重组人表皮生长因子包涵体的表达、纯化及复性

目的:通过优化人表皮生长因子(hEGF)基因序列,利用大肠杆菌大量表达重组hEGF(rhEGF)包涵体,经过包涵体纯化复性获得高活性的rhEGF。方法:采用全基因合成优化后的序列,克隆至pET-30a表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,将rhEGF包涵体用尿素溶解后过Ni柱纯化并稀释复性,根据药典对得到的rhEGF进行纯度及活性测定。结果:构建了rhEGF的表达载体pET-30a-rhEGF,表达出的蛋白主要存在于包涵体中,相对分子质量为6.5×10~3,包涵体经过纯化复性后获得的rhEGF纯度可达92.8%,生物活性约4.94×10~7IU/mg。结论:得到了具有较高活性的rhEGF。     

重组人表皮生长因子的中试工艺研究

人表皮生长因子(hEGF)是最早发现最早应用于临床的多肽生长因子之一,由53个氨基酸组成,分子量约为6200Da。它具有多种生物学功能,能促进表皮和上皮细胞的增殖,刺激多种培养细胞的生长,增强蛋白质及DNA合成等。在临床上主要用于创烧伤救治、皮肤     

人egf基因在突变枯草芽孢杆菌WYBS2001中的转化、分泌表达及其产物功能研究

通过紫外线突变诱导获得了对感染致病菌具有显著抑菌作用的枯草芽孢杆菌突变株WYBS2001。采用PCR技术人工合成了175bp的人表皮生长因子（hEGF)的基因片段,并引入Pst I、Hind Ⅲ酶切位点,起始密码子及pUS186载体信号肽序列CTTAGA。经DNA测试分析,合成的片段与人egf基因序列完全一致。然后将其克隆至枯草杆菌分泌型质粒载体pUS186上构建成重组质粒pUSE,并转化枯草杆菌突变菌株WYBS2001,获得转入egf基因的枯草杆菌生态工程菌WYBS2001T。RIA检测结果表明,WYBS2001T阳性工程菌培养的上清液中可检测到hEGF。含量为7.6ng/ml,如果培养液中添加蛋白酶抑制剂可提高hEGF检测量,通过多代的培养仍然能够稳定地分泌表达hEGF。生物学功能实验表明,分泌的hEGF对人K562体外培养细胞的增殖和生长具有明显生物学活性。对烧伤动物模型的功能性实验观察到,WYBS2001T工程菌制剂对动物的烧伤有明显的治疗作用,该研究表明,微生态基因工程菌有很好的应用前景。     

人表皮生长因子（hEGF）基因在蓝藻中的表达

人表皮生长因子（hEGF)是由53个氨基酸组成的蛋白,在临床上内服与外敷可促进内外表皮细胞的生长。将人工合成的hEGF基因连接到质粒pRL-489上,位于启动子psb下游。验证连接成功后,用三亲接合转移方法将载体pRL-hEGF导入聚球藻Synechococcus sp.PCC7002和鱼腥藻Anabeana sp.PCC7120。由于pRL-hEGF没有能在单细胞蓝藻中自主复制的复制子,通过筛选,hEGF在聚球藻7002中是整合到蓝藻染色体上进行表达的。用PCR扩增的方法在两种转基因藻中均检测到hEGF基因的存在。放射免疫分析证明,hEGF基因在两种转基因藻中均得到了表达。而且,在聚球藻7002中是采用分泌形式将表达产物分泌到培养液中。     

rhEGF缓释微球对糖尿病皮肤溃疡创面修复的 作用

采用W/O/W方法制备聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)载重组人表皮生长因子(rhEGF)缓释微球, 表征了缓释微球形貌和粒径分布, 研究了体外释放行为, 进行了细胞实验和动物实验. 结果显示：微球形貌规则, 粒径均匀; 药物包封率达85.6%; 缓释时间达24 h. 细胞实验表明, 微球比rhEGF原液具有更好的促进细胞增殖作用; 通过观察动物实验中溃疡面积变化、组织病理切片和PCNA表达, 发现微球组治疗效果优于生长因子原液组和空白对照组, 并且具有显著性差异. 本研究为rhEGF缓释微球技术的临床应用提供了重要的科学依据.     

重组人表皮生长因子的研究概况

人表皮生长因子又称尿抑胃素,是存在于人体内的一种重要的多肽生长因子。它是在1975年由Cohen等和Gregory各自独立地从人尿液中分离得到的,并被分别命名为“人表皮生长因子(Human Epidermal Growth Factor, hEGF)”和“尿抑胃素(Urogastrone, UG)”。后来的研究证明两者实为同一物质,遂将其名称统一为“人表皮生长因子”。     

家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白及生物活性的研究

人表皮生长因子(hEGF), 一种由53个氨基酸残基组成的单链多肽, 具有广阔的应用前景。本文主要探讨家蚕表达人表皮生长因子gp67信号肽融合蛋白的生物活性。采用家蚕杆状病毒表达系统来表达该信号肽融合蛋白。构建了重组质粒pBacPAKS-hEGF, 将该重组质粒与线性化病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染家蚕细胞, 筛选获得重组病毒vBacPAK-SEGF, 用vBacPAK-SEGF感染家蚕BmN细胞和五龄蚕, Western blot检测表明在家蚕细胞、五岭幼虫的血淋巴和蛹中均有约12 kD的目的蛋白表达。ELISA检测发现在家蚕细胞中的表达量为23 mg/ 106细胞, 五龄幼虫中的表达量可达到82 mg/mL血淋巴。利用小鼠成纤维细胞Balb/c3T3分析家蚕表达的hEGF信号肽融合蛋白的生物活性, 结果表明表达产物能显著促进Balb/c3T3细胞的增值。另外, 研究还发现hEGF信号肽融合蛋白可使新生ICR小鼠体重增 加, 睁眼和萌齿时间提前。本研究为进一步开发利用家蚕表达的hEGF提供理论基础。     

重组人表皮生长因子的稳定性

考察了不同条件下重组人表皮生长因子（rhEGF）的稳定性。结果表明,不同的保存条件（物理状态、温度、pH、浓度等）对rhEGF的稳定性有显影响,使用适当的添加剂（保护剂、抗氧剂、抑菌等）可以提高rhEGF的稳定性。上述结果为rhEGF的制剂学研究提供了依据。     

转基因迷你番茄及其对酒精引起的胃伤害的保护作用

表皮生长因子(EGF)具有促进多种细胞增殖的作用, 尤其在维持消化道黏膜完整和促进消化道溃疡愈合方面作用巨大。以前的研究多集中在细菌和酵母中表达, 本研究试图以番茄作为生物反应器生产重组人 EGF, 使之成本降低, 应用方便。依据人 EGF 的基因序列, 设计合成了番茄密码子偏爱的人 EGF 基因, 并将其构建到植物表达载体 pCAMBIA2300 中, 通过农杆菌介导得到了含有人 EGF 基因的转基因番茄。放射免疫法检测到每克鲜重果实中的表达量达 3.48 ± 1.01 ng。将果汁灌喂小白鼠 15 天(相当于每鼠每天喂服 24 ng rhEGF)能显著抵抗酒精引起的胃溃疡形成, 溃疡指数由 42.20 ± 18.13 下降为 16.25 ± 9.57。     

铬银染色SDS-PAGE法在小分子肽制品检定中的应用

铬银染色SDS-PAGE法简便、快速、灵敏度高,现已成为分析、检定微量蛋白质和多肽样品的常用方法。该法用于分子量在10000Da以上的样品时效果很好,但用于分子量在10000Da以下的样品如人表皮生长因子(hEGF,分子量约6200Da)时,其电泳带太宽,且常不能形成平直的条带,给样品纯度和分子量的测定带来很大困难。我们在进行重组人表皮生长因子(rhEGF)样品的SDS-PAGE分析时,对电泳条件作了一些改进,取得了较好的效果,现报告如下。     

诱导多功能干细胞(iPSC)技术的研究进展

诱导多功能干细胞(iPSC)是采用基因重排的方法,使已分化的成体细胞重新获得多向分化潜能的细胞.由于它具有多种组织分化的特性,不存在伦理方面的争议,成为再生医学领域的研究热点.小鼠、人的多种分化的成体细胞已被成功诱导为具有多向分化潜能的多功能干细胞.诱导分化技术不断得到验证与改进,正在逐步得到推广,为iPS细胞向临床应用打下了坚实的基础.     

人表皮细胞生长因子脂质体制备及促大鼠烫伤修复研究

目的:制备重组人表皮细胞生长因子(rhEGF)脂质体,并考察其促大鼠烫伤创面愈合的作用.方法:采用pH梯度法制备rhEGF脂质体;超滤-离心法分离rhEGF脂质体混悬液中的游离rhEGF,ELISA法测定rhEGF含量,计算脂质体包封率;采用透射电镜观察脂质体的外观形态;采用纳米粒度及Zeta电位分析仪分别测定脂质体的粒径和Zeta电位;以大鼠烫伤模型观察给药后各试验组创面愈合过程中的形态、愈合时间和愈合率的变化.结果:制备的rhEGF脂质体包封率为57.7±1.1％;脂质体形状较为规则,呈完整圆球形或椭圆形的单室囊泡;脂质体粒度分布均匀,呈正态分布,平均粒径为63.7 nm;脂质体的Zeta电位为+9.2mV,带正电荷;rhEGF脂质体高、中剂量组能显著性促进大鼠烫伤创面愈合,使创面愈合时间明显提前,低剂量组促烫伤修复效应不明显.结论:pH梯度法制备的rhEGF脂质体包封率较高,rhEGF脂质体对大鼠烫伤创面的愈合有明显促进作用.     

人表皮生长因子基因转染原代角质形成细胞

目的:将带信号肽的人表皮生长因子基因转染原代成人角质形成细胞, 证实细胞活性及hEGF的有效表达, 为后期的皮肤修复研究打下基础.方法:先酶切验证pcDNA3.1-hEGF, 后消化成人皮肤组织, 以Defined Keratinocyte-SFM(DKSFM)传代培养角质形成细胞并鉴定, 脂质体转染质粒pcDNA3.1-hEGF入细胞, 转基因细胞培养48 h后作RT-PCR和Western-blot分析, 上清分别进行放射免疫测定和MTT测定.结果:质粒pcDNA3.1-hEGF上的hEGF序列经测序证实,双酶切后获得约230 bp和5.4 kb条带;成人角质形成细胞体外培养可快速稳定增殖, 转hEGF基因细胞经RT-PCR扩增出一条约230 bp的特异性条带, Western-blot检测到hEGF表达明显升高;放射免疫法和MTT实验证实转基因细胞有稳定的hEGF蛋白分泌.结论:质粒pcDNA3.1-hEGF在脂质体介导下成功转染成人皮肤角质形成细胞, 转基因细胞能分泌有生物活性的EGF;体外培养的成人皮肤角质形成细胞可见少量EGF分泌.     

Tol2转座子系统在转基因动物中的应用

Tol2是在青鳉鱼基因组中发现的一种具有自主性的转座子元件.它编码转座酶,催化Tol2转座子结构中5’端200 bp和3’端150 bp序列发生转座反应.Tol2的多种特性,如可携带大片段外源DNA、单拷贝整合效率高、转座子活性强等,使得以Tol2特座子系统为载体的转基因技术在多种生物中得到应用.综述了Tol2转座子系统的结构、特性以及近年来在多种动物转基因中的应用.     

重组人表皮生长因子对大鼠表皮细胞促生长作用的观察

利用体外培养的自体表皮细胞来覆盖烧伤切痂创面已成为当前烧伤整形领域的一个研究课题。其中一个重要的问题是如何促使培养的表皮细胞尽快地增值,扩展成片,以应用于创面的修复和愈合。 人表皮生长因子(hEGF)是存在于人体内的一种重要的多肽生长因子,对多种组织来源的上皮和表皮     

人表皮生长因子融合蛋白的表达及纯化工艺的优化

探讨了在大肠杆菌中生产小分子泛素样修饰蛋白与人表皮生长因子（SUMO-hEGF）的最佳表达及纯化条件。将重组表达载体pET3c-SUMO-hEGF转化到大肠杆菌BL21(AI)中,以阿拉伯糖为诱导剂,对诱导表达参数进行优化,并进一步通过离子交换层析,Ni-NTA亲和层析及分子筛层析等进行纯化分析。结果表明： SUMO-hEGF在BL21(AI)中的最佳诱导表达温度为37℃,诱导剂阿拉伯糖的最佳浓度为5.0g/L,最佳诱导表达时间为4h,表达量约为20.2%,Western blot 分析证实,纯化后的蛋白是hEGF,为进一步开发hEGF基因工程药物奠定了基础。     

甜味蛋白研究的新进展

甜味蛋白(thaumatin)是世界上已知最甜的物质,具有很大的应用前景.Thaumatin的基因核苷酸和蛋白质氨基酸序列都已测定.晶体分析表明它具有高稳定的四级结构.在味蕾小孔中发现了介导thaumatin发生作用的物质.Thaumatin自身的功能仍不清楚.在多种生物中发现了thaumatin类似蛋白质,具有不同的生物活性.用基因工程手段实现了thaumatin在多种原核和真核生物中的表达,但迄今仍未得到理想的基因工程产品.     

人表皮生长因子(hEGF)在实验室诞生

1993年4月19日,在中国科学院组织的专家鉴定会上,一致通过了对中科院上海生物化学研究所“人表皮生长因子(hEGF)基因工程实验室研究”成果的鉴定。这亦是上海生化所在年内提前超额完成的首项国家“八五”攻关任务。     

藤仓赤霉菌赤霉素生物合成及代谢调控研究进展

赤霉素是最重要的植物生长调节剂之一,在农业生产中得到越来越广泛的应用,具有广阔的市场前景,但其工业化的高生产成本严重制约着它的广泛应用。近年来,利用生物技术提升赤霉素产量日益成为研究热点。赤霉素生物合成是多种酶协同作用的过程,阐明赤霉素的生物合成机制,利用代谢工程策略调控代谢流量,对提高赤霉素产量至关重要。文中综述了当前藤仓赤霉菌赤霉素生物合成途径、关键酶、环境因素、代谢流调控等方面的研究进展,在代谢调控方面进行了展望,以期为实现赤霉素稳产高产提供思路。     

骨髓间充质干细胞的诱导分化机制及其在消化道组织再生中的作用

骨髓间充质干细胞是一种具有多种分化潜能的非造血干细胞,它是从骨髓中分离得到,能被诱导分化为骨、软骨、肌肉、神经、血管内皮等多种类型的组织细胞,现已应用到再生医学的多个领域。本文将就骨髓间充质干细胞的诱导分化机制及其在促进消化道组织再生中的作用作一综述。