血管钠肽(VNP)在大肠杆菌中的表达、纯化及活性分析

利钠肽家族成员在维持机体心血管平衡等方面发挥着重要的生理作用.人工设计的新型利钠肽分子血管钠肽(VNP)由C-型利钠肽和A-型利钠肽的功能结构域嵌合组成,具备两种利钠肽分子的优势功能.采用分子生物学方法,构建了BL21(DE3)/pGEX-4T-1-VNP原核表达系统,在大肠杆菌中实现了融合蛋白GST-VNP的可溶性表达.经离心、超声波破碎、GST亲和层析、G25凝胶过滤和肠激酶酶切后超滤离心便可获得电泳纯的目的产物VNP,最终每升发酵液可获得20 mg重组VNP蛋白.大鼠离体血管环张力法和去膀胱尿液收集法活性评价显示,VNP具有扩张血管和利尿双重功效.     

三得利公司开发的动脉硬化的治疗药

日本三得利生物医学研究所与国立循环系统病中心研究所共同开发了人C型钠利尿肽(与hCNP、小鼠CNP是同一物质),这是抑制培养小鼠平滑肌细胞的DNA合成和抑制细胞数量增加的药物.CNP是动脉硬化的治疗药.这项成果已在大阪召开的第6次ANP研究会上发表. 借助NP受体的第2信使cGMP的亢进来抑制这种细胞的增殖.目前已克隆了A型、B型、C型3种NP受体.A型和B型分别与ANP和CNP高度亲和,这有助于生理活性的表达.     

血管钠肽抑制低氧对大鼠心成纤维细胞内钙浓度升高的作用

为了观察血管钠肽(vasonatrinpeptide,VNP)对低氧作用时心成纤维细胞增殖的影响,将分离纯化乳鼠心成纤维细胞,随机分为4组对照组、低氧组(2%～3%)、VNP组(10－8～10－6mol/L)和VNP+低氧组。用MTT比色法、～3H-TdR掺入法观察细胞增殖情况,采用激光共聚焦方法研究VNP对细胞内钙浓度(［Ca     

血管钠肽对大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞Ca2+激活K+通道的作用

目的研究血管钠肽(VNP)对大鼠肠系膜动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)Ca2+激活K+通道(Kca)的作用及其机制.方法采用全细胞膜片钳技术观察VNP对Kca的影响,以及HS-142-1、8-Br-cGMP和美蓝(MB)在这一过程中的作用.结果①VNP(10-6 mol/L)显著增强Kca(P＜0.05,n=5).②8-Br-CGMP(10-3mol/L)模拟VNP增强Kca的作用(P＜0.05,n=6).③HS-142-1(2×10-5mol/L)或MB(10-5mol/L)完全阻断VNP增加Kca电流密度的作用.结论VNP通过作用于VSMCs的钠尿肽GC耦联受体,升高细胞内的cGMP水平,激活Kca.     

应用噬菌体展示随机肽库淘筛mAb5H5识别的抗原表位

本文利用噬菌体随机9肽库探索汉滩病毒(HTNV)核衣壳蛋白(NP)B细胞抗原表位.以抗HTNV NP单克隆抗体(mAb)5H5作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机9肽库.阳性克隆经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后,随机挑取10个克隆,DNA测序,与HTNV 76～118株S基因进行同源性分析.结果显示筛选到的噬菌体能特异地与5H5结合,这种结合可被天然抗原所抑制.10个克隆的氨基酸序列相同,均为VRDAEEQYE,与76～118株NP氨基端的aa25～33一致.证实了该线性表位是mAb 5H5识别的表位,噬菌体肽库有助于病毒抗原表位的确定.     

血管钠肽对中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成有抑制作用

实验探讨了心房钠尿肽家族新成员血管钠肽（vasonatrin peptide,VNP)对中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成的影响,在培养的新生大鼠心肌细胞上,用四唑盐（MTT）比色实验,总蛋白含量测定和^3H-亮氨酸掺入实验等方法观察细胞数和蛋白合成情况,并用放免法测定VNP对细胞内环鸟苷酸（cGMP)和环腺苷酸（cAMP)以及培养上清液中内皮素含理的影响,探讨VNP的作用机制,结果显示,重度低氧24h,心肌细胞数和蛋白合成均降低,而中度低氧显著增加蛋白的合成,具有促心肌细胞肥大的作用,VNP浓度依赖性地抑制中度低氧诱导的心肌细胞蛋白合成增加,并且升高细胞内cGMP水平,降低低氧诱导的培养上清液中内皮素的含量,结果提示,VNP抑制中度低氧诱导的新生大鼠心肌细胞蛋白合成增加,该作用与其升高细胞内cGMP浓度、降低低氧诱导的内皮素合成和/或释放增加有关。     

血管钠肽对低氧大鼠心脏钠尿肽C受体表达的影响

目的 :探讨低氧对大鼠心脏钠尿肽C受体 (NPR C)表达的调节作用 ,以及血管钠肽 (VNP)对这一过程的影响。方法 :将大鼠随机分为 3组 :对照组、低氧组 (3～ 2 8d)和VNP(2 5～ 75 μg/kgbw) 低氧组 ,采用放射免疫的方法测定大鼠血浆心房钠尿肽 (ANP)的浓度 ,并采用定量PCR的方法分析NPR C的mRNA水平。结果 :低氧 2 8d大鼠血浆ANP浓度显著高于正常大鼠 (P <0 .0 5 ) ,而且每天注射 75 μg/kgbw的VNP使ANP浓度进一步升高 (P <0 .0 1)。低氧 3d对大鼠心脏NPR C的mRNA的量没有显著影响 ;低氧 7d使大鼠心脏NPR C的mRNA的拷贝数显著升高 (P <0 .0 5 ) ;低氧 14d、2 8d使大鼠心脏NPR C的mRNA的拷贝数进一步升高 (P <0 .0 1)。每日注射 2 5μg/kgbw的VNP对低氧诱导的大鼠心脏NPR C表达没有显著影响 ;5 0 μg/kgbw的VNP显著降低低氧大鼠心脏NPR C的表达 (P <0 .0 5 ) ;75 μg/kgbw的VNP进一步降低低氧大鼠心脏NPR C的表达 (P <0 .0 1)。 结论 :VNP可以升高低氧大鼠的血浆ANP水平 ;低氧可以使大鼠心脏NPR C表达增加 ,而且具有时间依赖性 ,而VNP对这一过程有抑制作用 ,并且呈剂量依赖性     

甲型流感病毒核壳蛋白在BALB／c小鼠中酶联免疫斑点法表位的筛选及其与CTL表位的相关性研究

目的：利用甲型流感病毒A／Johannesburg／33／94（H3N2）核壳蛋白（NP）全长肽库筛选BAI卫／c（H-2^d）小鼠中NP酶联免疫斑点法（EUSPOT）表位,研究其和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位的一致性关系,为使用ELlSPOT评价流感病毒NP疫苗的细胞免疫效果提供实验依据。方法：以甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）（PR8）感染BALB／c（H-2^d）小鼠后,通过检测T细胞分泌γ-干扰素（IFN-1）的ELISPOT法和体内CTL法检测NP所诱发的细胞免疫反应,综合分析ELlSPOT和CTL表位肽之间的关系。结果：Pep36（NP第141-155位氨基酸残基,SNLNDTTYQRTRALV）和Pep37（NP第145-159位氨基酸残基,DTTYQRTRALVRTGM）可以诱发较强的ELlSPOT反应,根据Pep36和Pep37共有序列合成的Pep147-155（NP第147-155位氨基酸残基,TYQRTRALV）可以诱发与这2条多肽相同强度的ELlSPOT反应,表明Pep147-155为NP诱发ELlSPOT反应的最强表位,体内CTL也表明它是最强的CTL表位;Pep95（NP第377-391位氨基酸残基,STLELRSRYWAIRTR）、Pep96（NP第381-395位氨基酸残基,LRSRYWAIRTRSGGN）和其他表位肽诱发的ELISPOT反应较弱,体内CTL反应也较弱。结论：BALB／c（H-2^d）小鼠中,甲型流感病毒NP诱发ELlSPOT反应和CTL反应的表位肽高度相关;实验结果为使用ELlSPOT评价流感病毒NP疫苗的细胞免疫效果提供了实验依据。     

血管钠肽抑制低氧刺激心脏成纤维细胞增殖的机制研究

目的：研究血管钠肽（VNP）抑制低氧刺激的心脏成纤维细胞增殖的机制。方法：发离、培养乳鼠心脏成纤维细胞,随机分为四组：对照组、低氧组、低氧＋VNP组和低氧＋8－Bromo-cGMP组。以MTT法观察各组细胞的生长情况,分别采用放射免疫和免疫组化的方法研究了VNP对细胞内cGMP水平和增殖细胞核抗原（PCNA）表达的影响。结果：低氧24h可以使培养的乳鼠心脏成纤维细胞MTT A490nm值显著升高（P＜0．05vs对照组）,VNP（10^-7mol/L和8－Bromo-cGMP(10^-3mol/L)均可以显著降低低氧刺激的心脏成纤维细胞MTT A490nm值（P＜0．05vs低氧组）;对照组和低氧组细胞内cGMP水平无显著差异,而VNP（10^-7mol/L）能升高细胞内cGMP水平（P＜0．05vs对照组、低氧组）;低氧组PCNA的表达显著强于对照组（P＜0．05vs对照组）,VNP（10^-7mol/L可以使低氧刺激的心脏成纤维细胞PCNA表达减弱（P＜0．05vs低氧组）。结论：VNP抑制低氧刺激的心脏成纤维细胞增殖与升高细胞内cGMP水平、减弱PCNA的表达有关。     

血管钠肽对离体人乳内动脉的舒张作用

为了研究血管钠肽(VNP)对人乳内动脉(human intramammary artery,HIMA)的舒张作用及其机制,采用离体血管灌流的方法,观察VNP对内皮完整和去内皮HIMA的舒张作用,以及HS—142—1、TEA、8—Br—cGMP和镁蓝(MB)对这一过程的影响。实验中观察到,VNP(0．0001—1μmol/L)可引起剂量依赖性的舒张效应,且无内皮依赖性;8—Br—cGMP(0．1—1000μmol/L)也可引起剂量依赖性的血管舒张效应。钠尿肽鸟苷酸环化酶(guanylate cyclase,GC)受体的特异性阻断剂HS—142—1(20μmol/L)使VNP舒张HIMA的作用几乎完全消失。MB是GC的抑制剂,10μmol/L的MB不但使VNP舒张HIMA的作用完全消失,而且可增强HIMA对去甲肾上腺素(NE)产生的收缩反应。钙激活钾通道(KCa)的阻断剂TEA(1mmol/L)可减弱(但是不完全阻断)VNP的舒血管作用。上述结果表明,VNP对HIMA具有不依赖内皮的舒张作用;此作用是通过作用于平滑肌细胞的钠尿肽GC受体,引起细胞内的cGMP水平升高实现的,并且与Kca有关。     

应用噬菌体展示随机肽库淘筛mAb 5H5识别的抗原表位

本文利用噬菌体随机9肽库探索汉滩病毒（HTNV）核衣壳蛋白（NP）B细胞抗原表位。以抗HTNV NP单克隆抗体(mAb）5H5作为筛选分子,生物淘洗噬菌体递呈的随机9肽库。阳性克隆经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后,随机挑取10个克隆,DNA测序,与HTNV76－118株S基因进行同源性分析。结果显示筛选到的噬菌体能特异地与5H5结合,这种结合可被天然抗原所抑制。10个克隆的氨基酸序列相同,均为VRDAEEQYE,与76－118株NP氨基端的aa25-33一致。证实了该线性表位是mAb 5H5识别的表位,噬菌体肽库有助于病毒抗原表位的确定。     

人血清白蛋白-血管钠肽融合蛋白在毕赤酵母中的表达

人工合成VNP基因,通过酶连构建HSA和VNP基因的融合基因,插入表达载体pPIC9K,电转至毕赤酵母GS115,构建成工程茵,甲醇诱导表达。重组表达质粒经双酶切验证构建正确;表达产物经SDS-PAGE分析分子量为69 000 Da,与理论值相符;Western blot鉴定产物兼有HSA和VNP免疫原性,说明其为杂合分子;兔胸主动脉环离体灌流实验证明融合蛋白具有舒张血管活性。本研究说明毕赤酵母适于HSA-VNP融合蛋白的表达,为进一步开发稳定的VNP药物提供了生物制备方法。     

嗜铬蛋白可能是一种激素原

Tatemoto 等报道了一种胰源肽的氨基酸顺序及其生物学活性,该肽具有抑制葡萄糖诱导胰腺分泌胰岛素的作用,被称为胰腺抑制素(pancreastatin)。他们认为这种肽可能属于一种至今尚未被阐明的肽类族。不久以后,Huttner 等又发现该肽与嗜铬蛋白的氨基酸顺序有相似处。牛嗜铬蛋白 A 第251～294残基之间,     

EB病毒LMP1-CTAR3对NP69细胞增殖和蛋白质表达的影响

为了探讨EB病毒潜伏性膜蛋白1(LMP1)第三个功能活性区域(CTAR3)在鼻咽上皮细胞NP69中的转化作用机制,采用逆病毒感染的方法,将浓缩的逆病毒RV-LMP1和RV-LMP1△232～351分别感染鼻咽上皮细胞NP69,建立NP69-LMP1与NP69-LMP1△232～351稳定表达细胞系.通过绘制生长曲线、平皿克隆形成试验和软琼脂集落形成试验比较野生型和突变型LMP1对NP69细胞增殖的影响,运用蛋白质组学方法鉴定NP69-LMP1与NP69-LMP1△232～351细胞间的差异表达蛋白,选用实时荧光定量RT-PCR与Western blot对其中部分蛋白质点差异表达进行验证.结果发现:a.突变型LMP1△232～351促NP69细胞增殖的能力较野生型LMP1明显降低(n=3,P<0.05);b.鉴定了LMP1-CTAR3在NP69细胞中参与调节的16个蛋白质(表达上调的蛋白质8个,下调的8个).c.实时荧光定量RT-PCR和Western blot证实了部分上述蛋白质的差异表达.以上结果说明,LMP1-CTAR3是其发挥促细胞增殖的重要活性部位,可能通过参与调节G蛋白和异柠檬酸脱氢酶等蛋白质的表达而起作用.     

基于TAP分子亲和力模型预测MHCⅠ类分子提呈短肽的免疫原性

主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类分子亲和力模型有助于筛选出候选短肽,为实验确定可以与MHCⅠ类分子形成复合物从而激活细胞毒性T细胞的短肽提供帮助;抗原处理相关转运体(transporter associated with antigen processing,TAP)分子亲和力模型也可用于筛选候选短肽;如何更好利用两类亲和力模型筛选出候选短肽、这两类亲和力模型对短肽选择性的异同以及这种选择性异同的生物学机制尚不清楚.本文重新整理了TAP亲和力测试集,使训练样本达到699个;使用核函数平衡矩阵算法建立的TAP亲和力模型预测精度高于同类算法,5折交叉检验Pearson相关系数0.89;结合HLA A3分子亲和力模型、TAP亲和力模型显著提高免疫原性短肽预测精度,AUC值从～0.82上升到0.87.提高的原因是两个亲和力模型对第2、9位置"最佳"氨基酸不同偏好性和这种不同偏好的互补性造成的.TAP分子与短肽模拟对接结果反映了这个结论.TAP亲和力可在线预测(http://www.bilologymaths.top/mbtwo/major.aspx).     

TNF-α小分子抑制剂C87的纳米药物制备及其体内外活性研究

该研究首先制备并表征包载TNF-α小分子抑制剂C87的纳米粒子,进而评价其在L929细胞和小鼠自身免疫性肝损伤模型中抑制TNF-α细胞毒性的作用。采用纳米沉淀法制备载C87的纳米粒子(C87 NP),并对其理化性质及体外释放行为进行表征;在L929细胞中用MTT法分析C87 NP拮抗TNF-α细胞毒作用的效果;经尾静脉注射刀豆蛋白A(ConA)诱导小鼠发生自身免疫性肝损伤,采用C87 NP预给药方式,防治小鼠自身免疫性肝损伤;使用LEGENDplex?分析小鼠血清中13种细胞因子的表达水平;流式细胞术分析肝和脾中T细胞及亚群、NK细胞等的分布、比例和数量。制备出的C87 NP具有较高(34.4%)的载药量,且稳定性好,其包封率为48.1%,C87 NP平均粒径为82.57 nm,多分散系数为0.115,呈电中性,透射电镜结果显示其为球形结构;该纳米粒子可在体外持续缓慢释放C87,持续时间不少于8 h;C87 NP可以在体外抑制TNF-α对L929细胞的杀伤能力(IC_(50)=9.13 μmol/L),并呈浓度依赖性;动物实验结果显示,C87 NP治疗组小鼠的存活率为66.7%,进一步的生化和病理分析结果表明,ConA小鼠尾静脉给药12 h后,C87 NP预防性给药能显著降低血清中ALT、AST与部分细胞因子的水平(P0.01),减轻肝损伤,减少CD4~+T、CD8~+T、NK细胞等对肝脾的浸润(P0.01),提高脾脏Treg细胞比例(P0.05)。该研究成功制备出纳米药物C87 NP,且C87 NP在体内外具有良好的抑制TNF-α细胞毒性的作用,这为小分子药物C87今后在临床上的应用奠定了基础。     

Hsp70-NP融合蛋白增强诱导HTNV NP特异性CTL的实验研究

本文采用纯化蛋白Hsp70-NP,NP,Hsp70分别免疫C57/BL6小鼠,取各组小鼠脾淋巴细胞进行淋巴细胞增殖试验和细胞毒试验.此外,为了获得细胞毒实验的靶细胞,本文还采用脂质体介导质粒pcDNA3.1/S转染黑色素瘤细胞B16,通过G418筛选稳定克隆,并用RT-PCR,Western blots以及免疫荧光染色证实N蛋白在胞浆中表达.淋巴细胞增殖实验表明,Hsp70-NP,NP组小鼠脾淋巴细胞均能够对体外抗原刺激产生增殖反应,而Hsp70-NP组的增殖指数明显高于NP免疫组.细胞毒实验结果表明,LDH的释放具有效应细胞依赖性,Hsp70-NP,NP免疫组脾淋巴细胞均可以特异性杀伤靶细胞B16-N,而Hsp70-NP免疫组的杀伤率显著高于NP免疫组.实验结果显示,Hsp70可以增强NP诱导产生特异性CTL的能力.本研究结果为进一步设计基于NP的合成肽疫苗或基因疫苗提供了重要实验依据.     

内含肽介导的生物学效应及其应用

蛋白质翻译产物在成熟过程中剪切释放出来的一段氨基酸序列称为“intein”---即内含肽。它与前体蛋白以框内融合的形式共同翻译,并内嵌于前体蛋白序列中。内含肽的解离以及内含肽两侧氨基酸序列的连接是在内含肽自身催化作用下完成的。本文将从内含肽的发现、结构特征和作用机理等方面对这种具有特殊意义的蛋白质成熟机制进行较为全面的论述,同时介绍了近年来发展起来的以内含肽介导的蛋白质剪接为基础的蛋白质纯化和改造技术。     

P-糖蛋白的表达及其结合肽的筛选

为获得P 糖蛋白胞外段 ,构建了高效表达载体pGEX Pgp ,转化大肠杆菌DH5α ,进行表达、鉴定及纯化 ,以获得的融合蛋白为靶蛋白 ,筛选噬菌体随机 12肽库 ,免疫细胞化学方法进行鉴定 .SDS PAGE分析 ,表达出约 30kD大小的蛋白 ;从噬菌体随机肽库中筛选获得了与P 糖蛋白特异性结合的噬菌体阳性克隆 ,测序获得了其特异性结合肽序列 :NDGLLFTWQPSP .免疫细胞化学结果显示 :筛选得到的噬菌体阳性克隆可与耐药细胞BIU 87 ADM结合 ,而与敏感细胞BIU 87不结合 .结果表明 ,筛选获得的结合肽可与耐药的肿瘤细胞结合 ,表现出一定的肿瘤特异性 .P 糖蛋白结合肽的筛选 ,为进行人膀胱癌多药耐药的靶向治疗等工作奠定了基础 .     

康莱特注射液联合NP方案化疗治疗老年晚期非小细胞肺癌的临床观察

目的:探讨康莱特注射液联合NP方案治疗老年晚期非小细胞肺癌患者的近期疗效、毒副反应及生活质量.方法:将127例患者随机分为两组,治疗组64例,予NP方案:NVB25mg/m2第1、8天静点+DDP 80mg/m2分三天,第1,2,3天静点,每3周重复.同时给予康莱特液200ml qd第1-21天静点.对照组予NP方案:NVB25ml/m2第1、8天静点+DDP 80mg/m2分三天,第1,2,3天静点,每3周重复.两组患者在治疗4周期后,进行评价.结果:在近期疗效上,治疗组优于对照组.P＜0.05.在白细胞减少、贫血及呕吐的发生上,治疗组优于对照组,均P＜0.05.生活质量的提高及体重的增加方面,治疗组优于对照组,均P＜0.05.结论:康莱特注射液联合NP方案化疗治疗老年晚期非小细胞肺癌,能提高近期疗效,减少毒副反应,提高生活质量.