端粒酶RNA的反义cDNA对乳腺癌细胞凋亡的影响(英文)

 为了进一步探讨端粒酶RNA(hTR)的反义cDNA对乳腺癌MCF 7细胞凋亡可诱导性的影响 ,构建了能将外源基因整合至细胞基因组的整合型腺病毒载体vAd AAV ,并将hTR全长cDNA反向连接至此载体上 ,获得反义重组腺病毒vAdT AAV .vAd AAV和vAdT AAV分别感染MCF 7细胞后 ,获得两个细胞株MCF 7 vAd AAV和MCF 7 vAdT AAV ,其中MCF 7 vAdT AAV细胞基因组内整合有hTR反义cDNA并能稳定表达 .利用生存曲线、细胞形态学观察、DNA片段分析和流式细胞分析来测定NaBu和无血清DMEM诱导后细胞凋亡的反应性 .通过生存曲线 ,发现NaBu诱导的MCF 7 vAdT AAV细胞比对照组MCF 7和MCF 7 vAd AAV细胞更早出现凋亡 .电镜下 ,NaBu或去血清诱导的MCF 7 vAdT AAV细胞更早出现凋亡形态学指标 .流式细胞分析和DNA片段凝胶电泳实验均显示MCF 7 vAdT AAV细胞对凋亡的抵抗力下降 .研究结果表明 ,端粒酶RNA的反义cDNA使乳腺癌MCF 7细胞的凋亡可诱导性增强     

端粒酶反义cDNA对乳腺癌细胞损伤修复能力的影响

 利用反义核酸技术将端粒酶RNA的全长cDNA反向导入乳腺癌MCF 7细胞基因组中 .通过单细胞凝胶电泳实验发现 ,其DNA受H2 O2 损伤后的修复能力下降 .但端粒酶活性抑制为何引起其DNA损伤修复能力下降的原因尚待进一步研究 .     

端粒酶RNA的反义cDNA对乳腺癌细胞端区长度的影响

应用反义核酸技术,将端粒酶ＲＮＡ的ｃＤＮＡ反向插入整合型腺病毒载体ｐＡｄＥ１ＣＭＶＩＴＲＥＸｎｅｏ,与ｐＢ－ＨＧ１１Ｘ共转染２９３细胞反获得反义重组病毒。将此反义重组病毒感染乳腺癌细胞ＭＣＦ－７后,使细胞端区长度缩短。     

过表达外源M-CSF促进MCF7细胞增殖

为探讨过表达外源巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)对细胞增殖的影响,将重组载体 pCMV/cyto/myc-M-CSF转染MCF7细胞、G418筛选,RT-PCR、Western 印迹和免疫荧光鉴定M-CSF的mRNA表达、蛋白表达及定位,通过计算细胞倍增时间、MTT法及反义寡核苷酸抑制实验分析M-CSF对细胞增殖的影响. 结果表明,转染M-CSF的MCF7细胞过表达M-CSF-mRNA及蛋白,并且定位表达于细胞质;与转染空载体及未转染M-CSF组细胞比较,转染M-CSF的MCF7细胞倍增时间明显缩短、增殖能力显著增强,M-CSF的特异性反义寡核苷酸能抑制转染M-CSF的MCF7细胞的增殖,且抑制率随着反义寡核苷酸浓度的增高而增强;以上结果提示,胞质过表达M-CSF可促进MCF7细胞的增殖.     

MicroRNA-493抑制乳腺癌MCF7细胞增殖、迁移和成瘤能力

为了研究miR-493对乳腺癌MCF7细胞增殖、迁移和肿瘤形成能力的影响及其可能的机制,该文使用pc DNA3.1(+)/miR-493重组质粒转染MCF7细胞,通过筛选获得高表达miR-493的细胞克隆。通过荧光定量PCR检测miR-493在MCF10A和MCF7及各细胞克隆中的表达;CCK8实验检测miR-493对MCF7细胞增殖能力的影响;Transwell和划痕实验观察miR-493高表达后MCF7细胞迁移和侵袭能力的改变,软琼脂克隆形成实验以及裸鼠实验检测miR-493对MCF7细胞肿瘤形成能力的影响。软件预测miR-493可能的靶基因,并通过荧光定量PCR和Western blot进行验证。该研究证明,miR-493能够有效抑制乳腺癌MCF7细胞的增殖、迁移、浸润和肿瘤形成的能力。     

阻断VEGF旁分泌通路抑制乳腺癌血管生成与肿瘤生长

以人乳腺癌细胞株MCF 7为研究对象 ,通过构建有义与反义血管内皮生长因子 (VEGF)基因表达质粒 ,并转染MCF 7细胞 ,建立了高与低水平表达VEGF的细胞克隆。稳定转染反义VEGF表达质粒的细胞产生和分泌VEGF的能力明显下降 ,尽管在体外培养条件下细胞的增殖速度与未经转染的对照相比不是减慢而是略有增快 ,但在体内的成瘤能力、生长速度和转移能力等却明显低于未经转染的对照细胞或稳定转染有义VEGF表达质粒高水平表达VEGF的细胞克隆。通过体内电穿孔技术介导反义VEGF12 1及可溶性VEGF受体sFlk 1表达质粒转移至荷瘤鼠肿瘤组织内 ,反义VEGF12 1及sFlk 1的表达能显著抑制肿瘤的生长。研究结果证实了VEGF旁分泌通路在诱导乳腺癌肿瘤血管生成、促进肿瘤生长和转移方面起重要作用 ,阻断VEGF旁分泌通路能有效抑制乳腺癌的生长     

绿色荧光蛋白标记的人乳腺癌细胞株对化疗药物和DC/CIK治疗敏感性的研究

目的:研究绿色荧光蛋白AcGFP基因标记的人乳腺癌细胞株MCF7-pAcGFP对6种化疗药物的敏感性以及DC/CIK对其杀伤活性.方法:应用Fugene HD Transfection Reagent转染MCF-7细胞,经G418筛选获得稳定表达pAcGFP的乳腺癌细胞.采用MTT方法检测MCF7-pAcGFP细胞对6种化疗药物的敏感性以及DC/CIK对MCF7-pAcGFP细胞的杀伤活性.结果:稳定表达pAcGFP的乳腺癌细胞MCF7-pAcGFP对6种化疗药物的敏感性与未转染前相似(P>0.05),均对5-氟尿嘧啶、表柔比星和紫杉醇较为敏感;DC/CIK对MCF7细胞和MCF7-pAcGFP细胞的杀伤能力相同(P>0.05).结论:MCF7-pAcGFP细胞可代替MCF-7细胞用于抗乳腺癌药物筛选.     

反义细胞周期蛋白E真核表达载体的构建及其对体外人乳腺癌细胞的抑制作用

 为了探讨细胞周期蛋白 E(cyclin E)与人乳腺癌细胞恶性特征间的相关性 ,利用反义 RNA抑制基因表达的技术 ,构建了细胞周期蛋白 E反义 RNA的真核表达载体并转入人乳腺癌细胞中 .通过 G41 8筛选出阳性克隆 ,经 PCR和 Western印迹检测 ,确定细胞中含有重组质粒 ,并且细胞周期蛋白 E蛋白的水平明显降低 ,由此获得了反义 RNA表达载体导致的细胞周期蛋白 E表达受抑制的细胞 .细胞模型建立后 ,观察分析了细胞形态 ,细胞生长的血清依赖性以及软琼脂成集落能力 ,与对照细胞相比所发生的变化 .结果显示 ,细胞周期蛋白 E受抑制后 ,乳腺癌细胞体积变大 ,细胞生长对血清依赖性增加 ,低血清培养到第 6d时 ,细胞密度约为对照细胞的五分之一 ,细胞成集落能力也显著下降 ,软琼脂中克隆形成率下降 57% .这些变化都表明乳腺癌细胞恶性程度由于细胞周期蛋白 E表达受抑制而减弱 ,可以推测 cyclin E与乳腺癌细胞的恶性增殖及非锚定依赖性生长有着明显的关系 .     

环状GMP-AMP合成酶高表达对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响*

目的: 探讨环状GMP-AMP合成酶(cGAS)高表达对乳腺癌MCF7细胞发生上皮间质转化(EMT)的影响。方法: 构建稳定高表达cGAS的慢病毒载体并转染MCF7细胞;转染后细胞分别培养12 h,24 h,48 h,72 h,每组实验重复三次,采用MTT检测cGAS对MCF7细胞增殖的影响; transwell法检测高表达cGAS对MCF7细胞迁移能力的影响;蛋白免疫印迹(Western blot)法分析EMT相关蛋白E-cadherin和N-cadherin的表达情况。结果: 与对照组比较,cGAS上调后MCF7细胞增殖能力显著增强(P＜0.05);细胞形态学观察显示cGAS上调后诱导MCF7细胞EMT发生,细胞形态由鹅卵石样变为梭形;transwell实验结果显示,cGAS上调导致MCF7细胞迁移能力增强(P＜0.05);Western blot结果表明,cGAS上调后上皮标记蛋白E-cadherin表达下降(P＜0.05),间质标记蛋白N-cadherin表达增加(P＜0.05)。结论: cGAS上调可增强乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,诱导乳腺癌细胞EMT发生。     

hTRT反义基因转染对人结肠癌细胞生长的抑制作用

利用基因重组技术,hTRT基因反向插入真核表达载体pcDNA3．0,获得重组体pcDRTRT,通过脂质体法导入人结肠癌细胞株SW-111C,获得稳定转染细胞系,即反义细胞,该细胞易脱落,出现明显生长抑制现象;失去叠落生长能力;流式细胞仪(FCM)证实导入反义hTRT后,G0/1期细胞增加,G2M和S期细胞减少,增殖指数(PI)降低;且不能在软琼脂中形成集落;并发现反义细胞中hTRT表达水平明显下降。说明反义hTRT基因体外导入结肠在细胞株SW-111C可以明显降低端粒酶活性,抑制结肠癌细胞的生长、增殖且能使其恶性表型发生逆转。     

端粒酶RNA反义基因对肝癌细胞的影响

用RT-PCR的方法钓取端粒酶RNA基因的cDNA,并将其反向插入到逆转录病毒载体pLNCX上,构建hTR基因的反义表达质粒。将质粒经脂质体介导转染人肝癌SMMG-7721细胞中表达。结果表明hTR反义基因的表达有效地封闭或抑制肝癌细胞的端粒酶活性,抑制细胞的生长和增殖,延长细胞的倍增时间并促进细胞凋亡。     

Antisense EGFR sequence reverses the growth properties of human liver carcinoma cell line BEL-7404 in vitro

A recombinant plasmid containing a full length human epidermal growth factor receptor (EGFR) cDNA sequence in antisense orientation was transferred into cells of a human liver carcinoma cell line BEL-7404. Compared with the control cell clone JX-0 transferred with the vector plasmid and the parent BEL-7404 cells, the antisense EGFR transferred cell clone JX-1 showed a decreased EGFR gene expression and reduced significantly the growth potential either in anchorage-dependent or anchorage-independent growth. Furthermore, JX-1 cells appeared to be distinctly dependent on serum concentration for monolayer growth. The results suggested that antisense EGFR could partly block the EGFR gene expression and reverse the malignant growth properties of human liver carcinoma cells in vitro.     

Transformation of NIH 3T3 cells by enhanced PAR expression

Prostate androgen regulated (PAR) is a 1038bp novel gene located on chromosome 1 in epidermal differentiation complex. The gene is ubiquitously expressed in normal tissues and is overexpressed in most of their malignant counterparts. PAR cellular function is unknown. Here we report the effect of increased PAR expression induced by transfection of PAR cDNA on NIH3T3 cell phenotype. PAR-NIH3T3 transfectants expressing 3- to 4-fold higher PAR levels compared to controls grew faster in tissue cultures, formed colonies in soft agar, and exhibited a shortening of G1 and S phases of cell cycle and formed tumors in SCID mice. Transfection of NIH3T3 cells with increased ectopic PAR expression with a 22 mer oligonucleotide in antisense orientation with PAR mRNA abrogated their ability to form colonies in soft agar. The data presented here along with our previously reported results on DU145 cells transfected with antisense PAR cDNA suggest that PAR gene behaves like a proto-oncogene.