Lyn的真核表达、纯化及鉴定

[目的]构建含人酪氨酸蛋白激酶Lyn基因的载体并进行真核表达、纯化和研究其对细胞增殖的影响。[方法]提取人Hela细胞总RNA,用RT-PCR方法获得Lyn基因并克隆至pcDNA3.1(-)载体。经双酶切、PCR和测序方法鉴定后,将重组质粒瞬时转染HEK 293T细胞表达目的蛋白,应用组氨酸标签镍离子螯合磁珠纯化融合蛋白,通过Western Blot检测蛋白的表达及纯化,并用CCK-8法检测过表达Lyn后细胞增殖能力的变化。[结果]成功构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-Lyn并进行瞬时表达和蛋白纯化,CCK-8法检测过表达Lyn的HEK 293T细胞的增殖能力显著性下降(P0.01)。[结论]Lyn在HEK 293T细胞中成功瞬时表达及纯化,并可以使细胞的增殖能力受到明显抑制,为稳定表达和深入研究其生物学功能及作用机制奠定基础。     

DH结构域缺失对SGEF在293T细胞中定位的影响

目的:通过构建带EGFP标签的SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体pEGFP-C1-SGEF-△DH并使其在293T细胞表达,观察DH结构域缺失后SGEF在293T细胞中的定位。方法:利用重叠PCR技术在pcDNA3.1-SGEF质粒上扩增缺失DH结构域的SGEF基因,然后将PCR产物亚克隆到真核表达载体pEGFP-C1上,对阳性克隆进行双酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染293T细胞,并用Western印迹和细胞免疫荧光技术对重组质粒pEGFP-C1-SGEF-△DH在293T细胞中的表达及其蛋白定位进行分析。结果:双酶切和测序鉴定表明,pEGFP-C1-SGEF-△DH真核表达质粒构建成功,转染实验发现该质粒能够在293T细胞中表达,表达产物主要定位在细胞核内。结论:构建了带EGFP标签的人SGEF基因DH结构域缺失的真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞293T中表达,表达产物定位于细胞核,为进一步研究SGEF基因DH结构域的细胞生物学功能提供了一个重要的工具。     

缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探究缺氧微环境SIRT1亚细胞定位对结直肠癌细胞凋亡的影响及其分子机制。方法:将编码过表达野生型SIRT1以及核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)突变型SIRT1(SIRT1NLSmt)的慢病毒载体转染人类结肠癌HCT116细胞株,经嘌呤霉素筛选获得稳定过表达野生型SIRT1细胞株(LV-SIRT1细胞)和细胞质定位的NLS突变型SIRT1细胞株(LV-SIRT1NLSmt细胞),通过观察慢病毒载体编码的SIRT1-GFP融合蛋白的荧光定位,明确稳定转染细胞中外源性SIRT1的亚细胞定位。利用real-time PCR、Western blot法对分离提取的核-质蛋白进行检测,证实外源性SIRT1的表达和亚细胞定位情况。利用CCK-8细胞毒性实验、流式细胞术检测和TUNEL染色比较缺氧(1%O2)处理前后LV-SIRT1和LV-SIRT1NLSmt细胞存活或凋亡情况,Western blot法检测凋亡相关蛋白p53、ac-p53(K382)、Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved caspase-3表达水平。结果:Western blot、real-time PCR和免疫荧光染色结果显示稳定转染细胞均存在外源性SIRT1的过表达,NLS突变可导致SIRT1NLSmt富集于细胞质中;与亲本细胞HCT116和LV-SIRT1NLSmt细胞相比,LV-SIRT1细胞对缺氧的耐受能力最差、细胞凋亡水平最高,凋亡相关蛋白p53、Bax、caspase-3、cleaved caspase-3表达水平显著升高,ac-p53(K382)和Bcl-2表达水平显著下降,且LV-SIRT1细胞的胞核ac-p53下降最为显著。结论:在缺氧微环境中,细胞核定位的SIRT1通过影响p53的去乙酰化水平促进结直肠癌细胞凋亡。     

真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1的构建及鉴定

目的:构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因Nurr1的真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1,并检测其在293T细胞中的表达。方法:采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从大鼠黑质中获取Nurrl基因,连接T载体测序正确后与真核空载体pIRES2-EGFP一起,经Nhe1和Xho1双酶切,T4 DNA连接酶连接,构建pIRES2-EGFP-Nurr1;真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1测序正确后采用脂质体法将其转染293T细胞,倒置荧光显微镜下观察转染效率,PCR检测Nurr1基因mRNA水平的表达情况,免疫印迹试验(Western Blot)检测Nurr1蛋白的表达水平。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建了重组真核表达载体pIRES2-EGFP-Nurr1;293T细胞转染pIRES2-EGFP-Nurr1后可以高度表达绿色荧光,有效转录Nurr1基因并正确的高表达Nurr1蛋白。结论:成功构建Nurr1真核表达载体且在293T细胞中高水平表达,为进一步转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),基因治疗帕金森病奠定基础。